Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Snabb Scan elektronspinnresonans öppnar nya vägar för Imaging fysiologiskt viktiga parametrar Published: September 26, 2016 doi: 10.3791/54068
Automatic Translation
1,2, 1, 3,4, 1, 5, 6, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Denver, 2Magnetic Imaging Group, Applied Physics Division, Physical Measurements Laboratory, National Institute of Standards and Technology, 3Department of Radiology, Geisel School of Medicine, Dartmouth University, 4Department of Biochemistry, West Virginia University, 5Department of Electrical and Computer Engineering, University of Denver, 6Department of Engineering, University of Denver

Summary

En ny elektronspinnresonans (EPR) metoden, snabba scan EPR (RS-EPR), visas för 2D spektral rumslig avbildning som är överlägsen den traditionella kontinuerlig våg (CW) teknik och öppnar nya arenor för in vivo imaging. Resultaten visas vid 250 MHz, men tekniken är tillämplig vid alla frekvenser.

Abstract

Vi visar en överlägsen metod för 2D spektral-spatial avbildning av stabila radikala reportermolekyler vid 250 MHz med användning av snabb-scan elektronpara-resonans (RS-EPR), som kan ge kvantitativ information under in vivo förhållanden på syrehalt, pH, redox status och koncentration av signalmolekyler (dvs OH •, NO •). RS-EPR teknik har en högre känslighet, förbättrad rumslig upplösning (1 mm), och kortare förvärvstid i jämförelse med standard kontinuerlig våg (CW) teknik. En mängd olika fantom konfigurationer har testats, med rumslig upplösning varierar från 1 till 6 mm, och spektral bredd på de reportermolekyler som sträcker sig från 16 | jT (160 mg) till 5 mT (50 G). En tvär slinga bimodal resonator frikopplar excitation och detektion, minska buller, medan den snabba scannings effekt ger mer kraft att matas till spinnsystemet före mättnad, vilket ökar EPR-signalen. Dettaleder till en väsentligt högre signal-till-brusförhållande än i konventionella CW EPR experiment.

Introduction

I förhållande till andra medicinska avbildningsmetoder, elektronspinnresonans imaging (EPRI) är en unik möjlighet att kvantitativt bild fysiologiska egenskaper inklusive pH 1-3, PO2 4-7 temperatur 8, perfusion och livskraft vävnader 9, microviscosity och enkel diffusion av små molekyler 10 och oxidativ stress 11. Uppskattningen av den enkla disulfid klyvning av glutation (GSH) i vävnader och celler 12,13 kan rapportera om redox status. För in vivo avbildning, är EPR i frekvensområdet mellan 250 MHz och 1 GHz valts eftersom dessa frekvenser ge tillräckligt djup av vävnadspenetration (upp till flera cm) för att generera bilder för små djur i vilka intensiteter inte minskade med dielektriska förlusteffekter. Högre frekvenser, såsom 9,5 GHz 14 (X-bandet) och 17 GHz (K u -Band) 15,16 kan användas för avbildning av hud och hår eller enstaka celler, Respektive. Framgången för EPRI på alla frekvenser beror på paramagnetiska spin-sonder som är specifika för vävnaderna så att deras placering och öde kan avbildas.

Om miljön av en elektronspinnsonden är spatialt heterogen, är EPR spektrum summan av bidragen från alla platser. Spectral-spatial avbildning delar provets volym i en rad små rumsliga segment och beräknar EPR spektrum för vart och ett av dessa segment 17. Detta medger mappning av den lokala miljön genom att mäta den rumsliga variationen i EPR-spektrum. Magnetfältgradienter används för att koda rumslig information i EPR-spektra, som kallas prognoser. Spektral-spatial bild rekonstrueras från dessa projektioner 18,19.

I RS-EPR magnetfältet avsöks genom resonans i en tid som är kort i förhållande till elektronspinnrelaxationstider (Figur 2) 20,21. D econvolution av den snabba-avsökningssignalen ger absorptionsspektrumet, som är ekvivalent med den första integralen av den konventionella första-derivata CW spektrum. Den snabba-avsökningssignalen detekteras i kvadratur, så att både absorptions- och spridnings komponenter i spinnsystemsvaret mäts. Detta är i huvudsak samla dubbelt så mycket data per tidsenhet. Mättnad av signalen i en snabb skanning experiment händer vid högre effekter än för CW, så högre effekter kan användas utan bekymmer för mättnad. 20,22 Många fler medelvärden kan göras per tidsenhet i jämförelse med CW. Högre effekt, direkt kvadratur upptäckt och fler genomsnitt per tidsenhet kombineras för att ge en snabb skanning en bättre signal-brusförhållande (SNR), särskilt vid höga lutning prognoser som definierar rumslig separation, vilket leder till högre bildkvalitet. För att uppnå ungefär samma SNR för en bild av en fantom krävs ungefär 10 gånger så lång tid för CW som för snabb skanning 23.

tält "> Den ökade SNR tillåter också experiment vid 250 MHz med låga koncentration spin trap addukter bildade genom omsättning av OH med 5-tert-butoxikarbonyl-5-metyl-1-pyrroline--N-oxid (BMPO-OH) som skulle vara osynliga för CW-metoden 24. Dinitroxides samband med en disulfid-länk är känsliga för klyvning av glutation, och så kan rapportera om cellulära redox status. Jämvikt existerar, beroende på koncentrationen av glutation närvarande mellan di- och mono-radikal former. observera dessa förändringar kräver infångning av hela 5 mT brett spektrum, och kan uppnås mycket snabbare med snabb avsökning EPR jämfört med steg magnetfältet i en CW experiment.

Ett komplett snabb scan-systemet består av fyra delar: spektrometern, huvudområdet magnet, den snabba scannings spole, och den snabba skanningen tvär slinga resonator. Spektrometern och huvudområdet magnetfunktion på samma sätt som i en CW experiment, att ställa in huvud Zeeman fältoch samla in data från resonatorn. Den snabba skanningen spole alstrar sinus scan ström som går in i specialdesignade snabba skannings spolar på snabb skanning tvär slinga resonator. Den snabba skannings spolar på den snabba skanningen tvär slinga resonator generera ett stort homogent magnetfält, som sveps vid frekvenser mellan 3 och 15 kHz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Inställning av Rapid Scan Coil Driver på 250 MHz

  1. Beräkning av Rapid Scan Experimentella förhållanden
    Obs: Den viktigaste parametern i RS-EPR är avsökningshastighet, α, som är produkten av avsökningsfrekvens och avsökningsbredd (ekvation 3). För smala scan bredder är snabbare svephastigheter används, och för bredare svepbredder, är långsammare skanningshastighet används. Följande instruktioner stega igenom det senare fallet och visar hur man kan komma fram till de experimentella spole förar parametrar 7 mT svepbredd och 6,8 kHz skanningsfrekvens.
    1. Bestämma resonatorn bandbredden (BW Res).
      ekvation 1 (1)
      där v res är arbetsfrekvensen hos resonatorn och Q är kvalitetsfaktorn. Q = 90, är ​​vanligt för den snabba scannings resonator som används för att erhålla data i Representativa resultat.
    2. Bestämma den snabba avsökningshastighet, α, allaskyldig av resonator bandbredd ekvation 2 (2)
      ekvation 3

      där N är en konstant ofta konservativt utvalda för att vara 5-6, är Ab pp topp-till-topp-derivat linjebredd i mT, och en är den svephastighet om T / s för en Lorentzlinjebredd.
      Obs: Ett vanligt värde för radikaler i representativ sektion är ekvation 4 = 0,1 mT. I jämförelse med tidigare snabb skanning litteratur; Ekvation 2 härleds genom att ställa in signalbandbredden (BW sig) lika med BW Res.
    3. Bestäm högsta snabba scanningsfrekvens tillåts av hastigheten.
      ekvation 5 (3)
      ekvation 6
      där w är bredden på scan och f är skanningsfrekvensen. En svepbredd av 7 mT kommer att täcka 100% av spektrumet för strömprober används in vivo. Använd detta värde och den kurs som beräknas i (ekvation 2) för att bestämma skanningsfrekvensen.
      ekvation 7
  2. Val av avstämningskondensatorer och avstämning av snabb skanning spole
    Obs: Den snabba skanningen spole är typiskt körs i en svängning läge genererar en sinusformad våg. Resonans uppstår vid en avsökningsfrekvens, där de induktiva och kapacitiva reaktanser är av lika magnitud och motsatta tecken, så att den totala reaktansen är nära noll.
    1. Bestäm rätt kapacitans för frekvens bestämd i 1.1.3 med användning av induktansen, L, av den snabba scanningspolarna och (ekvation 4).
      ekvation 8
      ekvation 9
    2. Dividera C TOT från (Ekvation 4) på mitten för att få de kondensatorvärden för varje sida av spolen föraren kondensatorn box.
      ekvation 10
      ekvation 11
      Obs: Den snabba skanningen spiral föraren har två förstärkare. När du väljer en kondensator, måste kondensatorn rutan måste balanseras med en lika stor kapacitans på vardera sidan av lådan. De två sidorna är i serie.
    3. Skruva locket på kondensatorn låda och sätta kondensatorer på båda sidor som är lika med värdet bestäms i steg 1.2.2.
    4. Byt toppen av kondensatorn lådan och skruva fast så att den stannar på.
    5. Med hjälp av frontpanelen på svängning lindningsdrivdon, justera utfrekvensen tills sinusformad vågform har den maximala amplituden.

2. Beredning av reagenser och Phantoms

  1. Framställning av radicals
    1. Ta bort 15 N-PDT från frysen och låt behållaren att komma till rumstemperatur (10 till 15 min).
    2. Väg upp 1,4 mg av 15 N-PDT med användning av en analytisk balans.
    3. Lägg 1,4 mg 15 N-PDT till 15 ml avjoniserat (DI) H2O för en slutkoncentration av 0,5 mM.
      Obs: 4-oxo-2,2,6,6-tetra (2 H 3) metyl-1- (3,3,5,5- 2 H 4, 1- 15 N) piperdinyloxyl (15 N-PDT), 4- 1 H-3-karbamoyl-2,2,5,5-tetra (2 H 3) metyl-3-pyrrolinyloxyl (15 N-mHCTPO) och 3-karboxi-2,2,5,5-tetra (2 H3) metyl-1- (3,4,4- 2 H 3, 1- 15 N) pyrrolidinyloxi (15 N-PROXYL) 25 (figur 1E-G) radikalerna har långtidsstabilitet (2 år) i vattenlösning och vid rumstemperatur. Deras fasta former lagras vanligtvis i en frys eller kylskåp för att hålla dessa radikaler stabil i flera år.Stabiliteten hos nitroxid-radikaler i allmänhet göra dem icke-toxiska, och deras framställning kan ske på en vanlig benchtop när lösningsmedlet är vatten. Vid användning av organiska lösningsmedel, förbereda nitroxid lösningar i ett dragskåp medan utrustade med rätt personlig skyddsutrustning (PPE).
  2. Framställning av pH-känsliga tritylgrupper radikaler
    1. Väg upp 0,7 mg av triaryl metylradikal (aTAM 4) 26 radikalen (1400 g / mol) och lös i 200 pl absolut etanol.
    2. Väg 0,00681 g KH 2 PO 4 (136,1 g / mol) och lös upp i 50 ml avjoniserat vatten för en slutlig koncentration av 1 mM.
    3. Väg 2,8 g KOH (56 g / mol) och lös upp i 50 ml avjoniserat vatten för en slutlig koncentration av 1 M.
    4. Lägga KOH släppa klokt att fosfatbufferten (2.2.2) för att justera pH av 7,0.
    5. Tillsätt 800 | il av 1 mM fosfatbuffert och de 200 pl aTAM 4 i absolut etanol för en slutlig koncentration av 0,5 mM i 80:20 buffert: etanol.
    6. Upprepa steg 2.2.1-2.2.5 för att skapa den aTAM fyra provet vid pH = 7,2.
    7. Placera aTAM 4, pH = 7,0 och aTAM 4, pH = 7,2 i separata 6 mm kvarts provrör.
    8. Placera båda 6 mm kvarts EPR-rör in i en 16 mm kvarts EPR rör, med en 2 mm tjock Styrofoam spacer däremellan.
      Notera: Väggarna är gjorda av kvartsprovröret är 0,5 mm tjockt, och i tillägg till den 2 mm spacer ge en 3 mm separation mellan aTAM proverna. De pH-känsliga tritylgrupper radikaler används syntetiserades vid Ohio State University 26. Exemplet som användes för avbildning kallas aTAM 4. Reaktionen som svarar för den pH-känslighet visas i figur 1A.
  3. Generering av BMPO-OH
    1. Väg upp 680 mg KH 2 PO 4 och lös upp i 100 ml avjoniserat vatten för en slutlig koncentration av 50 mM.
    2. Tillsätt 1 M KOH droppe klokttill fosfatbuffert till pH = 7,3.
    3. Väg upp 50 mg av BMPO (199,25 g / mol).
    4. Kombinera 50 mg BMPO med 5 ml fosfatbuffert i en 16 mm kvarts bestrålning rör.
    5. Tillsätt 100 pl av 300 mM väteperoxid.
    6. Bestråla blandningen i 16 mm kvarts bestrålning rör med en medelhögt tryck 450 W UV-lampa i 5 min.
    7. Användning av en glas överföringspipett, överför 2,5 ml av bestrålat BMPO-OH-lösning ut ur kvarts bestrålning röret och in en sida av en 16 mm kvarts provrör med 3 mm avdelare.
    8. Överföra de återstående 2,5 ml av bestrålat BMPO-OH i den andra sidan av 16 mm kvarts provrör med 3 mm avdelare.
  4. Framställning av dinitroxide radikal
    1. Väg upp 24,7 mg 2 H, 15 N-disulfid dinitroxide (Figur 1C) i 1 ml DMSO för en förrådslösning av 47,5 mM.
    2. Förbered 10 mM Tris-buffert och justera till pH 7,2.
    3. ta 40il dinitroxide stamlösning och späd med Tris-buffert till en slutlig koncentration av 1 mM.
    4. Placera 250 pl dinitroxide lösning i buffert i ett 16 mm kvartsprovröret med en 10 mm avdelare i mitten.
    5. Väg upp 154 ​​mg av glutation och lägg till 5 ml av Tris-buffert för en slutkoncentration av 100 mM.
    6. Tillsätt 5 | il av 100 mM glutation lösning till 250 | il av 1 mM dinitroxide lösningen på en sida av 10 mm delaren för att omvandla diradikal till envärd.
  5. Framställning av nitronyl nitroxid
    1. Avlägsna radikalen från frysen och låt behållaren att komma till rumstemperatur (10 till 15 min).
    2. Väg upp 1,9 mg av nitronyl (390 g / mol).
    3. Väg upp 0,56 mg KOH och lös upp i 10 ml avjoniserat vatten för en slutlig koncentration av 1 mM.
    4. Blanda 1,9 mg nitronyl i 10 ml 1 mM KOH-lösning för en slutlig koncentration av 0,5 mM nitronyl.
      Obs: Om necessary, använd en virvel eller sonikator hastighet solvatisering av nitronyl.

3. Inställning av Rapid Scan instrumentet vid 250 MHz

Obs: Tuning av resonator med ett vattenhaltigt prov av nitroxid radikal, som har en liknande effekt på resonator Q och tuning som buffertlösning, är ett bra sätt att ställa upp för det prov som skall avbildas

  1. Tune resonatorn med ett vattenhaltigt prov av nitroxid radikal.
    1. Sätt i 15 ml 0,5 mM 15 N-PDT i vattenprov i en 16 mm kvarts EPR rör.
    2. Sätt i kvartsröret in i detektions sidan av tvär slinga RS-EPR resonator.
    3. Ändra frekvensen av instrumentet källan tills den matchar frekvensen hos detekteringssidan som innehåller provet. manuellt ändra bärfrekvensen av 250 MHz källan genom att ange önskat värde i mjukvaran.
    4. Ändra frekvensen hos exciteringssidan för att matcha de frequentor av experimentet källan och detekteringssidan av resonatorn. Ändra frekvensen hos exciteringssidan genom att vrida en variabel kondensator inom resonatorkaviteten enligt tillverkarens protokoll.
  2. Ställ in instrumentpanelen och huvudmagnet
    1. Slå på spektrometer och välja ett experiment som registrerar gående data med tid på x-axeln.
    2. Inom programmet ange antalet punkter till 65.536 och tidsbasen till 10 ns.
    3. Ställ in antalet medelvärden till 10000 för en stark eller smal signal, och 45.000 för en bred eller svag signal.
    4. Tryck på "engagera sig" i programvaran för att skicka de experimentella parametrar från programvaran till konsolen och energi huvudområdet magnet.
    5. Ställ huvudmagnetfältet till 9 mT.
    6. Ställ effektdämpnings vredet till 50 dB, och slå på 7 W hög effektförstärkare.

4. UtförandeRapid Scan Experiment

Obs: Specifika instruktioner i samband med analys av fantomer innehåller BMPO-OH 24, är pH-känsliga TAM radikaler 19,27 och redox känsliga dinitroxides 28 tillhandahålls i litteraturen.

  1. Ström mättnad av standard nitroxiden prov
    Obs: Det är fördelaktigt att göra en strömmättnadskurva på en vanlig nitroxid radikal prov under samma experimentella betingelser som kommer att användas för att titta på radikaler är känsliga för pH eller redox status.
    1. Slå på den snabba scannings spole, med värdena från avsnitt 1 (skanningsfrekvens på 6,8 kHz och skanna bredd av 7 mT).
    2. Med början vid 50 dB, samla en snabb skanning spektrum med 100k medelvärden. Minska dämpningen med 3 dB och upprepa mätningen. Fortsätt tills en dämpare inställningen 0 dB, eller så länge som isoleringsmätning på bryggan avläsning är <0.
    3. överförings tHan rå snabba skanningsdata till ett avfaltning program (till exempel skriven i Matlab) och bearbeta rådata till absorptionsspektrum.
    4. Ange skanningsfrekvens, svepbredd, antal poäng och tidbas i programmet, och kör programmet för att bearbeta den råa snabba scanningssignalen till en absorption signal.
    5. Plotta amplituden för absorptionen signalen som en funktion av kvadratroten effekt (i watt) som infaller på resonatorn. I den icke-mättande regimen, är amplituden linjärt beroende av kvadratroten av infallande effekt.
    6. Montera en trendlinje som börjar på 0,0 och inkludera alla datapunkter som faller inom det linjära responsområdet. I det linjära responsområdet, signal amplituden ökar i proportion till kvadratroten av mikrovågseffekt.
    7. Extrapolera denna trend till högre makter, och jämföra EPR signalstyrka. Använda den högsta kraft för vilken signalamplituden inte avviker mer än 3% från den extrapolerade trendlinjen. in order för avfaltning av den snabba scanningssignalen ska fungera måste signalen fortfarande vara i det linjära responsområdet med avseende på infallande effekt.
      Obs: Överföring av rå snabba skanningsdata kan göras via en nätverksanslutning eller via USB-minne. I detta fall är det nödvändigt att överföra eftersom programmet för att bearbeta rådata (Matlab) är inte på samma dator som har datainsamling programvara. Den avfaltning algoritm som bearbetar rådata beskrivs i 29.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Produkten av experimentet är en uppsättning projektioner som rekonstrueras i två-dimensionell (en spektral, en rumslig) bilder med en falsk färgskala för att representera signalens amplitud. Djupblå betecknar baslinjen där ingen signal förekommer, är grön låg amplitud och rött högst. Skivor längs x-axeln (spektral dimension) skildrar EPR-signal (EPR övergång) på ett magnetfält axel. Längs y-axeln (rumslig dimension), separation mellan signaler motsvarar den fysiska rumsliga separationen mellan prover i resonatorerna.

Figur 3 visar en jämförelse av två bilder, som förvärvats med CW (Figur 3B) eller RS (figur 3a) av en fantom med tre olika typer av 15 N substituerade nitroxid radikaler (Figur 3D). Den bredaste signalen motsvarar 15 N-PROXYL, en fem medlem pyrrolidine ring med en negativ laddning vid fysiologiskt pH, vilket kan hjälpa rikta molekylen till specifika cellulära avdelningar. Dubb signal hör till 15 N-mHCTPO och är resultatet av en enda väte bland annat fullständig deuteration. Denna enda uppdelning har optimerats för att övervaka förändringar i syrekoncentrationen 30. Den smalaste signalen kommer från 15 N-PDT, en flexibel piperidinring som är helt deutererad. Den kan användas för att övervaka syrekoncentrationen, eller redox miljö (reduktion av strukturen leder till en minskning i EPR-signal).

För samma fem-minuters förvärv tid, visar RS bilden överlägsen rumslig upplösning och tydlighet i spektrala mönster för varje radikal. Ett skäl till förbättring av RS över CW kan ses genom jämförelse av spektra vid två olika lutningsstyrkor mellan de två teknikerna (Figur 3C). Som gradienten styrkan ökarden spektrala signalen breddas. Betydande nedbrytning av CW spektrumet under de höga gradienter (1 mT / cm) som kodar rumslig information.

Eftersom ett derivat signal breddar snabbare än en absorption signal, är SNR för den högsta gradient CW utsprång (rött spår) mycket dålig jämfört med den för den högsta gradient RS utsprång (blå spår). Linjebredd som en funktion av rumsläget kan extraheras från en 2D-plot. Linjebredd kommer att vara bred eller smal baseras på förändringar i syrekoncentrationen eller viskositet runt nitroxiden sonden. Fantom avbildas i figur 3A var vid rumstemperatur och öppen för luften. Eftersom syrehalten och viskositet (bestämt med temperatur) förblev stabil, bör linjebredden hos varje prob vara konstant över bredden av varje rör som innehåller en radikal, fig. 4 visar den spridning i linjebredder passa från skivor genom 2D-bilden jämförttill det sanna linjebredden värdet (svart horisontell linje). Bild skiva värden, särskilt för 15 N-PDT, är en bättre matchning till verkliga linjebredden värde för RS (Figur 4A) än för CW (Figur 4B). Detta är också ett resultat av den förbättrade SNR på RS över CW-tekniken.

En annan fördel med RS-tekniken är förmågan att generera stora magnetiska homogena fält sveper i en mycket kort tid. En typisk scan frekvens för experiment vid 250 MHz är 9 kHz, vilket motsvarar 0,11 msek. Detta är 0,11 ms om fältet svep är 0,5 miljoner ton eller 5,0 mT. Jämför detta med CW, där en 5,0 mT sopa tar tiotals sekunder till minuter. Med snabb skanning blir det möjligt att snabbt samla 100% av den spektrala informationen i tider som är mottagliga för in vivo imaging.

Figur 5 visar brett spektrum RS-EPR imaging appliceras för att snurra fångst modeller. Viktiga signalmolekyler, som OH • och NO • är endogena fria radikaler med mycket korta livslängd. För att studera dessa molekyler är "spin traps" används. Ett exempel på reaktionen mellan spinnfälla 31 (BMPO) med OH • visas i figur 1B. Avbildning av en fantom som innehöll 5 | iM BMPO-OH addukten visas i figur 5 (A, B). Spin-trap addukt-signalen är beroende av utgångskoncentrationen av OH • och har en halveringstid på 30 minuter möjliggör studier av alla processer som genererar OH •. Den nitronyl nitoxide 32 användes som ett annat exempel på bred imaging spektrum, men har använts i det förflutna för spin-fångst av NO • 33,34. Avbildning av en fantom som innehåller nitronyl visas i figur 5 (C, D). för spi fällor, fånga hela spektrat ger bättre beteckning av de ursprungliga gående radikala arter som var närvarande.

Känsligheten för fysiologiska förändringar som pH och redox status härrör från förändringar i hela spektrumet. Figur 6 visar avbildning med aTAM 4. I figur 6B, profilen aTAM 4 vid pH = 7,0 (blå) har många spektrala särdrag, och ett segment från bilden matchar väl med den motsvarande noll gradient spektrum (grön). Jämför detta med profilen aTAM 4 vid pH = 7,4, Figur 6C, med färre spektrala särdrag och fortfarande i god överensstämmelse med den motsvarande noll gradient spektrum. Avbildning av fantomer innehållande av dinitroxide i dess dimera, och reducerade monomera formen visas i figur 7. De två olika spektra genereras genom klyvning av en disulfid (SS), och så förmedla känslighet för redox environment 1,35.

Figur 1
Figur 1. EPR-sonder är känsliga för många fysiologiska förändringar. (A) Ett exempel på de pH-känsliga tri-aryl-metyl (TAM) radikaler 26. (B) Spin trap BMPO. (C) 15 N-dinitroxide. (D) Den nitronyl. (E) 15 N-PROXYL. (F) 15 N-mHCTPO. (G) 15 N-PDT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Snabb skanning EPR har inneboende bättre SNR. (A) Jagn CW EPR amplituden h är en liten bråkdel av den totala signalen, som bestäms av det magnetiska fältet modulering. (B) I direkt upptäckt snabb skanning, är hela signalamplituden upptäcks. Signal-brus Ökningen är tydlig i experiment där superoxid som genereras av E. faecalis fångas med BMPO på X-bandet. För samma 30 sek förvärv tid, knappast någon signal kan observeras i CW spektrum (C), medan en stark signal observeras i den snabba scannings spektrum (D) 36. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Förbättrad SNR ger bättre rumslig upplösning. För samma fem minuters förvärv tid, RS bilden ( (B). (C) Det finns god överensstämmelse mellan prognoser som förvärvats med snabb skanning (blå) och CW (röd) när ingen lutning förekommer (0 mT / cm) (D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Informationsinnehållet i en snabb bildfångst är högre än för CW. (A) Skivor av 2D RS bilden. (B) Skivor av 2D CW bilden. Den sanna linjebredden (svart horisontell linje) för varje prov visas som jämförelse. Se referens 23. Klicka här för att en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. Rapid fältet sveper tillåter infångning av en hel spektrum i ett par sekunder. (A) 2D spektral-spatial bild av en fantom som består av BMPO-OH-addukt. (B) En simulering passning till noll-gradient BMPO-OH-spektrum vid 250 MHz användes för att passa den initiala BMPO-OH bild och skilja mellan områden som innehåller BMPO-OH och buller innehållande regioner. (C) 14 N nitronyl radikal som kan användas för att fånga kväveoxid in vivo. (D) skär genom varje spektrum visar den spektrala form vid 250 MHz. Se referens 19. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

ve_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> figur 6
Figur 6. Ingen del av spektrumet lämnas ut, vilket gör att en bättre uppföljning av fysiologiskt inducerade spektrala förändringar. (A) 2D spektral-spatial bild av en fantom bestående av två rör med pH känsliga aTAM 4 radikal. (B) Spectral profilen aTAM 4 vid pH = 7,0 (blå) och den motsvarande noll gradient spektrum (grön). (C) Spectral profilen aTAM 4 vid pH = 7,4 B (blå) och motsvarande noll-gradient spektrum (grön). Se referenser 19,26,37. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Snabb skanning öppnar dörren in vivo redox övervakning vid 250 MHz. (A) 2D spektrala-spatial bilder av 15 N-dinitroxide. (B) skär genom toppen (blå spår) och botten (röd spår) avdelningar i de två bilderna. (C) Den översta facket förblir densamma, men den undre avdelningen har reducerats med glutation. (D) Skiva genom varje bildobjekt som visar förändringen i 1D spektrumet för den undre avdelningen. Se referenser 1,28,35. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Snabb-scan signaler har högre frekvenskomponenter än CW, och kräver en större resonator bandbredd beroende på linjebredder, relaxationstider, och hastigheten på den snabba genomsökningar. Den bandbredd som krävs för ett givet experiment är baserad på linjebredden och den avsökningshastighet av magnetfältet (ekvation 2). Beroende på relaxationstider hos proben som studeras (T 2 och T 2 *), och avsökningshastigheten, kan svängningar visas på den bakre kanten av signalen. För nitroxid-radikaler med T2 ~ 500 ns vid 250 MHz (57: e Rocky Mountain konferens om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015), experimentella scan priser är ofta inte tillräckligt hög för att observera eventuella svängningar.

Den experimentella bandbredden typiskt begränsad av resonatorn bandbredd. Varje halvcykel av en snabb skanning experiment registreras med antingen minskar eller ökar fält / frekvens, så den experimentella bandbredd är ½ than Resonator bandbredd, såsom visas i (ekvation 1). Om den experimentella bandbredden begränsas av valet av parametrar så att den är större än resonator bandbredd och svängningar dämpas, bredda resultat i dekonvolvering linje. Eftersom experimentet bandbredd bestäms av hastigheten och linjebredden av den radikala studeras, förstå dessa funktioner är en viktig del av den snabba scannings experiment.

Det nuvarande protokollet visar EPRI vid 250 MHz av fantomer innehållande prober som är känsliga för syre, viskositet, pH, endogen transienta signalmolekyler (dvs OH •, NO •) och redox-status. Rumsliga upplösningar mellan 1 och 3 mm har visats, med experimentella hämtningstider mellan 29 sekunder (enda rad av en 2 linje 15 N-spektrum, Figur 3) och 15 minuter (hela spektrumet av 5 iM BMPO-OH, Figur 5). Metodutveckling med Phantoms visaranvändning av RS-EPR bilder ersätter den konventionella CW-EPR avbildningsteknik 23,24, och öppnar nya vägar för in vivo imaging med hjälp av EPR-sonder.

EPRI är fördelaktig jämfört med andra in vivo-avbildningstekniker baserade på fluorescens eller fosforescens, som EPR-sonder är känsliga för ett bredare utbud av in vivo fenomen. Dessutom är RF penetration på 250 MHz ~ 7 cm, så att man kan studeras avvikande vävnad på en djupare nivå. Kärn magnetisk resonanstomografi (MRT) ger mycket detaljerade anatomiska kartor, men kämpar för att ge kvantitativ fysiologisk information. En kombination av MRI och EPRI kunde en dag resulterar i en allt magnetisk resonans version av en positron-utsläpps tomografi (PET) / datortomografi (CT) scanner. Ett sådant instrument skulle ge samma nytta av PET / CT, men utan tunga stråldoser eller dyra radiospårämnen.

Metodutveckling med fantomer fortsätter att driva tHan begränsar av RS-EPR, men det slutgiltiga målet är att genomföra tekniken i laboratorier som använder djurmodeller. Beräkningar för bildrekonstruktioner måste förbättras för att påskynda datainsamling för en 4D experiment (tre rumsliga, en spektral dimension). En förbättrad algoritm för närvarande utvecklas och är avgörande för in vivo applikationer, men proof of principle kan göras med 2D.

Många av radikaler, såsom 15 N-PDT, används i fantomer försämra snabbt under in vivo-betingelser med halveringstider på endast 60 sekunder. Radikaler med en förbättrad motståndskraft mot in vivo reduktion 39 har syntetiserats och är viktigt för att bygga tillräckligt stora koncentrationer in vivo. Den förbättrade känsligheten hos RS-EPR över CW-EPR 24 kommer att vara en annan fördel i att lösa detta problem. Känsligheten hos snabba skanningen är för närvarande 5 uM för en fantom, och mellan 100 pM och 5 mM, beroende påsonden som skall avbildas, för djurstudier som utförts vid University of Chicago (personlig kommunikation, Maggio, M., 2015). RS-metoden kommer att fortsätta att utvecklas för att fylla denna lucka, men programmet har redan börjat flytta in faktiska in vivo applikationer (57: e Rocky Mountain konferens om Magnetic Resonance, Epel, B, et al., 2015).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Delvis stöd för detta arbete av NIH beviljar NIBIB EB002807 och CA177744 (GRE och SSE) och P41 EB002034 till GRE, Howard J. Halpern, PI, och av University of Denver tacksamma. Mark Tseytlin stöddes av NIH R21 EB022775, NIH K25 EB016040, NIH / NIGMS U54GM104942. Författarna är tacksamma Valery Khramtsov, nu vid University of West Virginia, och Illirian Dhimitruka vid Ohio State University för syntes av pH-känsliga TAM radikaler, och Gerald Rosen och Joseph Kao vid University of Maryland för syntes av mHCTPO , PROXYL, BMPO och nitronyl radikaler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4,1-15N)piperdinyloxyl (15N-PDT) CDN Isotopes  M-2327 98% atom 15N, 98 % atom D, Quebec Canada
4-1H-3-carbamoyl-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-3-pyrrolinyloxyl (15N-mHCTPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 29
3-carboxy-2,2,5,5-tetra(2H3)methyl-1-(3,4,4-2H3,1-15N)pyrrolidinyloxyl (15N-Proxyl) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 25
4 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass 707-SQ-100M
4-oxo-2,2,6,6-tetra(2H3)methyl-1-(3,3,5,5-2H4)piperdinyloxyl (14N-PDT) CDN Isotopes D-2328 98% atom D, Quebec Canada
pH sensitive trityl radical (aTAM4) Ohio State University N/A Synthesized at Ohio State University and described in Reference 26
Potassum Phosphate, Monobasic J.T. Baker Chemicals 1-3246
6 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-5M-6M-0-250/RB
8 mm Quartz EPR Tubes Wilmad Glass Q-7M-8M-0-250/RB
5-tert-butoxycarbonyl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide (BMPO) N/A N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 30
Hydrogen Peroxide Sigma Aldrich H1009 SIGMA 30%
16 mm Quartz EPR tube Wilmad Glass 16-7PP-11QTZ
Medium Pressure 450 W UV lamp Hanovia 679-A36 Fairfield, NJ
L-Glutathione, reduced Sigma Aldrich G470-5
Nitronyl NA N/A Synthesized at U. Maryland and described in Reference 31
Sodium Hydroxide  J.T. Baker Chemicals 1-3146

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bobko, A. A., et al. In vivo monitoring of pH, redox status, and glutathione using L-band EPR for assessment of therapeutic effectiveness in solid tumors. Magn. Reson. Med. 67 (6), 1827-1836 (2012).
  2. Utsumi, H., et al. Simultaneous molecular imaging of redox reactions monitored by overhauser-enhanced MRI with 14N-and 15N-labeled nitroxyl radicals. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1463-1468 (2006).
  3. Khramtsov, V. V., Grigor'ev, I. A., Foster, M. A., Lurie, D. J., Nicholson, I. Biological applications of spin pH probes. Cell. Mol. Bio. 46 (8), 1361-1374 (2000).
  4. Halpern, H. J., et al. Oxymetry Deep in Tissues with Low-Frequency Electron-Paramagnetic Resonance. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 91 (26), 13047-13051 (1994).
  5. Matsumoto, S., et al. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. J. Clin. Invest. 118 (5), 1965-1973 (2008).
  6. Velan, S. S., Spencer, R. G. S., Zweier, J. L., Kuppusamy, P. Electron paramagnetic resonance oxygen mapping (EPROM): Direct visualization of oxygen concentration in tissue. Magn. Reson. Med. 43 (6), 804-809 (2000).
  7. Elas, M., et al. Electron paramagnetic resonance oxygen image hypoxic fraction plus radiation dose strongly correlates with tumor cure in FSA fibrosarcomas. Int. J. Radiat. Oncol. 71 (2), 542-549 (2008).
  8. Dreher, M. R., et al. Nitroxide conjugate of a thermally responsive elastin-like polypeptide for noninvasive thermometry. Med. Phys. 31 (10), 2755-2762 (2004).
  9. Gallez, B., Mader, K., Swartz, H. M. Noninvasive measurement of the pH inside the gut by using pH-sensitive nitroxides. An in vivo EPR study. Magn. Reson. Med. 36 (5), 694-697 (1996).
  10. Halpern, H. J., et al. Diminished aqueous microviscosity of tumors in murine models measured with in vivo radiofrequency electron paramagnetic resonance. Cancer Res. 59 (22), 5836-5841 (1999).
  11. Elas, M., Ichikawa, K., Halpern, H. J. Oxidative Stress Imaging in Live Animals with Techniques Based on Electron Paramagnetic Resonance. Radiat. Res. 177 (4), 514-523 (2012).
  12. Kuppusamy, P., et al. Noninvasive imaging of tumor redox status and its modification by tissue glutathione levels. Cancer Res. 62 (1), 307-312 (2002).
  13. Khramtsov, V. V., Yelinova, V. I., Glazachev, Y. I., Reznikov, V. A., Zimmer, G. Quantitative determination and reversible modification of thiols using imidazolidine biradical disulfide label. J. Biochem. Biophys. Methods. 35 (2), 115-128 (1997).
  14. Plonka, P. M. Electron paramagnetic resonance as a unique tool or skin and hair research. Exp. Dermatol. 18, 472-484 (2009).
  15. Halevy, R., Shtirberg, L., Shklyar, M., Blank, A. Electron Spin Resonance Micro-Imaging of Live Species for Oxygen Mapping. J. Vis. Exp. (42), e122 (2010).
  16. Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. Microimaging of oxygen concentration near live photosynthetic cells by electron spin resonance. Biophys J. 99 (3), 971-978 (2010).
  17. Eaton, G. R., Eaton, S. S. Concepts Magn. Reson. 7, 49-67 (1995).
  18. Maltempo, M. M. Differentiaon of spectral and spatial components in EPR imaging using 2-D image reconstruction algorithms. J. Magn. Reson. 69, 156-161 (1986).
  19. Tseitlin, M., et al. New spectral-spatial imaging algorithm for full EPR spectra of multiline nitroxides and pH sensitive trityl radicals. J. Magn. Reson. 245, 150-155 (2014).
  20. Mitchell, D. G., et al. Abstracts of Papers of the American Chemical Society. Radu, N., Koch, S. 242, Denver, CO. (2011).
  21. Stoner, J. W., et al. Direct-detected rapid-scan EPR at 250 MHz. J. Magn. Reson. 170 (1), 127-135 (2004).
  22. Tseytlin, M., Biller, J. R., Mitchell, D. G., Yu, Z., Quine, R. W., Rinard, G. A., Eaton, S. S., Eaton, G. R. EPR Newsletter. 23, Russian Acaademy of Sciences, Zavoisky Physical-Technical Institute. 8-9 (2014).
  23. Biller, J. R., et al. Imaging of nitroxides at 250 MHz using rapid-scan electron paramagnetic resonance. J. Magn. Reson. 242, 162-168 (2014).
  24. Biller, J. R., et al. Improved Sensitivity for Imaging Spin Trapped Hydroxyl Radical at 250 MHz. Chem. Phys. Chem. 16 (3), 528-531 (2015).
  25. Burks, S. R., Bakhshai, M. A., Makowsky, M. A., Muralidharan, S., Tsai, P., Rosen, G. M., Kao, J. Y. 2H, 15N-Substituted nitroxides as sensitive probes for electron paramagnetic resonance imaging. J. Org. Chem. 75, 6463-6467 (2010).
  26. Dhimitruka, I., Bobko, A. A., Hadad, C. M., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Synthesis and characterization of amino derivatives of persistent trityl radicals as dual function pH and oxygen paramagnetic probes. J. Am. Chem. Soc. 130 (32), 10780-10787 (2008).
  27. Elajaili, H. B., et al. Electron spin relaxation times and rapid scan EPR imaging of pH-sensitive amino-substituted trityl radicals. Magn. Reson. Chem. 53 (4), 280-284 (2015).
  28. Elajaili, H., Biller, J. R., Rosen, G. M., Kao, J. P. Y., Tseytlin, M., Buchanan, L. B., Rinard, G. A., Quine, R. W., McPeak, J., Shi, Y., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Imaging Disulfides at 250 MHz to Monitor Redox. J. Magn. Reson. , (2015).
  29. Tseitlin, M., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Deconvolution of sinusoidal rapid EPR scans. J. Magn. Reson. 208 (2), 279-283 (2011).
  30. Halpern, H. J., Peric, M., Nguyen, T. D., Spencer, D. P., Teicher, B. A., Lin, Y. J., Bowman, M. K. Selective isotopic labeling of a nitroxide spin label to enhance sensitivity for T2 oxymetry. J. Magn. Reson. 90, 40-51 (1990).
  31. Tsai, P., et al. Esters of 5-carboxyl-5-methyl-1-pyrroline N-oxide: A family of spin traps for superoxide. J. Org. Chem. 68 (20), 7811-7817 (2003).
  32. Biller, J. R., et al. Frequency dependence of electron spin relaxation times in aqueous solution for a nitronyl nitroxide radical and perdeuterated-tempone between 250 MHz and 34 GHz. J. Magn. Reson. 225, 52-57 (2012).
  33. Rosen, G. M., et al. Dendrimeric-containing nitronyl nitroxides as spin traps for nitric oxide: Ssynthesis, kinetic, and stability studies. Macromolecules. 36 (4), 1021-1027 (2003).
  34. Bobko, A. A., et al. Redox-sensitive mechanism of no scavenging by nitronyl nitroxides. Free Radical Biol. Med. 36 (2), 248-258 (2004).
  35. Roshchupkina, G. I., et al. In vivo EPR measurement of glutathione in tumor-bearing mice using improved disulfide biradical. Free Radical Bio. Med. 45 (3), 312-320 (2008).
  36. Mitchell, D. G., et al. Use of Rapid-Scan EPR to Improve Detection Sensitivity for Spin-Trapped Radicals. Biophysical Journal. 105 (2), 338-342 (2013).
  37. Bobko, A. A., Dhimitruka, I., Zweier, J. L., Khramtsov, V. V. Trityl radicals as persistent dual function pH and oxygen probes for in vivo electron paramagnetic resonance spectroscopy and imaging: Concept and experiment. J. Am. Chem. Soc. 129 (23), (2007).
  38. Biller, J. R., et al. Electron spin-lattice relaxation mechanisms of rapidly-tumbling nitroxide radicals. J. Magn. Reson. 236, 47-56 (2013).
  39. Redler, G., Barth, E. D., Bauer, K. S., Kao, J. P. Y., Rosen, G. M., Halpern, H. J. In vivo electron paramagnetic resonance imaging of differential tumor targeting using cis-3,4-di(acetoxymethoxycarbonyl)-2,2,5,5-tetramethyl-1-pyrrolidinyloxyl. Magn. Reson. Med. 71 (4), 1650-1656 (2013).

Tags

Bioteknik elektronspinnresonans (EPR) snabb skanning nitroxid, 250 MHz pH syrekoncentration redox status signalmolekyler biofysik
Snabb Scan elektronspinnresonans öppnar nya vägar för Imaging fysiologiskt viktiga parametrar<em&gt; In Vivo</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Biller, J. R., Mitchell, D. G.,… More

Biller, J. R., Mitchell, D. G., Tseytlin, M., Elajaili, H., Rinard, G. A., Quine, R. W., Eaton, S. S., Eaton, G. R. Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo. J. Vis. Exp. (115), e54068, doi:10.3791/54068 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter