Introduction
For at opnå de næringsstoffer er nødvendige for overlevelse, maligne tumorer kræver adgang til patientens blodbane. For at få denne adgang, tumorceller frigiver kemiske signaler, der stimulerer væksten af nye blodkar til svulsten, hvilket kapring den normale fysiologiske proces, der kaldes angiogenese 2. Det er også gennem blodkarrene skabt via angiogenese at metastase (dvs. spredning af kræft til andre organer) kan forekomme. Fordi processen med angiogenese er så afgørende for udviklingen af sådan en bred vifte af cancerformer, er det et attraktivt mål i anticancerterapi forskning 3.
En fremgangsmåde anvendes til at kvantificere angiogenese er at måle endothelial progenitor cellens evne til at danne rør når de anbringes på en ekstracellulær matrix. Fordi dannelsen af disse rør er et kritisk første skridt i angiogenese, prøvning miljøforhold (f.eks tilstedeværelse eller mangel på et givet compound), der kan stimulere eller inhibere kanaldannelse giver indsigt i specifikke trin, der kan målrettes til inhibering af angiogenese. Den endotelceller rør dannelse analysen er en af de mest udbredte 4 in vitro-metoder, der måler cellernes evne til at danne rør. Det er en enkel assay, der kræver relativt få komponenter og en kort dyrkningsperiode 5. Måske vigtigst, er imidlertid, at de data, der er opnået fra denne type assay er kvantificerbare.
Et eksempel på brugen af formationen rør assay involverer sammenligning af udvikling af rør fra vaskulære endotelceller dyrket på ekstracellulær matrix vs. vækstfaktor reduceres (GFR) ekstracellulære matrix. Den ekstracellulære matrix er en basalmembran-lignende materiale isoleret fra sarkom-celler og dets hovedkomponenter er laminin, type IV collagen, vækstfaktorer og proteoglycaner. Nogle forbindelser har forskellige virkninger på cellens evne til at danne rør når iet miljø med reducerede vækstfaktorer og reducerede heparansulfatproteoglycaner (HSPGs). HSPGs er en komponent af den ekstracellulære matrix, som signifikant reduceret i GFR ekstracellulære matrix. Som et eksempel, hvis den hypotese er, at angiogeneseinhibitorer, såsom SB225002, som blokerer CXCR2 receptor, har betydeligt svagere evne til at afbryde kanaldannelse når HSPGs er rigelige, så en sammenligning mellem formation rør aktivitet i ekstracellulær matrix og GFR ekstracellulær matrix er vigtigt at undersøge muligheden for angiogenese hæmning via kontrol af HSPGs.
Andre assays, som normalt bruges til at bestemme virkningerne af forbindelser på angiogenese er in vivo-metoder. Bemærkelsesværdige eksempler på dette er kyllingechorioallantoinmembranen (CAM) assay 6 under anvendelse hønseæg, og in vivo Matrigel plug angiogenese assay 7 under anvendelse mus. Mens in vivo metoder måler angiogenese i tEfter tre dimensioner og er mere repræsentative for den menneskelige krop sammenlignet med in vitro-dannelse assay lider de fejlen kræve betydeligt mere tid og er betydeligt vanskeligere at udføre. Både CAM-assayet og den ekstracellulære plug assayet tage mindst en uge 8 at gøre, mens i sammenligning kan dannelsen rør assayet gøres på en enkelt dag, og det kræver ikke brugen dyr.
Det er vigtigt at bemærke, at endothelceller anvendes i denne rapport er humane navlevene-endotelceller (HUVEC). Disse celler spiller en central rolle i vaskulær spire og vækst af blodkar, og er tilstrækkeligt analog til endotelceller i cancere, der skal anvendes til at vurdere anti-angiogenese aktivitet i både in vitro og in vivo forsøg 9. Andre celler, såsom primære mikrovaskulære endotelceller kan også anvendes.
Det er også vigtigt at bemærke, at ud over at have lavereniveauer af HSPGs har GFR ekstracellulære matrix også reducerede niveauer af mange komponenter sammenlignet med normale ekstracellulære matrix. Dette omfatter, men er ikke begrænset til: EGF, IGF-1, PDGF, og TGF-beta. Dem, der udfører eksperimenter studerer betydningen af disse forbindelser i forhold til angiogenese kan være interesseret i at bruge GFR ekstracellulære matrix.
Protocol
1. Cellekultur
- Seed 3x10 5 HUVEC-celler i 10 ml komplet vækstmedium 10 i en 75 cm kolbe.
- Cellerne inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2 til 70-80% konfluens.
2. tubulusdannelse Assay
- Tø enten vækstfaktoren-reduceret (GFR) ekstracellulær matrix eller normal ekstracellulær matrix natten over på is ved 4 ° C.
Note: For kortheds skyld 'ekstracellulære matrix' fremover vil blive anvendt til at henvise til både GFR og normal ekstracellulær matrix. Processen med at forberede dem er identisk. - Hold 96-brønds dyrkningsplader på is, og der tilsættes 50 pi kølet ekstracellulære matrix pr brønd med forafkølet tips. Forbered tre eksemplarer af 5 brønde indeholdende kun den normale ekstracellulære matrix. Forbered anden triplo af 5 brønde indeholdende kun GFR ekstracellulære matrix.
- Inkubér 96-brønds plade ved 37 ° C i 30 minutter.
- Vask HUVEC'erén gang med phosphatbufret opløsning uden calcium og magnesium (PBS), og der tilsættes 1 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkubér fadet ved 37 ° C i 1-5 minutter, kontrol cellerne hvert minut indtil de fleste celler runde op. Løsne cellerne ved kolben trykke en gang.
- Der tilsættes 5 ml basalt medium (dvs. endotelcellevækst-medium uden noget (f.eks supplementer) tilsat) med 1% kalvefosterserum (FBS). Opsamle cellerne i kolben ved pipettering og overførsel til et 15 ml rør. Centrifuger cellerne ved 200 xg i 5 min og kassér supernatanten.
- Resuspender med 2 ml basalt medium, tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer, og justere cellekoncentrationen til 2-3 x 10 5 celler / ml.
- Fremstilling af 100 pi af følgende 10x koncentrationer af CXCR2 inhibitor SB225002 i basalt medium: 11 pM, 5,6 pM, 1,1 pM, 0,56 pM og 0 uM (kontrol).
- Pipette 300 pi HUVEC suspensionen i hver 5 MICRocentrifuge rør. Tilføj 33 pi af inhibitorkoncentrationer (11 uM, 5,6 pM, 1,1 pM, 0,56 pM og 0 uM) i det ene rør hver indeholdende HUVEC'er, og vortex.
- Pipetter 50 pi af hver af cellesuspensionerne (1-1,5 x 10 4 celler) til individuelle brønde i ekstracellulær matrix. Plate hver suspension i tre eksemplarer og inkuberes i 4-16 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 4-16 timer, tage 4 billeder af rørene dannet per brønd ved hjælp af et omvendt mikroskop kamera 11 (original forstørrelse x 100).
3. tubulus Forstyrrelse Assay
- Forbered den ekstracellulære matrix og plader i henhold til de samme specifikationer som Tube Formation Assay (trin 2.1 til 2.3).
- Forbered HUVEC suspension som beskrevet i trin 2.4- 2.4.2 i Tube Formation Assay og alikvot i en 96-brønds plade indeholdende den ekstracellulære matrix på 50 pi per brønd.
Bemærk: Plate nok brønde so at der er 3 brønde pr lægemiddelbehandling. - Dyrk celler på ekstracellulære matrix i 4 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Tag billeder, før påbegyndelse af medicinsk behandling.
- Forbered 2x koncentrationer af CXCR2 inhibitor SB225002 som beskrevet i trin 2.5 i Tube Formation assay og der tilsættes 50 pi af hver koncentration pr brønd af 96-brønds plade indeholdende HUVEC'er. Plate hver koncentration i tre eksemplarer.
- Inkubér pladen i yderligere 2-12 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Tage 4 billeder af rørene dannet i hver brønd med et inverteret mikroskop kamera (oprindelig forstørrelse x 100) 11.
4. Kvantificering data
- Evaluere kanaldannelse fanget i billederne ved at måle den totale rørlængde på rør i fire tilfældige mikroskopiske felter ved hjælp af mikroskop kamera software.
- Åbn billedet i mikroskopet kamera software, og klik på 'anmærkninger og Målinger9 ;. Under 'længde' sektionen, vælge 'simpel linje' værktøj. Klik på billedet, derefter tegne en linje langs længden af røret, derefter højreklikke.
Bemærk: Softwaren vil automatisk beregne længden af linjen i pixels og sætte dataene i en fil. - Gentag proceduren for alle rør linjer i billedet ved at vælge "simpel linje 'værktøj. Klik på billedet, derefter tegne en linje langs længden af røret, derefter højreklikke.
Bemærk: Softwaren registrerer længden af hver linje og vise data på skærmen. - Efter måling hver rør i billedet, skal du klikke på 'Export', så valgte 'Længde til regneark ".
Bemærk: data De længde vil blive eksporteret til et regneark. - Tilføj alle rørlængder fra regnearket for at få den samlede rørlængde. Beregn og registrere den gennemsnitlige varighed af rørene.
Bemærk: Fire gentagelser anbefales med middelværdi og standardafvigelse bestemmes.
5. Gendannelse Celler fra den ekstracellulære matrix Kultur
- Kultur og udføre en formation rør assay (se afsnit 2) i større målestok som en plade med 96 vil ikke give tilstrækkelig celletal. For 12-brønds plader, bruge 500 pi ekstracellulær matrix og 500 pi af HUVEC cellesuspensionen (1,5x10 5-celler).
- Inkubér cellerne i 4-16 timer for at danne rør. Derefter aspireres celledyrkningsmediet. Kuvetterne skylles med 1 ml kold 1x PBS uden calcium og magnesium.
- Der tilsættes 1 ml iskold PBS-2,5 mM EDTA-buffer på kultur og holde på is i 10 min.
- Løsne cellerne og ekstracellulær matrix blanding fra skålen ved anvendelse af en 1.000 pi pipettespids med spids skåret af, og derefter overføre til en kold 15 ml rør, vaskes grundigt med 4 ml iskold PBS-2,5 mM EDTA og sat ind i røret .
- Sæt rørene på is i 1-4 timer og vend røret et par gange, indtil al ekstracellulærematrix er opløst.
- Centrifuger i 10 minutter ved 1.620 xg ved 0 ° C
- Re-suspendere cellepellets med 1 ml kold PBS til en 1.ml rør på is.
- Centrifuger igen i 5 minutter ved 3.000 x g ved 0 ° C, derefter sælge supernatanten.
- Opbevar cellerne i -80 ° C.
Representative Results
Betydelig, sund endotelrør-dannelse kan let ses i modsætning til inhiberede rør-dannelse i mikroskopi billeder. Sund rør-dannelse vises som en organiseret bane af de kapillære-lignende strukturer (figur 1). Til sammenligning inhiberede rør-dannelse manifesterer sig som spredte celler (figur 2). Tube formation assay data kvantificeres ved at måle den totale rørlængde på kapillarrør (tabel 1). Udover samlede rørlængde, kan den gennemsnitlige rør længde, samlede antal rør, eller det samlede antal filialer punkter måles. Struktureret rør-dannelse giver større netto rørlængde end spredt hæmmet vækst rør. I figur 3 en dosisreaktionskurve tillader beregning af IC50 under de eksperimentelle betingelser i HUVEC'er på GFR ekstracellulær matrix og en CXCR2 inhibitor SB225002.
Figur 1. Endothelial t Ube formation på ekstracellulær matrix og vækstfaktor-reduceret (GFR) ekstracellulære matrix. To billeder viser vellykket rør formation på ekstracellulær matrix (A) og GFR ekstracellulære matrix (B). Det sammenkoblede netværk af rør viser klart, at væksten af rørene er sundt i disse HUVEC'er. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Inhibering af rør-dannelse på ekstracellulær og vækstfaktor-reduceret (GFR) ekstracellulær matrix ved en CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 uM). To billeder viser rørformation, der er blevet inhiberet af en CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 uM) på ekstracellulær matrix (A) og GFR ekstracellulære matrix (B). De isolerede klumper af HUVEC-celler ses i billedet viser, at cellerne ikke var i stand til at danne rørene er nødvendige for at oprette forbindelse til hinanden. Scale bar = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Dosis-respons-kurve på vækstfaktor-reduceret (GFR) ekstracellulære matrix. X-aksen viser rørlængde og Y-aksen viser koncentrationen af en CXCR2 inhibitor. Dosisresponskurven viser, at HUVEC reaktion på CXCR2 inhibitoren på GFR ekstracellulær matrix er dosisafhængig. IC50 (halv maksimal inhibitory koncentration) blev beregnet ved hjælp af software 13 og kan sammenlignes med en dosisresponskurve for ekstracellulær matrix, f.eks. IC50 er den koncentration af inhibitoren, der reducerer responset på 50%. Fejl- søjler repræsenterer standardafvigelse.
| Vækstfaktor Reduceret (GFR) ekstracellulær matrix og inhibitor (4 replikater hver) | Samlet Tube Længde Gennemsnit (pixels) (1 pixel = 0,34 um) | Standardafvigelse | P Value |
| GFR ekstracellulær matrix kontrol | 2447 | 168,174 | |
| GFR ekstracellulære matrix + 0,56 uM SB225002 | 1422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR ekstracellulære matrix + 1,1 uM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2,14 x 10 -5 |
| GFR ekstracellulære matrix + 5,6 uM SB225002 | 519,25 | 129.6368 | 4.19 x 10 -6 |
| GFR ekstracellulære matrix + 11 uM SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1,21 x 10 -5 |
Tabel 1. Kvantificering af total længder rør om vækst faktor-reduceret (GFR) ekstracellulære matrix under varierende betingelser. En del af en tabel ved hjælp af total rørlængder optaget i prøver dyrket på GFR ekstracellulære matrix med forskellige koncentrationer af CXCR2-inhibitor. Dataene indikerer, at CXCR2 inhibitor hæmmer dannelse rør. Inkluderet er forbundet værdier som gennemsnittet af fire gentagelser, standardafvigelse, og P-værdi. Målt i pixels at visede data, der eksporteres. IC 50 kan beregnes ved hjælp af statistisk software 13. (1 pixel = 0,34 um)
Discussion
Ved udførelse af dette assay er det vigtigt at holde den ekstracellulære matrix på is eller ved 4 ° C hele tiden medmindre andet er angivet. Hvis den ekstracellulære matrix opvarmes over 4 ° C, vil det polymerisere, og analysen vil blive ødelagt. Det er også vigtigt at sikre, at noget, der kommer i berøring (f.eks pipettespidser er pladen) med den ekstracellulære matrix er forafkølet til ovennævnte grund. Antallet af celler udsået i hver brønd er kritisk, vil for få celler ikke give den forventede bane i kontrolprøven, for mange celler vil danne store celleklynger eller et monolag, og assayet ikke gyldig. En anden vigtig faktor for succes i denne analyse er den celle passage nummer HUVEC'er. Passagen nummer skal altid være mindre end ti, ellers robust rør-dannelse kan ikke forekomme. Desuden bør man sørge for, at cellekulturmediet bruges ikke er udløbet, eller cellerne vil ikke være levedygtig. alternatlukkende, kan en aliquot mediet og dets komponenter og opbevar dem ved -20 ° C til bevaring i en tidsperiode efter udløbsdatoen. Selvfølgelig er det dog at foretrække at anvende medium før udløbsdatoen
Som alle procedurer, der er nogle ulemper ved at gennemføre den endotelcelle kanaldannelse assay. Et stort problem er, at, fordi der findes forskellige typer af endotelceller og bærermatrixer, kan resultaterne af assayet variere meget afhængigt af den anvendte type celle og matrix. De endotheliale celler, der anvendes (HUVEC'er, HAECs eller HMVECs) er primære celler, de er dyre at få og have variabilitet sammenlignet med immortaliserede celler. De primære celler har begrænsede passager til brug, og er derfor ikke egnet til langsigtede angiogenese eksperimenter 14. For pålidelige data, bør man altid bruge de samme typer for analysen. Som med andre in vitro-analyser, bør resultaterne af en formation rør assay være conbekræftet in vivo, fordi resultaterne fra de kontrollerede og kunstige betingelser for todimensional vævskultur ikke altid kan være afspejlet i den komplekse biosystemet af en levende organisme. Det er også vigtigt at huske på, at denne type assay kun kan anvendes til at påvise endotelcelle rør-dannelse, og bør ikke anvendes til at teste andre, ikke-endotel- rør dannende celler.
Dette assay er en ret simpel og hurtig metode til at kvantificere angiogene potentiale af en forbindelse. Det danner også en platform til yderligere forsøg, som alene, betyder det ikke give oplysninger om den særlige fremgangsmåde, hvorved forbindelsen faktisk rammer fartøjet formningsprocessen. Men brugen af varierede ekstracellulære matricer er et eksempel på, hvordan man yderligere skabe en ramme for forskning spørgsmål, som ikke er almindeligt anvendt. Der er fremgangsmåder til at undersøge specifikke biokemiske mekanismer af forbindelsen herunder specifikke inhibitorer, der er målrettet komponenter afangiogenese pathway. En anden fremgangsmåde kan være at ekstrahere RNA fra endotelcellerne og bruge RT-PCR (Real Time PCR) 12 til at analysere ændringer i genekspression, som kan forårsage væksten opførsel observeret i assayet. Fremtidige anvendelser af denne fremgangsmåde indbefatter transficeret HUVEC'er at skabe knock-down assays for specifikke trin i angiogenese pathway. Der er potentiale for at anvende denne metode til at studere lymfangiogenese vej. Ved at ændre de ekstracellulære matrixkomponenter, kan interaktionen mellem matrix og cellulær proces understøtter angiogenese i cancer blive yderligere belyst. Udvinding af RNA og proteiner fra endothelceller under disse særlige betingelser give yderligere kvantificerbare data svarende til billeddata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
