Introduction
Afin d'obtenir les éléments nutritifs nécessaires à la survie, les tumeurs malignes nécessitent l'accès à la circulation sanguine du patient. Pour que l' accès, les cellules tumorales libèrent des signaux chimiques qui stimulent la croissance de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur, détournant ainsi le processus physiologique normal appelé angiogenèse 2. Il est également à travers les vaisseaux sanguins créés par une angiogenèse que les métastases ( par exemple, la propagation du cancer à d' autres organes) peuvent se produire. Comme le processus de l' angiogenèse est vitale pour la progression d'une grande variété de cancers, il est une cible intéressante pour la recherche de thérapie anticancéreuse 3.
Une méthode utilisée pour quantifier l'angiogenèse consiste à mesurer la capacité de la cellule progénitrice endothéliale pour former des tubes lorsqu'ils sont placés sur une matrice extracellulaire. Parce que la formation de ces tubes est une première étape critique dans l' angiogenèse, tester les conditions environnementales (par exemple, la présence ou l' absence d'un co donnémpound) qui peut stimuler ou inhiber la formation de tubes donne un aperçu des étapes spécifiques qui peuvent être ciblés pour inhiber l'angiogenèse. L'essai de formation de tubes de cellules endotheliales est l' un des 4 méthodes les plus couramment utilisés in vitro qui mesure la capacité des cellules à former des tubes. Il est un test simple, nécessitant relativement peu de composants et une période de culture courte 5. Peut-être le plus important, cependant, est que les données obtenues à partir de ce type de test est quantifiable.
Un exemple de l'utilisation du test de formation de tubes consiste à comparer le développement de tubes à partir de cellules endotheliales vasculaires cultivées sur la matrice extracellulaire par rapport à facteur de croissance réduit (TFG) de la matrice extracellulaire. La matrice extracellulaire est une membrane en un matériau semblable au sous-sol isolé à partir des cellules de sarcome et de ses principaux composants sont laminine, collagène de type IV, les facteurs de croissance et des protéoglycanes. Certains composés ont des effets différents sur la capacité de la cellule pour former des tubes en cas deun environnement avec des facteurs de croissance réduite et des protéoglycanes de sulfate d'héparane (HSPG) réduit. HSPG sont un composant de la matrice extracellulaire, qui est significativement réduite dans GFR matrice extracellulaire. A titre d'exemple, si l'hypothèse est que les inhibiteurs d'angiogenèse, tels que SB225002, qui bloque le récepteur CXCR2, ont la capacité considérablement plus faible pour interrompre la formation du tube lorsque HSPG sont abondants, puis une comparaison entre l'activité de formation du tube dans une matrice extracellulaire et GFR matrice extracellulaire est importante dans l'exploration de la possibilité de l'inhibition de l'angiogenèse via le contrôle de HSPG.
D' autres dosages qui sont couramment utilisés pour déterminer les effets des composés sur l' angiogenèse sont des méthodes in vivo. Des exemples notables de ce sont le poussin membrane chorio (CAM) de dosage 6 en utilisant des oeufs de poulet, et in vivo Matrigel dans la fiche angiogenèse test 7 en utilisant des souris. Bien que les méthodes in vivo mesurent l' angiogenèse dans tdimensions ROIS et sont plus représentatifs du corps humain par rapport à l'essai in vitro de formation de tube, ils souffrent le défaut d'exiger beaucoup plus de temps et sont beaucoup plus difficiles à réaliser. À la fois l'essai CAM et le dosage du bouchon extracellulaire de prendre au moins une semaine 8 pour le faire, alors que dans la comparaison, l'essai de formation de tubes peut être réalisé en une seule journée et il ne nécessite pas l' utilisation des animaux.
Il est important de noter que les cellules endothéliales utilisées dans ce rapport sont des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Ces cellules jouent un rôle clé dans la croissance et la pousse vasculaire des vaisseaux sanguins et sont suffisamment analogues aux cellules endothéliales dans les cancers à être utilisé pour évaluer l' activité anti-angiogenèse à la fois in vitro et in vivo des expériences 9. D'autres cellules telles que les cellules endothéliales microvasculaires primaires peuvent également être utilisés.
Il est également important de noter que, en plus d'avoir inférieurniveaux de HSPG, la matrice extracellulaire GFR aussi a réduit les niveaux de nombreux composants par rapport à la matrice extracellulaire normale. Cela inclut, mais sans s'y limiter: l'EGF, l'IGF-1, PDGF et TGF-bêta. Ces expériences performantes qui étudient l'importance de ces composés par rapport à l'angiogenèse peuvent être intéressés à utiliser GFR matrice extracellulaire.
Protocol
1. Culture cellulaire
- Semences 3x10 5 cellules HUVEC dans 10 ml de milieu de croissance complet 10 dans un flacon de 75 cm.
- Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO2 à 70-80% de confluence.
2. Tubule Formation Assay
- Décongeler soit le facteur réduit (GFR) matrice extracellulaire de croissance ou de la matrice extracellulaire normale pendant la nuit sur la glace à 4 ° C.
Remarque: Pour des raisons de concision «matrice extracellulaire» sera désormais utilisé pour faire référence à la fois GFR et la matrice extracellulaire normale. Le processus pour les préparer est identique. - Conserver les plaques de culture à 96 puits sur la glace, et ajouter 50 ul de matrice extracellulaire refroidi par puits en utilisant des conseils pré-refroidi. Préparer triplée de 5 puits ne contenant que la matrice extracellulaire normale. Préparer une autre triplée de 5 puits ne contenant que GFR matrice extracellulaire.
- Incuber la plaque à 96 puits à 37 ° C pendant 30 min.
- Laver le HUVECune fois avec une solution tamponnée au phosphate sans calcium et magnésium (PBS) et ajouter 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA. Incuber le plat à 37 ° C pendant 1-5 min, vérifier les cellules toutes les minutes jusqu'à ce que la plupart des cellules complètent. Déloger les cellules en tapant sur le ballon une fois.
- Ajouter 5 ml de milieu de base (c. -à- milieu de croissance des cellules endothéliales sans rien (par exemple, des suppléments) ajoutés) avec 1% de sérum bovin fœtal (FBS). Recueillir les cellules dans le flacon par pipetage et transférer dans un tube de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min et jeter le surnageant.
- Re-suspendre avec 2 ml de milieu basal, compter les cellules en utilisant un hémocytomètre, et ajuster la concentration cellulaire à 2-3 x 10 5 cellules / ml.
- 100 ul de la préparation 10x concentrations d'inhibiteurs de CXCR2 SB225002 suivants dans un milieu de base: 11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 pM et 0 pM (témoin).
- Pipeter 300 pi de la suspension HUVEC dans chaque 5 micrtubes ocentrifuge. Ajouter 33 ul de la concentration d'inhibiteur (11 uM, 5,6 uM, 1,1 uM, 0,56 pM et 0 pM) dans un tube contenant chacune HUVEC et vortex.
- Introduire à la pipette 50 ul de chacune des suspensions cellulaires (1-1,5 x 10 4 cellules) à des puits individuels de la matrice extracellulaire. Chaque plaque de suspension en triple exemplaire et incuber pendant 4-16 heures à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Après 4-16 h, prendre 4 photos des tubes formés par puits en utilisant une caméra de microscope inversé 11 (grossissement x 100).
3. Tubule Perturbation Assay
- Préparer la matrice extracellulaire et des plaques selon les mêmes spécifications que le tube de formation de dosage (étapes 02.01 à 02.03).
- Préparer HUVEC suspension comme décrit dans les étapes 2.4- 2.4.2 du Tube Formation Assay et aliquote dans une plaque à 96 puits contenant la matrice extracellulaire à 50 pi par puits.
Note: Plaque assez puits so qu'il y a 3 puits par traitement médicamenteux. - Faire croître des cellules sur la matrice extracellulaire pendant 4 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Prenez des photos avant le début du traitement médicamenteux.
- Préparer des concentrations 2x du CXCR2 inhibiteur SB225002 comme décrit à l'étape 2.5 de l'essai Tube de formation, et ajouter 50 ul de chaque concentration par puits de la plaque de 96 puits contenant le HUVEC. Plaque chaque concentration en triple.
- Incuber la plaque pendant une heure à 37 2-12 ° C, 5% de CO 2. Prendre 4 images des tubes formés dans chaque puits à l' aide d' une caméra de microscope inversé (grossissement x 100) 11.
4. Quantification des données
- Évaluer la formation de tubes capturée dans les images en mesurant la longueur totale du tube de tubes dans quatre champs microscopiques aléatoires en utilisant le logiciel de la caméra du microscope.
- Ouvrez l'image dans le logiciel de la caméra de microscope, et cliquez sur «Annotations et mesures9 ;. Dans la section «longueur», sélectionnez l'outil «simple ligne». Cliquez sur l'image, puis tracer une ligne le long de la longueur du tube, puis cliquez à droite.
Remarque: Le logiciel calcule automatiquement la longueur de la ligne en pixels et de mettre les données dans un fichier. - Répétez la procédure pour toutes les lignes de métro dans l'image en sélectionnant l'outil «simple ligne». Cliquez sur l'image, puis tracer une ligne le long de la longueur du tube, puis cliquez à droite.
Remarque: Le logiciel enregistre la longueur de chaque ligne et afficher les données sur l'écran. - Après la mesure de chaque tube dans l'image, cliquez sur "Exporter", puis choisissez 'Longueur de la feuille de calcul ».
Remarque: Les données de longueur seront exportés vers un tableur. - Ajouter toutes les longueurs de tube à partir de la feuille de calcul pour obtenir la longueur totale du tube. Calculer et enregistrer la longueur moyenne des tubes.
Remarque: Quatre répétitions sont recommandés avec moyenne et écart-type déterminé.
5. Les cellules Récupération de la matrice extracellulaire Culture
- Culture et effectuer un essai de formation de tube (voir la section 2) sur une plus grande échelle en tant que plaque de 96 puits ne donnera pas le nombre de cellules suffisant. Pour les plaques à 12 puits, en utilisant 500 pl de la matrice extracellulaire et 500 ul de la suspension de cellules HUVEC (1,5x10 5 cellules).
- Incuber les cellules pendant 4-16 h afin de former des tubes. Ensuite, aspirer le milieu de culture cellulaire. Rincer les cellules avec 1 ml de PBS froid 1x sans calcium et magnésium.
- Ajouter 1 ml de tampon mM EDTA de PBS glacé-2,5 sur la culture et garder sur la glace pendant 10 min.
- Déloger les cellules et le mélange de la matrice extracellulaire du plat en utilisant une pointe de pipette 1000 pi avec la pointe coupée, puis transférer à un tube de 15 ml à froid, laver le puits avec 4 ml de glace froide mM EDTA PBS-2,5 et de mettre dans le tube .
- Mettez les tubes sur la glace pendant 1-4 h et inverser le tube plusieurs fois jusqu'à ce que tous les extracellulairela matrice est dissoute.
- Centrifuger pendant 10 min à 1620 xg à 0 ° C
- Remettre en suspension les culots cellulaires avec du PBS froid 1 ml dans un tube à 1.ml sur la glace.
- Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 3000 xg à 0 ° C, puis éliminer le surnageant.
- Stocker les cellules à -80 ° C.
Representative Results
Considérables, la formation du tube endothélial sain peut facilement être mise en contraste à la formation du tube inhibée dans les images de microscopie. La formation du tube sain apparaît comme une bande organisée des structures de type capillaire (figure 1). A titre de comparaison, la formation du tube inhibé se manifeste sous forme de cellules dispersées (figure 2). Tube de données d'essai de formation est quantifiée en mesurant la longueur totale du tube de tubes capillaires (tableau 1). Outre la longueur totale du tube, la longueur moyenne du tube, le nombre total de tubes, ou le nombre total de points de branchement peuvent être mesurés. la formation du tube structuré donne une plus grande longueur de tube de filet que la croissance dispersée du tube inhibé. Sur la figure 3, une courbe dose - réponse permet le calcul de l' IC 50 dans les conditions expérimentales de HUVEC sur GFR matrice extracellulaire et un inhibiteur de CXCR2 SB225002.
Figure 1. endothéliale formation t ube sur la matrice extracellulaire et le facteur de réduction (DFG) la matrice extracellulaire de croissance. Deux images montrent la formation de tubes avec succès sur la matrice extracellulaire (A) et GFR matrice extracellulaire (B). Le réseau de tubes interconnectés montre clairement que la croissance des tubes est saine dans ces cellules HUVEC. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Inhibition de la formation de tube sur extracellulaire et le facteur de croissance réduit (TFG) de la matrice extracellulaire par un SB225002 inhibiteur de CXCR2 (5,6 uM). Deux images montrent le tubela formation qui a été inhibée par un inhibiteur de SB225002 CXCR2 (5,6 uM) sur la matrice extracellulaire (A) et GFR matrice extracellulaire (B). Les touffes isolées de cellules HUVEC vu dans cette image montrent que les cellules ne sont pas en mesure de former les tubes nécessaires pour se connecter les uns aux autres. Barre d'échelle = 10 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3 Courbe dose de réponse du facteur de réduction (DFG) la matrice extracellulaire de croissance. L'axe des abscisses représente la longueur du tube et l'axe des ordonnées représente la concentration d'un inhibiteur de CXCR2. La courbe dose-réponse indique que la réponse des cellules HUVEC à l'inhibiteur de CXCR2 sur GFR matrice extracellulaire est dose-dépendante. Le (inhibiteur de la moitié maximale IC50la concentration y) a été calculée en utilisant le logiciel 13 et peut être comparée à une courbe dose - réponse pour la matrice extracellulaire, par exemple. IC50 est la concentration de l'inhibiteur qui diminue la réponse à 50%. Les barres d'erreur représentent l'écart type.
| Facteur de croissance réduit (GFR) matrice extracellulaire et de l' inhibiteur (4 reproduit chacun) | Total Tube longueur moyenne (pixels) (1 pixel = 0,34 um) | standard Deviation | P Valeur |
| GFR contrôle de la matrice extracellulaire | 2447 | 168,174 | |
| GFR matrice extracellulaire + 0,56 uM SB225002 | 1422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR matrice extracellulaire + 1,1 uM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2,14 x 10 -5 |
| GFR matrice extracellulaire + 5,6 uM SB225002 | 519.25 | 129.6368 | 4,19 x 10 -6 |
| GFR matrice extracellulaire + 11 uM SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1,21 x 10 -5 |
Tableau 1. Quantification des longueurs de tubes totaux sur le facteur de croissance réduit (DFG) une matrice extracellulaire dans des conditions variables. Une partie d'un tableau en utilisant des longueurs de tube enregistrées au total dans les échantillons cultivés sur GFR matrice extracellulaire avec des concentrations variables d'inhibiteurs de CXCR2. Les données indiquent que l'inhibiteur de CXCR2 le fait d'inhiber la formation du tube. Inclus valeurs associées telles que la moyenne des quatre répétitions, l' écart type et la valeur P sont. Mesurée en pixels pour montrerles données qui sont exportés. IC50 peut être calculé en utilisant le logiciel statistique 13. (1 pixel = 0,34 pm)
Discussion
Lors de la réalisation de cette analyse, il est essentiel de maintenir la matrice extracellulaire sur la glace ou à 4 ° C en tout temps, sauf indication contraire. Si la matrice extracellulaire se réchauffer au-dessus de 4 ° C, il va polymériser, et le test sera ruiné. Il est également important de veiller à ce que tout ce qui vient en contact (par exemple, les embouts de pipette, la plaque) avec la matrice extracellulaire est pré-refroidi pour la raison mentionnée ci - dessus. Le nombre de cellules ensemencées dans chaque puits est critique, trop peu de cellules ne donneront pas le web prévu dans l'échantillon de contrôle, trop de cellules se forment de grands amas de cellules ou une monocouche et l'essai ne seront pas valides. Un autre facteur important dans le succès de ce test est le nombre de passage de cellule de la HUVEC. Le nombre de passage doit toujours être inférieur à dix, sinon la formation du tube solide peut ne pas se produire. En outre, il faut veiller à ce que le milieu de culture cellulaire utilisé n'a pas expiré, ou les cellules ne sera pas viable. Alternativement, on peut aliquoter le moyen et ses composantes et de les stocker à -20 ° C pour conserver pendant une période de temps après la date d'expiration. Bien sûr, il est toujours préférable d'utiliser le moyen avant la date d'expiration
Comme toutes les procédures, il y a certains inconvénients à la conduite de l'essai de formation de tubes de cellules endotheliales. Un problème majeur est que, parce qu'il existe différents types de cellules endothéliales et les matrices de support, les résultats du dosage peuvent varier considérablement en fonction du type de cellule et de la matrice est utilisée. Les cellules endothéliales utilisées (HUVEC, HAECs ou HMVECs) sont des cellules primaires, ils sont coûteux à obtenir et ont la variabilité par rapport à des cellules immortalisées. Les cellules primaires sont des passages limités pour l' utilisation, et ne conviennent donc pas pour des expériences d'angiogenèse à long terme 14. Pour obtenir des données fiables, il faut toujours utiliser les mêmes types pour le dosage. Comme avec les autres essais in vitro, les résultats d'un essai de formation de tubes doivent être conraffermis in vivo, parce que les résultats des conditions contrôlées et artificielles de culture de tissus à deux dimensions ne peuvent pas toujours être pris en compte dans le biosystème complexe d'un organisme vivant. Il est également important de garder à l'esprit que ce type d'essai ne peut être utilisé pour démontrer la formation de tubes de cellules endothéliales, et ne doit pas être utilisé pour tester d'autres, non-endothéliales, les cellules du tube formant.
Ce test est une méthode assez simple et rapide pour quantifier le potentiel angiogénique d'un composé. Il constitue également une plate-forme pour d'autres expériences, comme seul, il ne donne pas d'informations en ce qui concerne le mécanisme précis par lequel le composé affecte en réalité le procédé de formage du récipient. Cependant, l'utilisation de matrices extracellulaires variées est un exemple de la façon de créer en outre un cadre pour les questions de recherche qui ne sont pas couramment utilisé. Il existe des approches pour l'étude des mécanismes biochimiques spécifiques du composé, y compris des inhibiteurs spécifiques qui ciblent des éléments dula voie de l'angiogenèse. Une autre approche pourrait consister à extraire l' ARN à partir des cellules endothéliales et en utilisant une RT-PCR en temps réel (PCR) 12 pour analyser les altérations de l' expression génique qui peut provoquer le comportement de croissance observée dans l'essai. Les futures applications de cette méthode comprennent transfectées HUVEC pour créer des essais knock-down pour les étapes spécifiques de la voie de l'angiogenèse. Il est possible d'appliquer cette approche pour étudier la voie de la lymphangiogenèse. En modifiant les composants de la matrice extracellulaire, l'interaction entre la matrice et le processus cellulaire supportant angiogenèse dans le cancer peut encore être élucidé. L'extraction de l'ARN et des protéines à partir de cellules endothéliales dans ces conditions spécifiques fournissent des données quantifiables supplémentaires correspondant à l'imagerie des données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
