Introduction
על מנת לקבל את החומרים המזינים הדרושים להישרדות, גידולים ממאירים דורשים גישה לזרם הדם של החולה. כדי לקבל גישה זו, תאים סרטניים משחררים אותות כימיים המעודדים צמיחה של כלי דם חדשים לגידול, ובכך חטיפת תהליך פיזיולוגי נורמלי המכונה אנגיוגנזה 2. זוהי גם דרך כלי הדם שנוצרו באמצעות אנגיוגנזה כי גרורות (כלומר, התפשטות הסרטן לאיברים אחרים) יכול להתרחש. בגלל התהליך של אנגיוגנזה הוא כל כך חיוני להתקדמות של רחב מגוון של סרטן מסוג זה, היא יעד אטרקטיבי במחקר טיפול נגד סרטן 3.
שיטה אחת בשימוש לכמת אנגיוגנזה היא למדוד את היכולת של תאים ובתאים אנדותל להקים צינורות כאשר הניח על תאי מטריקס. בגלל היווצרות של צינורות אלה היא צעד מוקדם קריטי אנגיוגנזה, בדיקת תנאי הסביבה (למשל, נוכחות או העדר שיתוף נתוןmpound) שיכולים לעורר או לעכב היווצרות צינור מספק תובנה צעדים ספציפיים שניתן להתמקד בהם כדי לעכב אנגיוגנזה. את assay היווצרות צינור תא האנדותל הוא אחת השיטות 4 הנפוץ ביותר במבחנה אשר מודד את היכולת של התאים כדי ליצור צינורות. זהו assay פשוט, הדורש רכיבים מעטים יחסית ותקופת תרבות קצרה 5. ואולי הכי חשוב, עם זאת, הוא כי הנתונים שנצברו סוג זה של assay הוא לכימות.
דוגמא לשימוש של assay היווצרות צינור כרוך להשוות את ההתפתחות של צינורות מתאי אנדותל כלי דם גדלו על תאי מטריקס לעומת גורם גדילה המופחת (GFR) מטריקס. המטריצה התאית היא חומר קרום דמוי במרתף מבודד מתאי סרקומה המרכיבים העיקריים שלה הם laminin, קולגן מהסוג IV, גורמי גדילת proteoglycans. יש תרכובות מסוימות השפעות שונות על היכולת של התא כדי ליצור צינורות כאשר בסביבה עם גורמי גדילה מופחתים proteoglycans סולפט heparan המופחת (HSPGs). HSPGs הם מרכיב של מטריקס אשר מצטמצם משמעותית מטריקס GFR. כדוגמה, אם ההשערה כי מעכבי אנגיוגנזה, כגון SB225002, החוסם את קולטן CXCR2, חלשים היכולת ניכרת לקטוע היווצרות צינור כאשר HSPGs נמצאים בשפע, אז השוואה בין פעילות היווצרות צינור ב תאי מטריקס ו מטריקס GFR הוא חשוב לבחון את האפשרות של עיכוב אנגיוגנזה באמצעות השלט של HSPGs.
מבחני אחרים המשמשים בדרך כלל כדי לקבוע את ההשפעות של תרכובות על אנגיוגנזה נמצאים שיטות vivo. דוגמאות בולטות לכך הן קרום חומוס chorioallantoic (רמ"א) assay 6 באמצעות ביצי תרנגולת, ואת Matrigel vivo ב תקע assay אנגיוגנזה 7 באמצעות עכברים. בעוד שיטות in vivo למדוד אנגיוגנזה tממדים hree והם יותר נציג של גוף האדם לעומת assay היווצרות צינור חוץ גופית, הם סובלים את הפגם של הדורש באופן משמעותי יותר זמן הם הרבה יותר קשה לבצע. הן assay CAM ואת assay תקע תאיים לקחת לפחות שבוע 8 לעשות, ואילו השוואה, assay היווצרות צינור יכול להיעשות ביום אחד והוא אינו דורש שימוש בבעלי חיים.
חשוב לציין כי תאי אנדותל נעשה שימוש בדוח זה הם תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVEC). תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי ניבט כלי דם ואת צמיחת כלי דם, והם מקבילים במידה מספקת לתאי אנדותל בסרטנים לשמש לשם הערכת פעילות אנטי-אנגיוגנזה היא במבחנה בניסויי vivo 9. תאים אחרים כגון לתאי אנדותל כלי דם עיקריים עשויים לשמש גם.
כמו כן, חשוב לציין כי חוץ מזה שיש תחתוןרמות של HSPGs, מטריקס GFR גם הפחיתה רמות של רכיבים רבים בהשוואה מטריקס רגיל. זה כולל, אך אינו מוגבל: EGF, IGF-1, PDGF, ו TGF-beta. אלה ניסויי ביצוע לומדים את המשמעות של תרכובות אלה ביחס אנגיוגנזה עשויים להיות מעוניינים להשתמש מטריקס GFR.
Protocol
1. תרבית תאים
- 3x10 Seed 5 תאים HUVEC ב 10 מ"ל של מדיום הגידול להשלים 10 בבקבוק 75 ס"מ.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 כדי מפגש 70-80%.
2. Assay גיבוש אבובית
- הפשרה או המטריצה מופחתת-factor (GFR) הצמיחה התאית או תאי מטריקס רגיל לילה על קרח על 4 מעלות צלזיוס.
הערה: למען הקיצור 'מטריקס' מעתה לשמש כפנייה היא GFR ו מטריקס רגיל. התהליך כדי להכין אותם הוא זהה. - שמור תרבות צלחות 96-היטב על קרח, ולהוסיף 50 μl של מטריקס מצונן היטב לכל משתמש טיפים מראש מקורר. הכן בשלושה עותקים של 5 בארות המכילות רק את תאי מטריקס הרגיל. הכן בשלושה עותקים אחרים של 5 בארות המכילות תאי מטריקס GFR בלבד.
- דגירת צלחת 96-היטב על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- שטפו את HUVECsפעם עם פתרון שנאגרו-פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS), ולהוסיף 0.05% 1 מ"ל טריפסין-EDTA. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות, בדיקת התאים מכל רגע עד לעגל כלפי מעלה רוב התאים. לסלק את התאים על ידי הקשה על בקבוקון פעם.
- הוסיפו 5 מיליליטר בינוני בסיס (כלומר, מדיום גידול תא האנדותל בלי כלום (למשל, ספקים) אינם במקור) עם 1% עוברי שור סרום (FBS). אוספים את התאים בבקבוק ידי pipetting ולהעביר צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant.
- Re- להשעות עם 2 מ"ל בינוני הבסיס, לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ולהתאים את ריכוז התאים 2-3 x 10 5 תאים / מ"ל.
- הכן 100 μl של מעכב CXCR2 10x ריכוזי הבאים SB225002 במדיום הבסיסי: 11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר (שליטה).
- פיפטה 300 μl של ההשעיה HUVEC לתוך כל 5 micrצינורות ocentrifuge. להוסיף 33 μl של ריכוזי מעכב (11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר) לתוך צינור אחד בכל המכיל את HUVECs, ו מערבולת.
- פיפטה 50 μl של כל אחד המתלים תא (1-1.5 x 10 4 תאים) כדי בארות בודדות של מטריקס. פלייט כל השעיה בשלושה עותקי דגירה במשך 4-16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- לאחר 4-16 שעות, לקחת 4 תמונות של הצינורות יצרו לכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה 11 (גדלה מקורית x 100).
3. Assay שיבוש אבובית
- הכן את תאי מטריקס וצלחות פי מפרט זהה גיבוש Tube Assay (שלבים 2.1 עד 2.3).
- הכן ההשעיה HUVEC כמתואר בשלבים 2.4- 2.4.2 של היווצרות צינור Assay ו aliquot לתוך צלחת 96-היטב המכיל את תאי מטריקס ב 50 μl לכל טוב.
הערה: פלייט של בארות מספיקo כי יש 3 בארות לכל טיפול תרופתי. - לגדל תאים על תאי מטריקס עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח תמונות לפני תחילתו של טיפול תרופתי.
- הכן ריכוזי 2x של SB225002 מעכב CXCR2 כמתואר שלב 2.5 של assay היווצרות צינור, ולהוסיף 50 μl של כל ריכוז לכל טוב של 96 את הצלחת היטב המכיל את HUVECs. פלייט כל ריכוז בשלושה עותקים.
- דגירה הצליחה במשך 2-12 שעות אחרות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח 4 תמונות של הצינורות נוצרו בכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה (גדלה מקורית × 100) 11.
4. כימות נתונים
- הערכת היווצרות צינור שנתפסו בתמונות על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות בארבעה תחומים מיקרוסקופיים אקראי באמצעות תוכנת המצלמה מיקרוסקופ.
- פתח את התמונה בתוכנת מצלמת מיקרוסקופ, ולחץ על 'הסברים ומדידות9 ;. בקטע 'אורך', בחרו בכלי 'קו פשוט'. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני.
הערה: התוכנה תחשב אוטומטית את האורך של הקו בפיקסלים ולשים את הנתונים לקובץ. - חזור על התהליך עבור כל קווי הצינור בתמונה על ידי בחירת הכלי 'קו פשוט'. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני.
הערה: התוכנה תתעד את אורכו של כל קו ולהציג את הנתונים על המסך. - אחרי בדיקת כל צינור בתמונה, לחץ על 'יצוא', ולאחר מכן בחר 'אורך לגיליון אלקטרוני'.
הערה: הנתונים אורך ייוצאו גיליון אלקטרוני. - הוסף את כל אורכי הצינור מתוך הגיליון האלקטרוני כדי לקבל את אורך הצינור הכולל. חישוב ולהקליט את האורך הממוצע של החצוצרות.
הערה: ארבעה משכפל מומלץ עם ממוצע וסטיית תקן שנקבע.
5. תאים כאשר התאוששו מן התרבות תא מטריקס
- תרבות ולבצע assay היווצרות צינור (ראה סעיף 2) בקנה מידה גדול יותר כמו צלחת 96 גם לא תניב ספירת תאי מספיק. במשך 12 צלחות היטב, השתמש 500 μl של מטריקס ו 500 μl של השעית תא HUVEC (1.5x10 5 תאים).
- דגירת התאים למשך 4-16 שעות כדי להרכיב צינורות. ואז, לשאוב את מדיום תרבית תאים. יש לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר ללא סידן ומגנזיום.
- הוסף 1 מ"ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA חיץ על תרבות ולשמור על קרח למשך 10 דקות.
- לסלק את התאים תערובת תאי מטריקס מצלחת באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl עם קצה לחתוך, ולאחר מכן להעביר צינור 15 מ"ל קר, לשטוף היטב עם 4 מ"ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA ולשים לתוך הצינור .
- מכניסים את הצינורות על קרח למשך 1-4 שעות ו להפוך את הצינור כמה פעמים עד שכל תאייםמטריקס נמס.
- צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 1,620 XG ב 0 ° C
- Re- להשעות את כדורי תא עם 1 מ"ל קר PBS לצינור 1.ml על הקרח.
- צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 3000 XG ב 0 מעלות צלזיוס, אז להשליך את supernatant.
- אחסן את התאים -80 מעלות צלזיוס.
Representative Results
ניכר, בריא היווצרות צינור אנדותל ניתן בניגוד בקלות היווצרות צינור עכבות בתמונות מיקרוסקופ. היווצרות צינור בריאה מופיעה כרשה מאורגנת של המבנים נימי דמוית (איור 1). לשם השוואה, היווצרות צינור עכבות בא לידי ביטוי כמו תאים מפוזרים (איור 2). נתוני assay היווצרות צינור הוא לכמת על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות נימים (טבלה 1). מלבד אורך הצינור הכולל, אורך צינור הממוצע, המספר הכולל של צינורות, או המספר הכולל של נקודות הסניף ניתן למדוד. היווצרות צינור מובני מניב אורך צינור נטו יותר מאשר צמיחת צינור עכבות מפוזרת. באיור 3, עקומת מנה תגובה מאפשר חישוב של IC 50 תחת תנאי הניסוי של HUVECs על תאי מטריקס GFR ו מעכב CXCR2 SB225002.
> 
איור 1. האנדותל t Ube היווצרות תא מטריקס והצמיחה מופחת גורם (GFR) מטריקס. שתי תמונות להראות היווצרות צינור מוצלחת על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הרשת מחוברת צינורות מראה בבירור כי הצמיחה של צינורות היא בריאה HUVECs אלה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. עיכוב של היווצרות צינור על-מופחת גורם תאי וצמיחה (GFR) תאי מטריקס ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר). שתי תמונות להראות צינורהיווצרות כי כבר מעוכבים על ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר) על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הגושים הבודדים של תאי HUVEC לראות להראות את התמונה כי התאים לא היו מסוגלים ליצור את צינורות הצורך להתחבר זה לזה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
מנת איור 3. עקומת תגובה על-מופחת גורם גדילה (GFR) מטריקס. ציר ה- X מראה אורך צינור ואת ציר Y מראה את ריכוז מעכב CXCR2. עקומת מנת התגובה מראה כי תגובת HUVEC לבולמי CXCR2 על תאי מטריקס GFR תלויה במינון. IC 50 (המעכב מקסימאלי וחציריכוז y) חושב באמצעות תוכנת 13 וניתן לעומת עקומת מנת תגובה עבור מטריקס, למשל. IC 50 הוא ריכוז מעכב כי מקטין את התגובה ל -50%. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן.
| Growth Factor המופחת (GFR) תאי מטריקס ו מעכב (4 משכפל כל אחד) | סה"כ Tube אורך ממוצע (פיקסלים) (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר) | סטיית תקן | P ערך |
| GFR מלא תאי מטריקס | 2447 | 168.174 | |
| GFR תאי מטריקס + 0.56 מיקרומטר SB225002 | 1422.5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR תאי מטריקס + 1.1 מיקרומטר SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2.14 x 10 -5 |
| GFR תאי מטריקס + 5.6 מיקרומטר SB225002 | 519.25 | 129.6368 | 4.19 x 10 -6 |
| GFR תאי מטריקס + 11 מיקרומטר SB225002 | 393.75 | 212.6857 | 1.21 x 10 -5 |
טבלת 1. כימותי אורכי צינור מוחלטים על צמיחה מופחתת גורם (GFR) מטריקס בתנאים משתנים. חלק של טבלה באמצעות אורכי צינור הכוללת שנרשמו דגימות גדלו על תאי מטריקס GFR עם ריכוזים שונים של מעכב CXCR2. מן הנתונים עולה כי מעכב CXCR2 עושה לעכב היווצרות צינור. הוצאות כוללים ערכים הקשורים כגון ממוצע של ארבע חזרות, סטיית התקן, וערך P. נמדד בפיקסלים להראותהנתונים מיוצאים. ניתן לחשב 50 IC באמצעות תוכנה סטטיסטית 13. (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר)
Discussion
מתי לבצע assay זה, זה הכרחי כדי לשמור על תאי מטריקס על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת, אלא אם כן צוין אחרת. אם תאי מטריקס מותר לחמם מעל 4 מעלות צלזיוס, זה יהיה לפלמר, ואת assay ייהרס. כמו כן, חשוב להבטיח שכל דבר בא במגע (למשל, טיפים pipet, צלחת) עם תאי מטריקס היא מראש מקורר מהסיבה הנ"ל. מספר תאי זרע בכל טוב הוא קריטי, מעט מדי תאים לא ינתנו באינטרנט הצפוי במדגם השליטה, יותר מדי תאים יהוו צבירי תאים גדולים או בשכבה ואת assay לא יהיה תוקף. גורם חשוב נוסף בהצלחת assay זהו המספר מעבר התא של HUVECs. המספר מעבר תמיד צריך להיות נמוך מעשרה, אחרת היווצרות צינור חזקה עשויה שלא להתרחש. בנוסף, יש לוודא, כי מדיום תרבית תאים בשימוש לא פג, או התאים לא יהיו בת קיימא. Alternatively, אפשר aliquot המדיום ומרכיביו ולאחסן אותם ב -20 ° C לשמר לתקופה של זמן לאחר תאריך התפוגה. כמובן, זה עדיין עדיף להשתמש במדיום לפני מועד התפוגה
כמו כל הנהלים, יש כמה חסרונות ביצוע assay היווצרות צינור תא האנדותל. אחת הבעיות הגדולות היא, כי ישנם סוגים שונים של תאי אנדותל ומטריצות תמיכה, התוצאות של assay יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג של התא מטריצה משמש. לתאי אנדותל בשימוש (HUVECs, HAECs או HMVECs) הם תאים ראשוניים, הם יקרים כדי לקבל ויש השתנות לעומת תאים הונצח. התאים הראשוניים יש קטעים מוגבלים לשימוש, ולכן אינם מתאימים לניסויים אנגיוגנזה לטווח ארוך 14. לקבלת נתונים אמינים, אחד תמיד צריך להשתמש את אותם סוגים עבור assay. כמו עם אחרים מבחני חוץ גופית, התוצאות של assay היווצרות צינור צריך להיות conוייצב vivo, כי תוצאות של בתנאים המבוקרים ומלאכותיים של תרביות רקמה דו ממדים לא תמיד להשתקף biosystem המורכב של אורגניזם חי. כמו כן, חשוב לזכור כי זה סוג של assay ניתן להשתמש רק כדי להדגים היווצרות צינור תא האנדותל, ולא צריך לשמש כדי לבדוק אחרים, שאינם אנדותל, תאי להרכיב צינור.
assay זוהי שיטה פשוטה ומהירה למדי לכמת פוטנציאל angiogenic של תרכובת. היא גם יוצרת פלטפורמה עבור ניסויים נוספים, כמו לבד, זה לא להניב מידע לגבי המנגנון הספציפי שבו למתחם למעשה משפיע על תהליך גיבוש הכלי. עם זאת, השימוש של מטריצות תאיות מגוונות היא דוגמא כיצד להמשיך ליצור מסגרת שאלות מחקר אשר אינו נפוצה. ישנן גישות כדי לחקור את המנגנונים ביו-כימיות הספציפיות של המתחם כולל מעכבים ספציפיים למקד מרכיביםמסלול אנגיוגנזה. גישה אחרת עשויה להיות לחלץ RNA מתאי אנדותל ולהשתמש RT-PCR (Real Time PCR) 12 לנתח שינויים של ביטוי גנים אשר עלול לגרום להתנהגות צמיחה שנצפתה assay. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים טרנספקציה HUVECs ליצור מבחנים לדפוק למטה לצעדים ספציפיים של מסלול אנגיוגנזה. קיים פוטנציאל ליישם את הגישה הזאת כדי ללמוד את מסלול lymphangiogenesis. על ידי שינוי הרכיבים התאים מטריקס, האינטראקציה של מטריקס תהליך הסלולר התומכים אנגיוגנזה בסרטן ניתן הובהר נוספת. הפקת רנ"א וחלבונים מתא אנדותל בתנאים מסוימים אלה מספקות נתונים מדידים נוספים מתאימים הדמית נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
