Summary
Un método nuevo de resonancia paramagnética electrónica (EPR), rápidos de escaneo de EPR (RS-EPR), se demuestra para la imagen espacial espectral 2D que es superior a la técnica tradicional de onda continua (CW) y abre nuevos lugares para formación de imágenes in vivo. Los resultados se demostraron a 250 MHz, pero la técnica es aplicable a cualquier frecuencia.
Abstract
Se demuestra un método superior de 2D imágenes espectrales-espacial de moléculas informadoras radicales estables a 250 MHz usando un rápido-scan de electrones paramagnético-resonancia (RS-EPR), que puede proporcionar información cuantitativa en condiciones in vivo de la concentración de oxígeno, pH, redox el estado y la concentración de moléculas de señalización (es decir, OH •, • NO). La técnica de RS-EPR tiene una sensibilidad más alta, una mejor resolución espacial (1 mm), y tiempo de adquisición más corto en comparación con la técnica estándar de onda continua (CW). Una variedad de configuraciones de trazos se han probado, con una resolución espacial que varía de 1 a 6 mm, y la anchura espectral de las moléculas informadoras que van de 16 mT (160 mg) a 5 mT (50 G). Un resonador bimodal-loop cruz desacopla de excitación y de detección, reduciendo el ruido, mientras que el efecto de exploración rápida permite un mayor poder de ser de entrada al sistema de giro antes de la saturación, el aumento de la señal de EPR. Estaconduce a una proporción sustancialmente más alta de señal a ruido que en los experimentos de CW EPR convencionales.
Introduction
En relación con otras modalidades de imagen médica, resonancia paramagnética electrónica (EPRI) es el único capaz de imagen cuantitativamente las propiedades fisiológicas incluyendo el pH 1-3, PO 2 4-7 de 8 de temperatura, la perfusión y la viabilidad de los tejidos 9, microviscosidad y la facilidad de difusión de pequeñas moléculas 10 y estrés oxidativo 11. Estimación de la facilidad de la escisión de disulfuro de glutatión (GSH) en el tejido y las células 12,13 puede informar sobre el estado redox. Para formación de imágenes in vivo, EPR en la gama de frecuencias entre 250 MHz y 1 GHz se elige debido a que estas frecuencias proporcionan suficiente profundidad de penetración en el tejido (de hasta varios cm) para generar imágenes para pequeños animales en los que las intensidades no están disminuidos por los efectos de pérdida dieléctrica. Las frecuencias más altas, tales como 9,5 GHz 14 (X-banda) y 17 GHz (K u -band) 15,16 se pueden usar para formación de imágenes de la piel y del cabello o células individuales, Respectivamente. El éxito de EPRI en todas las frecuencias depende de sondas de espín paramagnéticas que son específicos para los tejidos de modo que su ubicación y el destino pueden obtenerse imágenes.
Si el ambiente de una sonda de espín del electrón es espacialmente heterogénea, el espectro de EPR es la suma de las contribuciones de todos los lugares. Imágenes espectrales-espacial divide el volumen de la muestra en una matriz de pequeños segmentos espaciales y calcula el espectro de EPR para cada uno de estos segmentos 17. Esto permite el mapeo del entorno local mediante la medición de la variación espacial en el espectro de EPR. gradientes de campo magnético se usan para codificar la información espacial en los espectros de EPR, que se llaman proyecciones. La imagen espectral-espacial se reconstruye a partir de estas proyecciones 18,19.
En RS-EPR el campo magnético es escaneado a través de resonancia en un tiempo que es corto en relación a los tiempos de relajación espín electrónico (Figura 2) 20,21. re econvolution de la señal de rápido-scan da el espectro de absorción, que es equivalente a la primera integral del espectro de CW primero derivado convencional. La señal de rápido-scan se detecta en cuadratura, de manera que se miden ambos componentes de absorción y dispersión de la respuesta del sistema de centrifugado. Esto es esencialmente recogiendo el doble de la cantidad de datos por unidad de tiempo. La saturación de la señal en un experimento de exploración rápida que ocurre a potencias más altas que para CW, por lo potencias superiores se pueden usar sin la preocupación por la saturación. 20,22 Muchos más promedios se pueden hacer por unidad de tiempo en comparación con CW. Mayor potencia, detección de cuadratura directa y más medias por unidad de tiempo se combinan para dar una rápida exploración de una mejor relación (SNR) de señal a ruido, especialmente en una proyección de alto gradiente que definen la separación espacial, dando lugar a imágenes de mayor calidad. Para lograr aproximadamente la misma SNR para una imagen de un fantasma necesaria sobre 10 veces más largo para CW como para la rápida exploración 23.
tienda "> El aumento de la SNR también permite experimentos a 250 MHz con aductos de trampa concentración de giro bajas formadas por la reacción de OH con 5-terc-butoxicarbonil-5-metil-1-pyrroline- N-óxido (BMPO-OH), que sería invisibles para el método CW 24. Dinitroxides conectados con un enlazador disulfuro son sensibles a la escisión por el glutatión, y así pueden informar sobre el estado redox celular. existe equilibrio, depende de la concentración de glutatión presente, entre las formas di- y mono-radical. la observación de estos cambios requiere la captura de todo el amplio espectro 5 mT, y se puede lograr mucho más rápido con EPR rápida exploración en comparación con la intensificación del campo magnético en un experimento de CW.Un sistema completo de exploración rápida consiste en cuatro partes: el espectrómetro, el imán principal de campo, el conductor de la bobina de exploración rápida, y la rápida exploración de resonador de lazo cruz. El espectrómetro y la función de imán de campo principal de la misma como en un experimento de CW, estableciendo el campo Zeeman principaly la recogida de los datos de la resonador. El conductor de la bobina de exploración rápida genera la corriente senoidal de exploración que va en bobinas de escaneo rápidas especialmente diseñadas sobre la rápida exploración de circuito resonador cruz. Las bobinas de exploración rápidos en la rápida resonador de bucle transversal exploración generan un gran campo magnético homogéneo, que se barrió a frecuencias entre 3 y 15 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Configuración del controlador de escaneo rápido de la bobina a 250 MHz
- Cálculo de exploración rápida Condiciones experimentales
Nota: El parámetro más importante en RS-EPR es velocidad de barrido, α, que es el producto de la frecuencia de exploración y la anchura de escaneado (Ecuación 3). Para anchos de escaneo estrechas, se utilizan las tasas más rápido de exploración, y para anchos de barrido más amplio, se utilizan velocidades de barrido más lentas. Las siguientes instrucciones paso a través del último caso y muestran cómo llegar a los parámetros del controlador de la bobina experimentales de 7 Tm anchura de barrido y 6,8 kHz frecuencia de exploración.- Determinar el ancho de banda del resonador (BW Res).
(1)
donde v res es la frecuencia de funcionamiento del resonador y Q es el factor de calidad. Q = 90, es común para el resonador de exploración rápida utilizado para obtener los datos de resultados representativos. - Determinar la velocidad de exploración rápida, α, todoadeudado por el ancho de banda del resonador
(2) 
donde N es una constante seleccionada a menudo de forma conservadora a ser 5-6, pp? B es la anchura de línea derivado de pico a pico en mT, y a es la velocidad de barrido si T / s para una anchura de línea de Lorentz.
Nota: Un valor común para los radicales en la sección representativa es
= 0,1 mT. En comparación con la literatura de exploración rápida anterior; La ecuación 2 se deriva mediante el establecimiento de la anchura de banda de la señal (BW sig) igual a BW Res. - Determinar la máxima frecuencia de exploración rápida permitida por la velocidad.
(3) 
donde w es la anchura de la scan y f es la frecuencia de barrido. Una anchura de barrido de 7 mT cubrirá 100% del espectro para las sondas actuales utilizados in vivo. Utilice este valor y el tipo de cambio calculado (Ecuación 2) para determinar la frecuencia de barrido.
- Determinar el ancho de banda del resonador (BW Res).
- La selección de los condensadores de ajuste y puesta a punto del conductor de la bobina de exploración rápida
Nota: El controlador de la bobina de exploración rápida normalmente se ejecuta en un modo con resonancia generar una onda sinusoidal. La resonancia ocurre a una frecuencia de exploración donde las reactancias inductivas y capacitivas son de magnitud y opuestas signos iguales, de modo que la reactancia total es cercano a cero.- Determinar la capacidad adecuada para la frecuencia determinada en 1.1.3 usando la inductancia, L, de las bobinas de exploración rápidas y (Ecuación 4).
- Divida C TOT a partir de (Ecuación 4) por la mitad para obtener los valores de condensadores para cada lado de la caja del condensador conductor de la bobina.
Nota: El conductor de la bobina de exploración rápida tiene dos amplificadores. Al seleccionar un condensador, la caja del condensador tiene que ser equilibrada con una capacitancia igual a cada lado de la caja. Las dos partes están en serie. - Desenroscar la tapa superior de la caja del condensador condensadores e insertar en ambos lados que son iguales al valor determinado en el paso 1.2.2.
- Vuelva a colocar la tapa de la caja del condensador y el tornillo hacia abajo para asegurarse de que permanece encendida.
- Utilizando el panel frontal del controlador de la bobina con resonancia, ajustar la frecuencia de salida hasta que la forma de onda sinusoidal tiene la amplitud máxima.
- Determinar la capacidad adecuada para la frecuencia determinada en 1.1.3 usando la inductancia, L, de las bobinas de exploración rápidas y (Ecuación 4).
(1) 
(2) 
= 0,1 mT. En comparación con la literatura de exploración rápida anterior; La ecuación 2 se deriva mediante el establecimiento de la anchura de banda de la señal (BW sig) igual a BW Res. 
(3) 
2. Preparación de los reactivos y Phantoms
- Preparación de radiCAL
- Retire 15 N-PDT del congelador y deje el recipiente a la temperatura ambiente (10-15 min).
- Pesar 1,4 mg de 15 N-PDT utilizando una balanza analítica.
- Añadir 1,4 mg de 15 N-PDT a 15 (DI) H 2 O ml desionizada, para una concentración final de 0,5 mM.
Nota: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) (1- 15 N 3,3,5,5- 2 H 4,) piperdinyloxyl metil-1- (N-15 PDT), 4- 1 H-3-carbamoil-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) y 3-carboxi-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metil-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pirrolidiniloxi (15 N-PROXYL) 25 () radicales Figura 1E-G tienen estabilidad a largo plazo (2 años) en solución acuosa y a temperatura ambiente. Sus formas sólidas se suelen almacenar en un congelador o refrigerador para mantener estos radicales estables durante años.La estabilidad de los radicales nitróxido en general los hacen no tóxico, y su preparación se puede hacer en una mesa de trabajo normal cuando el disolvente es agua. Cuando se utilizan disolventes orgánicos, preparar soluciones nitróxido dentro de una campana de humos, mientras que cuenta con el equipo adecuado de protección personal (EPP).
- Preparación de pH sensible radicales tritilo
- Pesar 0,7 mg de radical metilo triarilo (ATAM 4) 26 radicales (1.400 g / mol) y se disuelven en 200 l de etanol absoluto.
- Pesar 0,00681 g de KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) y se disuelven en 50 ml de agua DI para una concentración final de 1 mM.
- Pesar 2,8 g de KOH (56 g / mol) y se disuelven en 50 ml de agua DI para una concentración final de 1 M.
- Añadir KOH gota a gota a la solución tampón de fosfato (2.2.2) para ajustar el pH de 7,0.
- Añadir 800 l de tampón de fosfato 1 mM y los 200 l de ATAM 4 en etanol absoluto para una concentración finalentration de 0,5 mM en tampón de 80:20: etanol.
- Repita los pasos 2.2.1-2.2.5 para crear la muestra 4 ATAM a pH = 7,2.
- Coloque la ATAM 4, pH = 7,0 y 4 ATAM, pH = 7,2 en tubos de muestra de cuarzo separadas 6 mm.
- Coloque los dos tubos de cuarzo EPR 6 mm en un tubo de cuarzo EPR 16 mm, con un espesor de espuma de poliestireno spacer 2 mm en el medio.
Nota: Las paredes del tubo de muestras de cuarzo son de 0,5 mm de grosor, y además de la 2 mm spacer producir una separación de 3 mm entre las muestras ATAM. Los radicales tritilo sensibles al pH utilizados se sintetizaron en la Universidad del Estado de Ohio 26. El ejemplo que se utilizó para la imagen se llama ATAM 4. La reacción que da cuenta de la sensibilidad al pH se muestra en la Figura 1A.
- Generación de BMPO-OH
- Pesar 680 mg de KH 2 PO 4 y disolver en 100 ml de agua DI para una concentración final de 50 mM.
- Añadir 1 M de KOH gota a gotaa la solución tampón de fosfato a pH = 7,3.
- Pesar 50 mg de BMPO (199,25 g / mol).
- Combinar el 50 mg de BMPO con 5 ml de tampón de fosfato en un tubo de cuarzo de irradiación 16 mm.
- Añadir 100 l de peróxido de hidrógeno 300 mM.
- Irradiar la mezcla en el tubo de la irradiación de cuarzo 16 mm con una lámpara de presión media 450 W UV durante 5 min.
- Usando una pipeta de transferencia de vidrio, transferir 2,5 ml de la solución irradiada BMPO-OH fuera del tubo de cuarzo y la irradiación en un lado de un tubo de muestra de cuarzo 16 mm con 3 mm divisor.
- Transferir el restante 2,5 ml de irradiado BMPO-OH en el otro lado del tubo de muestra de cuarzo 16 mm con 3 mm divisor.
- Preparación de dinitroxide radical
- Pesar 24,7 mg de 2 H, dinitroxide 15 N-disulfuro (Figura 1C) en 1 ml de DMSO para una solución madre de 47,5 mM.
- Preparar tampón Tris 10 mM y ajustar el pH a 7,2.
- tomar 40l dinitroxide solución madre y se diluye con tampón Tris a una concentración final de 1 mM.
- Coloque 250 l de solución de dinitroxide en tampón en un tubo de muestra de cuarzo 16 mm con un 10 mm divisor en el centro.
- Pesar 154 mg de glutatión y añadir a 5 ml de tampón Tris para una concentración final de 100 mM.
- Añadir 5 l de la solución de glutatión 100 mM a 250 l de solución de dinitroxide 1 mM en un lado de la 10 mm divisor para convertir el dirradical en monorradical.
- Preparación de nitróxido nitronil
- Retire el radical del congelador y deje el recipiente a la temperatura ambiente (10-15 min).
- Pesar 1,9 mg de nitronil (390 g / mol).
- Pesar 0,56 mg de KOH y se disuelve en 10 ml de agua DI para una concentración final de 1 mM.
- Mezclar el 1,9 mg de nitronil en 10 ml de solución de KOH 1 mM para una concentración final de 0,5 mM nitronil.
Nota: Si necessary, utilice un vórtice o aparato de ultrasonidos para la solvatación velocidad del nitronil.
3. Configuración del Instrumento rápido de escaneado a 250 MHz
Nota: sintonización del resonador con una muestra acuosa de radical nitróxido, que tiene un efecto similar sobre resonador Q y puesta a punto como solución tampón, es una buena manera de configurar para la muestra a ser fotografiado
- Sintonizar el resonador con una muestra acuosa de radicales nitróxido.
- Inserte los 15 ml de 0,5 mM 15 N-PDT en la muestra de agua en un tubo de cuarzo de 16 mm EPR.
- Insertar el tubo de cuarzo en el lado de detección del bucle transversal del resonador RS-EPR.
- Cambiar la frecuencia de la fuente de instrumento hasta que coincida con la frecuencia de la banda de detección que contiene la muestra. cambiar manualmente la frecuencia portadora de la fuente 250 MHz introduciendo el valor deseado en el software.
- Cambiar la frecuencia de la banda de excitación para que coincida con los frequencias de la fuente experimento y el lado de detección del resonador. Cambiar la frecuencia de la banda de excitación girando un condensador variable dentro de la cavidad del resonador de acuerdo con el protocolo del fabricante.
- Configurar Instrumento de consola y imán principal
- Encienda el espectrómetro y elegir un experimento que registra los datos transitorios con el tiempo en las abscisas.
- Dentro del software, establecer el número de puntos a 65.536, y la base de tiempo de 10 ns.
- Establecer el número de promedios de 10.000 para una señal fuerte o estrecho, y 45,000 para una señal ancha o débil.
- Presione el botón "participar" en el software para enviar los parámetros experimentales desde el software de la consola y energizar el principal imán de campo.
- Establecer el campo magnético principal de 9 mt.
- Ajuste la perilla de atenuación de potencia de 50 dB, y encender el amplificador de alta potencia 7 W.
4. EjecuciónExperimento de Rapid Scan
Nota: Las instrucciones específicas relacionadas con el análisis de los fantasmas que contienen BMPO-OH 24, pH radicales TAM sensibles 19,27 y dinitroxides sensibles redox 28 se proporcionan en la literatura.
- Saturación de poder de la muestra estándar nitróxido
Nota: Es conveniente hacer una curva de saturación de la energía en una muestra radical nitróxido estándar en las mismas condiciones experimentales que se utilizarán para mirar a los radicales sensibles al pH o el estado redox.- Encienda el conductor de la bobina de exploración rápida, con los valores de la Sección 1 (frecuencia de exploración de 6,8 kHz y el ancho de barrido de 7 millones de toneladas).
- A partir de 50 dB, recoger un espectro de exploración rápida con 100k promedios. Disminuir la atenuación de 3 dB y repetir la medición. Continuar hasta que un ajuste del atenuador de 0 dB, o durante el tiempo que la medición de aislamiento en la lectura del puente es <0.
- transferencia tque los datos de exploración rápidos en bruto en un programa de deconvolución (por ejemplo escrito en Matlab) y procesar los datos en bruto en el espectro de absorción.
- Introduzca la frecuencia de exploración, anchura de barrido, el número de puntos y base de tiempo en el programa, y ejecutar el programa para procesar la señal de exploración rápida en bruto en una señal de absorción.
- Trazar la amplitud de la señal de absorción como una función de la potencia de raíz cuadrada (en vatios) incidente sobre el resonador. En el régimen no saturante, la amplitud es linealmente dependiente de la raíz cuadrada de la potencia incidente.
- Montar una línea de tendencia a partir de 0,0 e incluir todos los puntos de datos que caen en la región de respuesta lineal. En la región de respuesta lineal, amplitud de la señal incrementos proporcionales a la raíz cuadrada de la potencia de microondas.
- Extrapolar esta tendencia a poderes superiores, y comparar la intensidad de la señal de EPR. Usa el poder más elevado para el cual la amplitud de la señal no se desvía más de un 3% desde la línea de tendencia extrapolada. en order para la deconvolución de la señal de exploración rápida para que funcione correctamente, la señal debe estar todavía en la región de respuesta lineal con respecto a la potencia incidente.
Nota: La transferencia de los datos escaneados rápidos primas puede realizarse a través de una conexión de red oa través de la impulsión del pulgar. En este caso la transmisión es necesaria porque el programa para procesar los datos en bruto (Matlab) no es en el mismo equipo que tiene software de recogida de datos. El algoritmo de deconvolución que procesa los datos en bruto se describe en 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El producto del experimento es un conjunto de proyecciones que se reconstruyen en imágenes de dos dimensiones (una espectral, uno espacial) con una escala de colores falsa para representar amplitud de la señal. azul profundo indica la línea de base, donde está presente ninguna señal, el verde es baja amplitud y rojo es más alta. Rebanadas lo largo del eje x (dimensión espectral) representan la señal de EPR (transición EPR) en un eje de campo magnético. A lo largo del eje y (dimensión espacial), la separación entre las señales corresponde a la separación espacial física entre las muestras en los resonadores.
La Figura 3 muestra una comparación de dos imágenes, adquiridos con CW (Figura 3B) o RS (figura 3A) de un fantasma con tres diferentes tipos de 15 N radicales nitróxido sustituidos (Figura 3D). La señal más amplio corresponde a 15 N-PROXYL, un pirrol de cinco miembrosanillo idine con una carga negativa a pH fisiológico, lo que podría ayudar a orientar la molécula a compartimentos celulares específicos. La señal de doblete pertenece a 15 N-mHCTPO y es el resultado de un solo hidrógeno en medio de deuteración de otra manera completa. Esta sola división ha sido optimizado para monitorear los cambios en la concentración de oxígeno 30. La señal más estrecho proviene de 15 N-PDT, un anillo de piperidina flexible que está completamente deuterado. Puede ser utilizado para monitorear la concentración de oxígeno, o el medio ambiente redox (reducción de la estructura conduce a la disminución de la señal EPR).
Por el mismo tiempo de adquisición de 5-min, la imagen RS muestra una resolución espacial superior y la claridad del patrón espectral para cada radical. Una de las razones para la mejora de RS más de CW se puede ver mediante la comparación de los espectros en dos concentraciones diferentes de gradiente entre las dos técnicas (Figura 3C). A medida que aumenta la fuerza de gradientela señal espectral se amplía. una considerable degradación del espectro CW bajo los altos gradientes (1 Tm / cm) que codifican la información espacial.
Debido a una señal derivado amplía más rápidamente que una señal de absorción, la SNR para el más alto de proyección CW gradiente (trazo rojo) es muy pobre en comparación con la de la proyección del gradiente RS más alto (traza azul). Ancho de línea como una función de posición espacial se puede extraer de una parcela 2D. Anchura de línea será amplia o estrecha basada en cambios en la concentración de oxígeno o la viscosidad de la sonda de nitróxido. El fantasma reflejado en la figura 3A fue a temperatura ambiente y abierto al aire. Dado que el contenido de oxígeno y la viscosidad (como se determina por la temperatura) se mantuvo constante, la anchura de línea de cada sonda debe ser constante a través de la anchura de cada tubo que contiene un radical. La Figura 4 muestra la dispersión en anchuras de línea se ajusta de rebanadas a través de la imagen en 2D en comparaciónque el verdadero valor de anchura de línea (negro línea horizontal). Los valores de corte de imagen, especialmente para el 15-N PDT, son una mejor coincidencia con el verdadero valor de anchura de línea para RS (Figura 4A) que para CW (Figura 4B). Esto también es una consecuencia de la SNR mejorada de RS sobre la técnica de CW.
Otra ventaja de la técnica de RS es la capacidad de generar barridos de campo magnéticos homogéneos de ancho en un tiempo muy corto. Una frecuencia de exploración típica para los experimentos a 250 MHz es de 9 kHz, correspondiente a 0,11 ms. Esta es 0.11 ms si el barrido de campo es de 0,5 mT o 5,0 mT. Compare esto con CW, donde un barrido de 5.0 mT se llevará a decenas de segundos a minutos. Con la rápida exploración se hace posible recoger rápidamente el 100% de la información espectral en tiempos que son susceptibles de imágenes in vivo.
La Figura 5 demuestran espectro RS-EPR ancho imaging aplica a girar modelos de captura. Importantes moléculas de señalización, como el OH • y • NO son radicales libres endógenos con tiempos de vida muy cortos. Con el fin de estudiar estas moléculas, se utilizan "atrapadores". Un ejemplo de la reacción de giro trampa 31 (BMPO) con OH • se muestra en la Figura 1B. Obtención de imágenes de un fantasma que contiene 5 mM aducto BMPO-OH se muestra en la Figura 5 (A, B). La señal de aducto de spin-trampa es dependiente de la concentración de partida de OH • y tiene una vida media de 30 minutos lo que permite el estudio de los procesos que generan OH •. El nitoxide nitronil 32 se utilizó como otro ejemplo de formación de imágenes de amplio espectro, pero se ha utilizado en el pasado para spin-atrapamiento de NO • 33,34. Obtención de imágenes de un fantasma que contiene nitronil se muestra en la Figura 5 (C, D). para spen trampas, captura todo el espectro permite una mejor designación de las especies de radicales transitorios original que se presente.
La sensibilidad a los cambios fisiológicos como el pH y redox de estado se deriva de cambios en todo el espectro. La figura 6 muestra imágenes con ATAM 4. En la Figura 6B, el perfil de ATAM 4 a pH = 7,0 (azul) tiene muchas características espectrales, y un trozo de la imagen coincide bien con el correspondiente espectro de gradiente cero (verde). Compare esto con el perfil de ATAM 4 a pH = 7,4, la figura 6C, con menos características espectrales y todavía en buen acuerdo con el correspondiente espectro de gradiente cero. Obtención de imágenes de fantasmas que contienen del dinitroxide en su dimérica, y la reducción de forma monomérica se muestran en la Figura 7. Los dos espectros diferentes son generados por escisión de un disulfuro (SS), y así transmiten la sensibilidad a redox environment 1,35.
Figura 1. sondas EPR son sensibles a muchos cambios fisiológicos. (A) Un ejemplo de los radicales sensibles al pH tri-aril-metilo (TAM) 26. (B) trampa de spin BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) El nitronil. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El rápido escanear EPR tiene inherentemente mejor SNR. (A) In CW EPR la h amplitud es una pequeña fracción de la señal total, determinado por la modulación de campo magnético. (B) En la exploración rápida directa detectado, se detecta la amplitud de la señal completa. La señal de aumento de ruido es evidente en el experimento en el superóxido generado por E. faecalis es atrapado con BMPO en banda X. Por el mismo tiempo de adquisición de 30 segundos, casi ninguna señal es observable en el espectro de onda continua (C), mientras que se observa una fuerte señal en el espectro de exploración rápida (D) 36. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Mejora de la SNR permite una mejor resolución espacial. Por el mismo tiempo de adquisición de 5 minutos, la imagen RS (
Figura 4. El contenido de la información de una imagen de exploración rápida es superior a la de CW. (A) Rebanadas de la imagen de 2D RS. (B) Las rebanadas de la imagen 2D CW. La verdadera anchura de línea (negro línea horizontal) de cada muestra se muestran a título comparativo. Véase la referencia 23. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. campo rápido barrido permite la captura de todo un espectro en unos pocos segundos. (A) 2D imagen espectral-espacial de un fantasma que consta de aducto BMPO-OH. (B) Una simulación ajuste al espectro BMPO-OH-gradiente cero a 250 MHz se utiliza para ajustar la imagen BMPO-OH inicial y distinguir entre las regiones que contienen BMPO-OH y regiones de ruido que contiene. (C) radical 14 N nitronil que puede ser utilizado para la captura de óxido nítrico in vivo. (D) Las rebanadas a través de cada espectro muestran la forma espectral a 250 MHz. Véase la referencia 19. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Ninguna parte del espectro se deja fuera, lo que permite un mejor seguimiento de los cambios espectrales fisiológicamente inducidos. Espectral imagen-espacial (A) 2D de un fantasma que consiste en dos tubos de pH sensible ATAM 4 radical. (B) el perfil espectral de ATAM 4 a pH = 7,0 (azul) y el espectro del gradiente cero correspondiente (verde). (C) el perfil espectral de ATAM 4 a pH = 7,4 B (azul) y el cero del espectro del gradiente correspondiente (verde). Véanse las referencias 19,26,37. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 7. Barrido rápido abre la puerta a la vigilancia redox in vivo a 250 MHz. imágenes espectrales y espaciales (A) 2D de 15 N-dinitroxide. (B) Las rebanadas a través de la parte superior (traza azul) e inferior (línea roja) compartimentos en las dos imágenes. (C) El compartimiento superior sigue siendo el mismo, pero el compartimento inferior se ha reducido con glutatión. (D) de sector a través de cada objeto de la imagen que muestra el cambio en el espectro 1D de la parte inferior del compartimento. Ver referencias 1,28,35. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
señales de rápido-scan tienen componentes de frecuencia más altas que CW, y requieren un ancho de banda de resonador más grande dependiendo de anchuras de línea, tiempos de relajación, y la velocidad de los rápidos-scan. El ancho de banda necesario para un experimento dado se basa en la anchura de línea y la velocidad de barrido del campo magnético (Ecuación 2). En función de los tiempos de relajación de la sonda en estudio (T 2 y T 2 *), y la velocidad de barrido, las oscilaciones pueden aparecer en el borde de salida de la señal. Para los radicales nitróxido con T 2 ~ 500 ns a 250 MHz (57ª Conferencia de las Montañas Rocosas de Resonancia Magnética, Epel, B, et al., 2015), factores de ciclo experimentales a menudo no son lo suficientemente alto como para observar cualquier oscilación.
El ancho de banda experimental está típicamente limitado por el ancho de banda del resonador. Cada medio ciclo de un experimento de exploración rápida se graba con disminución o el aumento de campo / frecuencia, por lo que el ancho de banda experimental es ½ tque resonador ancho de banda, como se muestra en (ecuación 1). Si el ancho de banda experimental está limitada por la elección de los parámetros de tal manera que es mayor que el ancho de banda del resonador y las oscilaciones son amortiguadas, ampliando resultados en la línea deconvolved. Puesto que el ancho de banda experimento se determina por la velocidad y la anchura de línea del radical que se estudia, la comprensión de estas características es un componente clave del experimento de exploración rápida.
El protocolo actual demuestra EPRI a 250 MHz de fantasmas que contienen sondas sensibles al oxígeno, viscosidad, pH, endógena transitorios moléculas de señalización (es decir, OH •, • NO) y el estado redox. Resoluciones espaciales entre 1 y 3 mm se han demostrado, con tiempos de adquisición experimentales entre 29 segundos (una sola línea de un 2 línea 15 N espectro, figura 3) y 15 minutos (espectro completo de 5 M BMPO-OH, Figura 5). el desarrollo de métodos con los espectáculos fantasmasuso de imágenes RS-EPR sustituye a la técnica de imagen CW-EPR convencional 23,24, y abre nuevas vías para la formación de imágenes in vivo utilizando sondas EPR.
EPRI es ventajosa sobre otras técnicas de imagen in vivo basados en fluorescencia o fosforescencia, como sondas EPR son sensibles a una variedad más amplia de los fenómenos en vivo. Además, la penetración de RF a 250 MHz es ~ 7 cm, por lo que el tejido anómalo en un nivel más profundo se puede estudiar. La resonancia magnética nuclear (RMN) proporciona mapas anatómicos muy detalladas, pero se esfuerza por proporcionar información cuantitativa fisiológica. Una combinación de MRI y EPRI podría un resultado días en una versión totalmente de resonancia magnética de un positrón-emisión de positrones (PET) / tomografía computarizada (CT) del escáner. Dicho instrumento proporcionar el mismo beneficio de PET / CT, pero sin las dosis de radiación pesados o caros de radio trazadores.
El desarrollo del método de fantasmas continúa empujando tque limita de RS-EPR, pero el objetivo final es poner en práctica la técnica en los laboratorios que utilizan modelos animales. tendrán que ser mejorado para acelerar la recopilación de datos para un experimento de 4D (3 espacial, 1 dimensión espectral) Los cálculos para las reconstrucciones de imágenes. Un algoritmo mejorado se está desarrollando actualmente y es esencial para las aplicaciones in vivo, sin embargo, la prueba de principio se puede hacer con las imágenes 2D.
Muchos de los radicales, tales como N-15 PDT, utilizados en fantasmas se degradan rápidamente en condiciones in vivo con una vida media de sólo 60 segundos. Radicales con una resistencia mejorada a la reducción in vivo 39 Se han sintetizado y son importantes para la construcción de grandes concentraciones suficientemente in vivo. La sensibilidad mejorada de RS-EPR sobre CW-EPR 24 será otro de los beneficios en la solución de este problema. La sensibilidad de la rápida exploración es actualmente 5 M durante un fantasma, y entre 100 micras y 5 mm, dependiendola sonda para formar una imagen, por los estudios con animales se realizan en la Universidad de Chicago (comunicación personal, Maggio, M., 2015). El método RS continuará siendo desarrollado para cerrar esta brecha, pero la solicitud ya ha comenzado a moverse en efectivo en aplicaciones in vivo (57ª Conferencia de las Montañas Rocosas de Resonancia Magnética, Epel, B, et al., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Apoyo parcial de esta obra por el NIH subvenciones NIBIB EB002807 y CA177744 (GRE y SSE) y EB002034 P41 a GRE, Howard J. Halpern, PI, y por la Universidad de Denver se agradece. Marcos Tseytlin fue apoyado por el NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Los autores agradecen a Valery Khramtsov, ahora en la Universidad de Virginia Occidental, y Illirian Dhimitruka en la Universidad Estatal de Ohio para la síntesis de los pH radicales TAM sensibles, y para Gerald Rosen y Joseph Kao en la Universidad de Maryland para la síntesis de la mHCTPO , PROXYL, BMPO y radicales nitronil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) | CDN Isotopes | M-2327 | 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada |
| 4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29 |
| 3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25 |
| 4 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | 707-SQ-100M | |
| 4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) | CDN Isotopes | D-2328 | 98% atom D, Quebec Canada |
| pH sensitive trityl radical (aTAM4) | Ohio State University | N/A | Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26 |
| Potassum Phosphate, Monobasic | J.T. Baker Chemicals | 1-3246 | |
| 6 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-5M-6M-0-250/RB | |
| 8 mm Quartz EPR Tubes | Wilmad Glass | Q-7M-8M-0-250/RB | |
| 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) | N/A | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30 |
| Hydrogen Peroxide | Sigma Aldrich | H1009 SIGMA | 30% |
| 16 mm Quartz EPR tube | Wilmad Glass | 16-7PP-11QTZ | |
| Medium Pressure 450 W UV lamp | Hanovia | 679-A36 | Fairfield, NJ |
| L-Glutathione, reduced | Sigma Aldrich | G470-5 | |
| Nitronyl | NA | N/A | Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31 |
| Sodium Hydroxide | J.T. Baker Chemicals | 1-3146 |
References
- Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
- Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
- Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I.
- Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
- Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
- Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
- Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
- Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
- Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
- Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
- Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
- Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
- Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
- Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
- Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
- Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
- Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
- Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
- Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
- Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
- Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
- Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
- Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
- Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
- Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
- Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
- Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
- Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
- Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
- Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
- Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
- Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
- Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
- Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
- Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
- Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
- Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
- Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
- Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).
