Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

Een methode nieuwe elektronen paramagnetische resonantie (EPR), een snelle scan EPR (RS-EPR), is aangetoond voor 2D spectrale ruimtelijke beeldvorming die superieur is aan de traditionele continue golf (CW) techniek en opent nieuwe locaties voor in vivo beeldvorming. Resultaten worden gedemonstreerd op 250 MHz, maar de techniek is toepasbaar bij een bepaalde frequentie.

Abstract

We tonen een superieure methode van 2D spectrale en ruimtelijke beeldvorming van stabiele radicaal reporter moleculen aan 250 MHz met behulp van rapid-scan elektronen-paramagnetische-resonantie (RS-EPR), die kwantitatieve informatie kunnen verschaffen onder in vivo omstandigheden op zuurstofconcentratie, pH, redox status en de concentratie van signaalmoleculen (dat wil zeggen, OH •, NO •). De RS-EPR techniek heeft een hogere gevoeligheid, een betere ruimtelijke resolutie (1 mm) en kortere acquisitietijd in vergelijking met de standaard continue golf (CW) techniek. Verschillende fantoom configuraties zijn getest met ruimtelijke resolutie variërend van 1 tot 6 mm en spectrale breedte van de reporter moleculen varieert van 16 pT (160 mg) teneinde 5 mT (50 G). Een cross-loop bimodale resonator ontkoppelt excitatie en detectie, het verminderen van het lawaai, terwijl de snelle scan effect zorgt voor meer macht om input voor de spin-systeem voor verzadiging, het verhogen van de EPR-signaal. Dezeleidt tot een aanzienlijk hogere signaal-ruisverhouding dan bij gebruikelijke CW EPR experimenten.

Introduction

Ten opzichte van andere medische beeldvormende technieken, elektronen paramagnetische resonantie imaging (EPRI) is bij uitstek in staat om beeld kwantitatief fysiologische eigenschappen, waaronder pH 1-3, PO 04-07 februari, temperatuur 8, perfusie en levensvatbaarheid van de weefsels 9, microviscositeit en het gemak van de verspreiding van kleine moleculen 10 en 11 oxidatieve stress. Schatting van het gemak van disulfide splitsing door glutathion (GSH) in het weefsel en cellen 12,13 kunnen rapporteren over redox status. Voor in vivo beeldvorming, EPR in het frequentiegebied tussen de 250 MHz en 1 GHz is gekozen omdat deze frequenties voldoende diepte van penetratie (tot enkele cm) om beelden voor kleine dieren waarbij intensiteiten niet worden verminderd door diëlektrische effecten genereren. Hogere frequenties, zoals 9,5 GHz 14 (X-band) en 17 GHz (K u -band) 15,16 kan worden gebruikt voor beeldvorming van huid en haar of enkele cellenRespectievelijk. Het succes van EPRI bij alle frequenties afhankelijk paramagnetische rotatie probes die specifiek zijn voor weefsels zodat hun locatie en het lot kan worden afgebeeld zijn.

Als de omgeving van een elektronenspin probe is ruimtelijk heterogeen, de EPR-spectrum is de som van de bijdragen van alle locaties. Spectrale en ruimtelijke beeldvorming verdeelt volume monster in een array van kleine ruimtelijke segmenten en berekent de EPR spectrum voor elk van deze segmenten 17. Hierdoor kan in kaart brengen van de lokale omgeving door meting van de ruimtelijke variatie in de EPR-spectrum. Magnetische veldgradiënten worden gebruikt om ruimtelijke informatie in EPR-spectra, die uitsteeksels genoemd coderen. Het beeld spectrale en ruimtelijke wordt gereconstrueerd uit deze projecties 18,19.

RS-EPR het magneetveld wordt afgetast door middel van resonantie in een tijd die kort is ten opzichte van electron spin-relaxatietijden (figuur 2) 20,21. D econvolution de snelle-aftastsignaal geeft het absorptiespectrum, wat overeenkomt met de eerste integraal van de conventionele eerste afgeleide spectrum CW. De snelle scan-signaal gedetecteerd in kwadratuur, zodat zowel absorptie en dispersie componenten van het spinsysteem respons gemeten. Dit is hoofdzakelijk het verzamelen tweemaal de hoeveelheid data per tijdseenheid. Verzadiging van het signaal in een snelle scan experiment gebeurt bij hogere vermogens dan CW, zodat hogere krachten kunnen worden gebruikt zonder zorg voor verzadiging. 20,22 Veel meer kan gemiddelden per tijdseenheid worden uitgevoerd in vergelijking met CW. Hoger vermogen, kwadratuurdetektie en gemiddelden per tijdseenheid combineren om een ​​snelle scan een betere signaal-ruisverhouding (SNR), vooral bij hoge gradiënt projecties die ruimtelijke scheiding definiëren, waardoor beelden met hogere kwaliteit. Bereiken ongeveer dezelfde SNR voor een afbeelding van een fantoom vereist ongeveer 10 keer zo lang voor CW als snelle scan 23.

tent "> De verhoogde SNR laat ook experimenten bij 250 MHz met lage concentratie rotatie houden adducten gevormd door de reactie van OH met 5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline- N-oxide (BMPO-OH) middelen die zijn onzichtbaar voor de CW methode 24. Dinitroxides verbonden met een disulfide linker gevoelig voor splitsing door glutathion, en dus kunnen over cellulaire redox status. Equilibrium bestaat, afhankelijk van de concentratie van glutathion aanwezig tussen de di- en mono-groep vormen. het observeren van deze veranderingen vereist vangst van de gehele 5 mT breed spectrum, en kan veel sneller worden bereikt met een snelle scan EPR in vergelijking met de intensivering van het magnetische veld in een CW experiment.

Een compleet snelle scan systeem bestaat uit vier delen: de spectrometer, het hoofdveld magneet, de snelle scan coil driver, en de snelle scan cross-lus resonator. De spectrometer en het hoofdveld magneet werken op dezelfde als in een CW experiment, waarin het belangrijkste gebied Zeemanen die de gegevens van de resonator. De snelle scan spoel driver genereert de sinusvormige scan stroom die gaat in speciaal ontworpen snelle scan spoelen van de snelle scan cross-lus resonator. De snelle scan spoelen van de snelle scan cross-lus resonator genereren grote homogeen magnetisch veld, dat wordt doorlopen bij frequenties tussen 3 en 15 kHz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Instelling van het Rapid Scan Coil Driver bij 250 MHz

  1. Berekening van Rapid Scan experimentele omstandigheden
    Opmerking: De belangrijkste parameter in RS-EPR is scansnelheid, α, die het product van scanfrequentie en scanbreedte (vergelijking 3). Voor smalle scan breedtes, sneller scan gehanteerde tarieven, en voor een bredere veegbreedtes, zijn langzamer scansnelheden gebruikt. De volgende instructies stap voor stap door het laatste geval en laten zien hoe om te komen tot de experimentele spoel bestuurder parameters van 7 mT sweep breedte en 6,8 kHz scan frequentie.
    1. Bepaal de resonator bandbreedte (BW Res).
      vergelijking 1 (1)
      waarin v res de werkfrequentie van de resonator en Q de kwaliteitsfactor. Q = 90, is gebruikelijk voor de snelle scan resonator gebruikt om de gegevens in Representatieve resultaten te verkrijgen.
    2. Bepaal de snelle scan rate, α, alleverschuldigd door de resonator bandbreedte vergelijking 2 (2)
      vergelijking 3

      waarin N een constante vaak conservatief zijn geselecteerd 5-6, pp AB is de piek-tot-piek derivaat lijnbreedte in mT, en is de scansnelheid als T / s voor een Lorentz lijnbreedte.
      Opmerking: Een gemeenschappelijke waarde voor de radicalen in de representatieve sectie is vergelijking 4 = 0,1 mT. In vergelijking met eerdere snelle scan literatuur; Vergelijking 2 wordt afgeleid door het instellen van het signaal bandbreedte (BW sig) gelijk aan BW Res.
    3. Bepaal de maximale snelle scan frequentie toegestaan ​​door de prijs.
      vergelijking 5 (3)
      vergelijking 6
      waarbij w de breedte van SCAn en f de scanfrequentie. Een sweepbreedte van 7 mT dekt 100% van het spectrum voor de huidige gebruikte probes in vivo. Met deze waarde en de berekende koers (Vergelijking 2) aan de scanfrequentie bepalen.
      vergelijking 7
  2. Selectie van afstemcondensatoren en tuning van de snelle scan coil driver
    Opmerking: De snelle scan coil driver is meestal uitgevoerd in een geresoneerde mode genereren van een sinusvormige golf. Resonantie treedt op met een aftastfrequentie waarbij de inductieve en capacitieve reactanties zijn even groot en tegengesteld teken, zodat de totale reactantie dichtbij nul.
    1. Bepaal de juiste capaciteit voor de frequentie bepaald 1.1.3 met de inductantie L, de snelle scan spoelen en (Vergelijking 4).
      vergelijking 8
      vergelijking 9
    2. Verdeel C TOT uit (Vergelijking 4) in de helft van de condensator waarden te verkrijgen voor elke zijde van de spoelaandrijfeenheid condensatorkast.
      vergelijking 10
      vergelijking 11
      Opmerking: De snelle scan coil driver heeft twee versterkers. Bij het selecteren van een condensator, de condensator vak moet worden afgewogen met een gelijke capaciteit aan weerszijden van de doos. De twee partijen in serie.
    3. Schroef de bovenkap van de condensator doos en steek condensatoren aan beide kanten die gelijk is aan de bepaald in stap 1.2.2 waarde zijn.
    4. Vervang de bovenkant van de condensator doos en schroef het naar beneden om ervoor te zorgen dat blijft branden.
    5. Met behulp van het voorpaneel van de geresoneerde coil driver, past de uitgangsfrequentie totdat de sinusvormige golfvorm heeft de maximale amplitude.

2. Voorbereiding van de reagentia en Phantoms

  1. Bereiding van radicals
    1. Verwijderen 15 N-PDT uit de vriezer en laat de houder tot kamertemperatuur (10-15 min) komen.
    2. Weeg 1,4 mg van 15 N-PDT met behulp van een analytische balans.
    3. Voeg 1,4 mg 15 N-PDT tot 15 ml gedeïoniseerd (DI) H 2 O voor een eindconcentratie van 0,5 mM.
      Opmerking: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) methyl-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra (2 H 3) methyl-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) en 3-carboxy-2,2,5,5-tetra (2 3 H) methyl-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxy (15 N-PROXYL) 25 (Figuur 1E-G) radicalen langetermijnstabiliteit (2 jaar) in waterige oplossing en op kamertemperatuur. Hun vaste vormen worden meestal opgeslagen in een vriezer of koelkast om deze radicalen stabiel te houden voor de komende jaren.De stabiliteit van nitroxide radicalen hen algemeen niet-toxisch te maken en hun bereiding kan worden uitgevoerd op een normale benchtop wanneer het oplosmiddel water. Bij het gebruik van organische oplosmiddelen, voor te bereiden nitroxide oplossingen in een zuurkast, terwijl uitgerust met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM).
  2. Bereiding van pH-gevoelige trityl groepen
    1. Weeg 0,7 mg triaryl methylgroep (Atam 4) 26 radicale (1400 g / mol) en los op in 200 pi absolute ethanol.
    2. Weeg 0,00681 g KH 2PO 4 (136,1 g / mol) en los op in 50 ml gedeïoniseerd water om een uiteindelijke concentratie van 1 mM.
    3. Weeg 2,8 g KOH (56 g / mol) en los op in 50 ml DI water voor een uiteindelijke concentratie van 1 M.
    4. Voeg KOH druppelsgewijs aan fosfaatbuffer (2.2.2) om de pH van 7,0 aan te passen.
    5. Voeg 800 gl 1 mM fosfaatbuffer en 200 gl Atam 4 in absolute ethanol gedurende een eindconcentration van 0,5 mM in buffer 80:20: ethanol.
    6. Herhaal de stappen 2.2.1-2.2.5 naar de Atam 4 monster bij pH = 7,2 te creëren.
    7. Plaats de Atam 4, pH = 7,0 en Atam 4, pH = 7,2 in afzonderlijke 6 mm kwarts monsterbuizen.
    8. Plaats beide 6 mm kwarts EPR buizen in een 16 mm kwarts EPR buis, met een 2 mm dik Styrofoam spacer in tussen.
      Opmerking: De wanden van de monsterbuis kwarts zijn 0,5 mm dik en naast de 2 mm afstandhouder op een 3 mm scheiding tussen de Atam monsters. De pH-gevoelige trityl radicalen gebruikt werden gesynthetiseerd aan de Ohio State University 26. Het voorbeeld dat werd gebruikt voor de beeldvorming wordt Atam 4. De reactie die goed is voor de pH gevoeligheid is getoond in Figuur 1A.
  3. Genereren van BMPO-OH
    1. Weeg 680 mg KH 2 PO 4 en los op in 100 ml gedeïoniseerd water om een eindconcentratie van 50 mM.
    2. Voeg 1 M KOH druppelsgewijsde fosfaatbuffer pH = 7,3.
    3. Weeg 50 mg BMPO (199,25 g / mol).
    4. Combineer de 50 mg BMPO met 5 ml fosfaatbuffer in een 16 mm kwarts buis bestraling.
    5. Voeg 100 ul van 300 mM waterstofperoxide.
    6. Bestralen van het mengsel in de 16 mm buis kwarts bestraling met een 450 W middendruk UV lamp gedurende 5 min.
    7. Met een glazen pipet overdracht, overdracht 2,5 ml bestraalde BMPO-OH oplossing uit kwarts straling buis en in een zijde van een 16 mm kwarts monsterbuis met 3 mm divider.
    8. Draagt ​​de resterende 2,5 ml bestraalde BMPO-OH in de andere zijde van de 16 mm kwarts monsterbuis met 3 mm divider.
  4. Voorbereiding van de dinitroxide radicale
    1. Weeg 24,7 mg 2 H, N-15 disulfide dinitroxide (figuur 1C) in 1 ml DMSO een voorraadoplossing van 47,5 mM.
    2. Bereid 10 mM Tris buffer op pH 7,2.
    3. Take 40dinitroxide pl voorraadoplossing en verdund met Tris-buffer tot een eindconcentratie van 1 mM.
    4. Plaats 250 pl dinitroxide oplossing in buffer in een 16 mm kwarts monsterbuis met een 10 mm verdeler in het midden.
    5. Weeg 154 mg glutathion en voeg 5 ml Tris-buffer voor een eindconcentratie van 100 mM.
    6. Voeg 5 ul van 100 mM glutathion oplossing van 250 gl 1 mM dinitroxide oplossing aan één zijde van de 10 mm deler de tweewaardige groep zetten in eenwaardige.
  5. Bereiding van nitronyl nitroxide
    1. Verwijder de rest uit de vriezer en laat de houder tot kamertemperatuur (10-15 min) komen.
    2. Weeg 1,9 mg nitronyl (390 g / mol).
    3. Weeg 0,56 mg KOH en los op in 10 ml gedeïoniseerd water om een ​​uiteindelijke concentratie van 1 mM.
    4. Meng de 1,9 mg nitronyl in 10 ml 1 mM KOH voor een uiteindelijke concentratie van 0,5 mM nitronyl.
      Let op: Als necessary, gebruik dan een vortexer of ultrasoonapparaat om de snelheid solvatatie van de nitronyl.

3. Instellen van de Rapid Scan Instrument op 250 MHz

Let op: Het opzetten van de resonator met een waterig monster van nitroxide radicalen, die een vergelijkbaar effect op resonator Q en tuning als buffer oplossing heeft, is een goede manier op te zetten voor de steekproef af te beelden

  1. Tunen van de resonator met een waterige monster van nitroxide radicaal.
    1. Steek de 15 ml van 0,5 mm 15 N-PDT in water monster in een 16 mm kwarts EPR buis.
    2. Steek de kwartsbuis in de detectie kant van de cross-loop RS-EPR resonator.
    3. Verander de frequentie van het elektrisch instrument totdat deze overeenkomt met de frequentie van de detectiekant dat het monster bevat. Verander het draaggolffrequentie van de 250 MHz-bron door de gewenste waarde in software.
    4. Verander de frequentie van de excitatiezijde de frequen overeenkomenties van het experiment source en detectie zijde van de resonator. Verander de frequentie van de excitatiezijde door aan een variabele condensator in de resonatorruimte volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Opzetten Instrument Console en Main Magnet
    1. Zet de spectrometer en kies een experiment die van voorbijgaande data registreert met de tijd op de abscis.
    2. Binnen de software stelt u het aantal punten tot 65.536 en de tijdbasis tot 10 nanoseconden.
    3. Stel het aantal gemiddelden 10.000 een sterk signaal of smal, en 45.000 voor een breed of zwak signaal.
    4. Druk op de knop "deelnemen" in de software om de experimentele parameters van de software om de console te sturen en energie het hoofdveld magneet.
    5. Zet de belangrijkste magnetische veld om 9 mT.
    6. Stel de kracht demping knop tot 50 dB, en zet de 7 W high power versterker.

4. UitvoeringRapid Scan Experiment

Noot: Specifieke instructies met betrekking tot analyse van fantomen die BMPO OH-24, pH-gevoelige TAM radicalen 19,27 en redox gevoelige dinitroxides 28 worden in de literatuur.

  1. Macht verzadiging van standaard nitroxide monster
    Opmerking: Het is voordelig om een ​​stroom verzadigingscurve doen op een standaard nitroxideradicaal monster onder dezelfde experimentele condities die worden gebruikt om te kijken naar radicalen gevoelig voor pH of redox status.
    1. Zet de snelle scan coil driver, met de waarden uit artikel 1 (scan frequentie van 6,8 kHz en scan breedte van 7 mT).
    2. Vanaf 50 dB, het verzamelen van een snelle scan spectrum met 100k gemiddelden. Verlaag de demping van 3 dB en herhaal de meting. Voortgezet tot een verzwakker instelling van 0 dB of zolang de isolatie meting aan de brug uitlezing <0.
    3. Transfer tHij ruwe snelle scan gegevens in een deconvolutie-programma (bijvoorbeeld geschreven in Matlab) en het verwerken van de ruwe data in de absorptie spectrum.
    4. Voer de scan frequentie, sweep breedte, het aantal punten en tijdbasis in het programma, en start het programma om de ruwe snelle scan signaal in een absorptie signaal te verwerken.
    5. Zet de amplitude van de absorptie als functie van de vierkantswortel vermogen (in Watt) invalt op de resonator. In de niet-verzadigende regime, de amplitude lineair afhankelijk van de vierkantswortel van de invallende energie.
    6. Monteer een trendlijn vanaf 0,0 en omvatten alle gegevens punten die in de lineaire respons regio vallen. In de lineaire respons regio signaalamplitude toeneemt evenredig aan de vierkantswortel microgolfvermogen.
    7. Extrapoleren deze trend naar hogere machten, en vergelijk de EPR signaal intensiteit. Gebruik de hoogste macht, waarvoor de signaalamplitude niet wordt afgeweken meer dan 3% ten opzichte van de geëxtrapoleerde trendlijn. in order de deconvolutie van de snelle scan signaal werkt alleen goed als het signaal nog steeds in de lineaire respons regio ten opzichte van invallend vermogen.
      Opmerking: Overdracht van de ruwe snelle scangegevens kan worden gedaan via een netwerkverbinding of via een USB-stick. In dit geval is de overdracht noodzakelijk omdat het programma ruwe gegevens te verwerken (Matlab) niet op dezelfde computer die gegevensverzameling software. De deconvolutie algoritme dat ruwe data verwerkt wordt beschreven in 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het product van het experiment is een set uitsteeksels die in twee-dimensionale (één spectraal, een ruimtelijke) beelden worden gereconstrueerd met een valse kleur schaal signaalamplitude vertegenwoordigen. Diepblauwe geeft basislijn, waar geen signaal aanwezig is, groen is laag amplitude en rood is de hoogste. Segmenten langs de x-as (spectrale dimensie) tonen het signaal EPR (EPR transitie) op een magnetisch veld as. Langs de y-as (ruimtelijke dimensie), scheiding tussen signalen komt overeen met de ruimtelijke scheiding tussen monsters in de resonatoren.

Figuur 3 toont een vergelijking van twee beelden, verkregen met CW (figuur 3B) of RS (figuur 3A) van een fantoom met drie verschillende 15 N gesubstitueerde nitroxide radicalen (figuur 3D). De breedste signaal komt overeen met 15 N-PROXYL, een vijf lid pyrrolidine ring met een negatieve lading bij fysiologische pH, die zouden kunnen helpen richten het molecuul specifieke cellulaire compartimenten. Het doublet signaal behoort tot 15N mHCTPO en is het resultaat van één waterstof temidden anders volledig deuterering. Deze ene splitsing is geoptimaliseerd voor veranderingen in zuurstofconcentratie 30 volgen. De smalste signaal komt van 15 N-PDT, een flexibele piperidinering die volledig gedeutereerd. Het kan worden gebruikt om de zuurstofconcentratie of redox milieu monitor (vermindering van de structuur leidt tot afname EPR signaal).

Om dezelfde 5-min acquisitietijd, beeld RS toont superieure ruimtelijke resolutie en helderheid van de spectrale patroon voor elke rest. Een reden voor de verbetering van RS via CW kan worden gezien door vergelijking van spectra op twee verschillende gradiënten tussen de twee technieken (Figuur 3C). Aangezien het verloop krachttoenamesde spectrale signaal wordt verbreed. Aanzienlijke afbraak van de CW spectrum onder de hoge gradiënten (1 mT / cm) dat ruimtelijke gegevens coderen.

Omdat een afgeleide signaal sneller verbreedt dan een absorptie signaal, de SNR van de hoogste gradiënt CW uitsteeksel (rood sporen) is zeer slecht in vergelijking met dat van de hoogste gradiënt RS uitsteeksel (blauw spoor). Lijnbreedte als functie van de ruimtelijke positie kan worden gewonnen uit een 2D plot. Lijnbreedte zal breed of smal gebaseerd op veranderingen in zuurstof- concentratie of viscositeit rond de nitroxide probe. Het fantoom afgebeeld in figuur 3A werd bij kamertemperatuur aan de lucht. Aangezien zuurstofgehalte en viscositeit (zoals bepaald door temperatuur) stabiel gebleven, moet de lijnbreedte van elke probe constant over de breedte van elke buis bevattende een radicaal. Figuur 4 toont de spreiding in lijnbreedten passen van segmenten via 2D beeld vergelekenom de ware linewidth waarde (zwarte horizontale lijn). Het beeld slice waarden, in het bijzonder voor de 15 N-PDT, zijn beter af te stemmen op de werkelijke lijnbreedte waarde voor RS (Figuur 4A) dan voor CW (Figuur 4B). Dit is ook een gevolg van de verbeterde SNR RS via CW techniek.

Een ander voordeel van de RS techniek is de mogelijkheid om grote magnetische veld homogeen sweeps genereren in een zeer korte tijd. Een typische scanfrequentie voor experimenten bij 250 MHz 9 kHz, overeenkomend met 0,11 msec. Dit is 0,11 msec of het veld sweep 0,5 mT of 5,0 mT. Vergelijk dit met CW, waarbij een 5,0 mT sweep tientallen seconden zal nemen om minuten. Met de snelle scan wordt het mogelijk om 100% van de spectrale informatie snel verzamelen tijden die vatbaar zijn voor in vivo beeldvorming zijn.

Figuur 5 tonen breed spectrum RS-EPR imaging toegepast op trapping modellen draaien. Belangrijke signaalmoleculen, zoals OH • en NO • zijn endogene vrije radicalen met een zeer korte levensduur. Teneinde deze moleculen te bestuderen, worden "rotatie traps" gebruikt. Een voorbeeld van de reactie van spin trap 31 (BMPO) met OH • is weergegeven in Figuur 1B. Beeldvorming van een fantoom met 5 uM BMPO OH-adduct wordt getoond in Figuur 5 (A, B). De spin-trap adduct signaal afhankelijk van de uitgangsconcentratie van OH • en heeft een halfwaardetijd van 30 minuten waardoor onderzoek van elke processen die genereren OH •. De nitronyl nitoxide 32 werd gebruikt als een voorbeeld van breed spectrum beeldvorming, maar is in het verleden gebruikt voor spin trapping van NO • 33,34. Beeldvorming van een fantoom met nitronyl wordt getoond in figuur 5 (C, D). voor spin vallen, die de gehele spectrum zorgt voor een betere aanduiding van de oorspronkelijke voorbijgaande radicalen die aanwezig was.

Gevoeligheid voor fysiologische veranderingen zoals pH en redox status wordt afgeleid uit veranderingen in het gehele spectrum. Figuur 6 toont beeldvorming Atam 4. In figuur 6B, het profiel van Atam 4 bij pH = 7,0 (blauw) heeft veel spectrale kenmerken, en een segment van het beeld past goed bij de overeenkomstige nul gradiënt spectrum (groen). Dit vergelijken met het profiel van Atam 4 bij pH = 7,4, figuur 6C, met minder spectrale kenmerken en nog steeds in goede overeenstemming met de overeenkomstige zonder verval spectrum. Beeldvorming fantomen die van de dinitroxide in de dimere en monomere gereduceerde vorm getoond in figuur 7. De twee verschillende spectra gegenereerd door splitsing van een disulfide (SS), en dus gevoeligheid voor env redox brengenironment 1,35.

Figuur 1
Figuur 1. EPR sondes zijn gevoelig voor verschillende fysiologische veranderingen. (A) Een voorbeeld van de pH-gevoelige tri-aryl-methyl (TAM) 26 groepen. (B) Spin val BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) De nitronyl. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Snelle scan EPR is inherent beter SNR. (A) In CW EPR de amplitude h is een kleine fractie van het totale signaal, bepaald door het magnetisch veld modulatie. (B) In direct gedetecteerd snelle scan, wordt de volledige amplitude gedetecteerd. De signaalruisverhouding toename blijkt uit het experiment waarbij superoxide gegenereerd door E. faecalis is gevangen met BMPO op X-band. Om dezelfde 30 sec acquisitie tijd, bijna geen signaal is waarneembaar in de CW spectrum (C), terwijl een sterk signaal wordt waargenomen in de snelle scan spectrum (D) 36. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3. Verbeterde SNR zorgt voor een betere ruimtelijke resolutie. Om dezelfde 5 minuten acquisitie tijd, imago van de RS ( (B). (C) Er is een goede overeenkomst tussen projecties verworven met een snelle scan (blauw) en CW (rood) wanneer er geen gradiënt aanwezig is (0 mT / cm) (D). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. De informatie-inhoud van een snelle beeld scan is hoger dan voor CW. (A) Plakken van de 2D-afbeelding RS. (B) Plakken van de 2D-afbeelding CW. De ware linewidth (zwarte horizontale lijn) van elk monster wordt ter vergelijking getoond. Zie referentie 23. Klik hier om bekijk een grotere versie van dit cijfer.

figuur 5
Figuur 5. Rapid veld vegen maakt vangst van een hele spectrum in enkele seconden. (A) 2D spectrale en ruimtelijke afbeelding van een fantoom bestaande uit BMPO OH-adduct. (B) Een simulatie geschikt om de nul-gradiënt BMPO OH-spectrum bij 250 MHz werd gebruikt om de oorspronkelijke afbeelding BMPO-OH passen en onderscheiden gebieden die BMPO-OH en ruis bevattende gebieden. (C) 14 N nitronyl rest die kan worden gebruikt voor het vangen van stikstofmonoxide in vivo. (D) Plakken door elk spectrum tonen de spectrale vorm bij 250 MHz. Zie referentie 19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figuur 6
Figuur 6. Geen enkel deel van het spectrum wordt weggelaten, waardoor een betere controle van de fysiologisch geïnduceerde spectrale veranderingen. Beeld (A) 2D spectrale en ruimtelijke van een fantoom, bestaande uit twee buizen van de pH-gevoelige Atam 4 radicaal. (B) Spectral profiel van Atam 4 bij pH = 7,0 (blauw) en de overeenkomstige nul gradiënt spectrum (groen). (C) spectrale profiel van Atam 4 bij pH = 7,4 B (blauw) en de overeenkomstige nul-gradiënt spectrum (groen). Zie referenties 19,26,37. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 7
Figuur 7. Rapid scan opent de deur voor in vivo redox mbt 250 MHz. (A) 2D spectrale en ruimtelijke beelden van 15 N-dinitroxide. (B) Plakken via de bovenkant (blauw trace) en onderste (rode sporen) compartimenten in de twee beelden. (C) Het bovenste compartiment blijft hetzelfde, maar het onderste compartiment is gereduceerd met glutathion. (D) segment door elke objectbeeld die de verandering van de 1D spectrum van het onderste compartiment. Zie referenties 1,28,35. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rapid-aftastsignalen hogere frequentiecomponenten dan CW, en vereisen een grotere bandbreedte resonator afhankelijk lijnbreedten, relaxatietijd en de snelheid van de snelle-scans. Die bandbreedte voor een gegeven experiment is gebaseerd op de lijnbreedte en de scansnelheid van het magnetische veld (Vergelijking 2). Afhankelijk van de relaxatietijden van de sonde bestudeerde (T2 en 2 *) en de scansnelheid, kunnen oscillaties op de achterflank van het signaal. Voor nitroxide radicalen met T 2 ~ 500 ns bij 250 MHz (57e Rocky Mountain conferentie over Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015), experimentele scan prijzen zijn vaak niet hoog genoeg om eventuele trillingen te observeren.

De experimentele bandbreedte wordt typisch beperkt door de resonator bandbreedte. Elke halve cyclus van een snelle scan experiment opgenomen met ofwel verlagen of verhogen veld / frequentie, zodat de experimentele bandbreedte ½ tHij resonator bandbreedte, zoals in (vergelijking 1). Indien de experimentele bandbreedte beperkt door de keuze van de parameters zodanig dat deze groter is dan resonator bandbreedte en trillingen gedempt Uitbreiding resultaten in de deconvolved lijn. Aangezien het experiment bandbreedte wordt bepaald door de snelheid en de lijnbreedte van de groep onderzochte, begrip van deze kenmerken is een belangrijke component van de snelle scan experiment.

Het huidige protocol toont EPRI bij 250 MHz van fantomen probes zuurstofgevoelige, viscositeit, pH, voorbijgaande endogene signaalmoleculen (dwz OH •, • NO) en redox status. Ruimtelijke resoluties tussen 1 en 3 mm zijn aangetoond, experimentele opnametijden tussen 29 seconden (enkele lijn van een lijn 2 15 N spectrum, figuur 3) en 15 minuten (volle breedte van 5 uM BMPO-OH, figuur 5). Methode ontwikkeling met de fantomen showsgebruik van RS-EPR beelden vervangt de conventionele CW-EPR beeldvormingstechniek 23,24, en opent nieuwe wegen voor in vivo beeldvorming met behulp van EPR sondes.

EPRI is voordelig ten opzichte van andere in vivo beeldvorming technieken op basis van fluorescentie of fosforescentie, zoals EPR sondes gevoelig zijn voor een grotere verscheidenheid aan in vivo verschijnselen. Bovendien RF penetratie bij 250 MHz ~ 7 cm, zodat abnormaal weefsel op een dieper niveau worden bestudeerd. Nucleaire magnetische resonantie beeldvorming (MRI) levert zeer gedetailleerde anatomische kaarten, maar worstelt om kwantitatieve fysiologische informatie te verstrekken. Een combinatie van MRI en EPRI een dag kunnen leiden tot een volledig magnetische resonantie versie van een positron-emissie-tomografie (PET) / computertomografie (CT) scanner. Een dergelijk instrument zou hetzelfde voordeel van PET / CT bieden, maar zonder de zware stralingsdoses of dure radio-tracers.

Methode ontwikkeling met fantomen blijft duwen thij beperkt RS-EPR, maar het uiteindelijke doel is de techniek laboratoria die diermodellen voeren. Berekeningen voor het reconstructies zal verbeterd moeten worden om het verzamelen van gegevens te versnellen voor een 4D-experiment (3 ruimtelijke, 1 spectrale dimensie). Een verbeterd algoritme is in ontwikkeling en is essentieel voor in vivo toepassingen, maar het bewijs van principe kan worden uitgevoerd met 2D beeldvorming.

Veel groepen, zoals 15 N-PDT, gebruikt fantomen breken snel onder in vivo omstandigheden met halfwaardetijden van slechts 60 seconden. Radicalen met een verbeterde resistentie tegen in vivo vermindering 39 zijn gesynthetiseerd en zijn belangrijk voor de opbouw groot genoeg concentraties in vivo. De verbeterde gevoeligheid van de RS-EPR op CW-EPR 24 zal een ander voordeel bij het oplossen van dit probleem. De gevoeligheid van de snelle scan nog 5 uM voor een fantoom, en tussen 100 uM en 5 mM, afhankelijkde probe af te beelden, voor dierstudies wordt uitgevoerd aan de University of Chicago (persoonlijke communicatie, Maggio, M., 2015). De RS methode zal verder worden ontwikkeld om deze kloof te dichten, maar de toepassing is al begonnen om te verhuizen naar de werkelijke in vivo-toepassingen (57e Rocky Mountain conferentie over Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Gedeeltelijke ondersteuning van dit werk door de NIH subsidies NIBIB EB002807 en CA177744 (GRE en SSE) en P41 EB002034 om GRE, Howard J. Halpern, PI, en door de Universiteit van Denver is dankbaar erkend. Mark Tseytlin werd ondersteund door NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. De auteurs zijn dankbaar Valery Khramtsov, nu aan de Universiteit van West Virginia, en Illirian Dhimitruka aan de Ohio State University voor de synthese van de pH-gevoelige TAM radicalen, en Gerald Rosen en Joseph Kao aan de Universiteit van Maryland voor de synthese van de mHCTPO , PROXYL, BMPO en nitronyl radicalen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Bioengineering elektronen paramagnetische resonantie (EPR) een snelle scan nitroxide, 250 MHz pH zuurstofconcentratie redox status signaalmoleculen biofysica
Rapid Scan Electron Paramagnetische Resonantie opent nieuwe wegen voor Imaging Fysiologisch belangrijke parameters<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, J. R., Mitchell, D. G.,… More

Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter