Introduction
I syfte att erhålla de näringsämnen som är nödvändiga för överlevnad, maligna tumörer kräver tillgång till patientens blodström. Att få att tillgång, tumörceller frigör kemiska signaler som stimulerar tillväxten av nya blodkärl till tumören och därmed kapa den normala fysiologiska process som kallas angiogenes 2. Det är också genom blodkärlen som skapas via angiogenes att metastaser (dvs spridning av cancer till andra organ) kan förekomma. Eftersom processen av angiogenes är så avgörande för utvecklingen av en sådan mängd olika cancerformer, är det ett attraktivt mål i cancerbehandling forskning 3.
En metod som används för att kvantifiera angiogenes är att mäta den endoteliala progenitorceller cellens förmåga att bilda rören när de placeras på en extracellulär matris. Eftersom bildningen av dessa rör är ett kritiskt tidigt steg i angiogenes, testa miljöförhållanden (t.ex. närvaro eller avsaknad av en viss compound) som kan stimulera eller hämma rör bildning ger en inblick i specifika åtgärder som kan riktas för att hämma angiogenes. Endotelceller röret bildningsanalys är ett av de mest använda 4 in vitro-metoder som mäter cellernas förmåga att bilda rören. Det är en enkel assay, som kräver relativt få komponenter och en kort odlingsperiod 5. Kanske viktigast av allt är dock att de uppgifter som erhållits från denna typ av analys är mätbara.
Ett exempel för användningen av röret bildningsanalys involverar att jämföra utvecklingen av rören från vaskulära endotelceller odlade på extracellulära matrisen vs. tillväxtfaktor minskas (GFR) extracellulära matrisen. Den extracellulära matrisen är en basalmembranliknande material isolerat från sarkomceller och dess huvudkomponenter är laminin, typ IV-kollagen, tillväxtfaktorer och proteoglykaner. Vissa föreningar har olika effekter på cellens förmåga att bilda rören när de är ien miljö med minskade tillväxtfaktorer och minskade heparansulfatproteoglykaner (HSPGs). HSPGs är en komponent i den extracellulära matrisen som avsevärt reduceras i GFR extracellulära matrisen. Som ett exempel, om hypotesen är att angiogeneshämmare, såsom SB225002, som blockerar CXCR2 receptor, har betydligt svagare förmåga att avbryta rörbildning när HSPGs är riklig, sedan en jämförelse mellan rörbildning aktivitet i extracellulär matrix och GFR extracellulär matris är viktigt att utforska möjligheten att angiogeneshämning via kontrollen över HSPGs.
Andra analyser som vanligen används för att bestämma effekterna av föreningar på angiogenes är in vivo-metoder. Noterbara exempel på detta är chick korioallantoinmembranet (CAM) -analys 6 med hjälp av hönsägg, och in vivo Matrigel plug angiogenes analys 7 med hjälp av möss. Medan in vivo metoder mäter angiogenes i tRE dimensioner och är mer representativ för den mänskliga kroppen jämfört med den vitro rörbildning analysen in, lider de felet att de kräver betydligt mer tid och är betydligt svårare att utföra. Både CAM-analysen och den extracellulära plug-analysen tar minst en vecka 8 att göra, medan i jämförelse, kan röret bildningsanalys göras på en enda dag och det kräver inte användningen av djur.
Det är viktigt att notera att de endoteliala cellerna som används i denna rapport är humana navelvenendotelceller (HUVEC). Dessa celler spelar en viktig roll i vaskulär grodd och tillväxt av blodkärl, och är tillräckligt analog till endotelceller i cancer som ska användas för att utvärdera anti-angiogenes aktivitet både in vitro och in vivo experiment 9. Andra celler såsom primära mikrovaskulära endotelceller, kan också användas.
Det är också viktigt att notera att förutom att ha lägrenivåer av HSPGs har GFR extracellulära matrisen också reducerade nivåer av många komponenter i jämförelse med normala extracellulära matrisen. Detta inkluderar, men är inte begränsat till: EGF, IGF-1, PDGF, och TGF-beta. De utför experiment som studerar betydelsen av dessa föreningar i förhållande till angiogenes kan vara intresserade av att använda GFR extracellulära matrisen.
Protocol
1. Cellodling
- Seed 3x10 5 HUVEC-celler i 10 ml fullständigt tillväxtmedium 10 i en 75 cm kolv.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 till 70-80% konfluens.
2. kanalbildning Assay
- Tina antingen tillväxtfaktorn reducerade (GFR) extracellulär matris eller normal extracellulär matris över natten på is vid 4 ° C.
Obs! För enkelhetens skull "extracellulära matrix" hädanefter kommer att användas för att referera till både GFR och normal extracellulära matrisen. Processen för att framställa dem är identiska. - Hålla 96-brunnars odlingsplattor på is, och tillsätt 50 | il av kyld extracellulär matris per brunn med användning av pre-kyld tips. Förbered tre exemplar av 5 brunnar innehållande endast den normala extracellulära matrisen. Förbered en annan tre exemplar av 5 brunnar innehållande endast GFR extracellulära matrisen.
- Inkubera 96-brunnars platta vid 37 ° C under 30 min.
- Tvätta HUVECen gång med fosfatbuffrad lösning utan kalcium och magnesium (PBS), och tillsätt 1 ml 0,05% trypsin-EDTA. Inkubera skålen vid 37 ° C under 1-5 min, kontroll av cellerna varje minut tills de flesta celler runda upp. Rubba cellerna genom att trycka kolven en gång.
- Tillsätt 5 ml basmedium (dvs endotelcelltillväxt medium utan något (t.ex. tillägg) tillsatt) med 1% fetalt bovint serum (FBS). Samla upp cellerna i kolven genom pipettering och överför till ett 15 ml rör. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 5 min och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera med 2 ml basmedium, räkna cellerna med en hemocytometer, och justera cellkoncentrationen till 2-3 x 10 5 celler / ml.
- Förbered 100 pl av följande 10x koncentrationer av CXCR2 inhibitor SB225002 i basalt medium: 11 ^ M, 5,6 ^ M, 1,1 ^ M, 0,56 | iM och 0 iM (kontroll).
- Pipettera 300 ul av HUVEC suspensionen i varje 5 microcentrifuge rör. Lägg 33 pl koncentrationer inhibitor (11 ^ M, 5,6 ^ M, 1,1 ^ M, 0,56 | iM och 0 ^ M) i ett rör vardera innehållande HUVEC, och skaka.
- Pipettera 50 | il av var och en av cellsuspensionerna (1-1,5 x 10 4 celler) till enskilda brunnar i extracellulära matrisen. Platta varje suspension i triplikat och inkubera i 4-16 h vid 37 ° C, 5% CO2.
- Efter 4-16 timmar, ta 4 bilder av rören som bildats per brunn med ett inverterat mikroskop kamera 11 (ursprunglig förstoring x 100).
3. tubuli Disruption Assay
- Förbered den extracellulära matrisen och plattor enligt samma specifikationer som Tube Formation analys (steg från 2,1 till 2,3).
- Förbereda HUVEC suspension såsom beskrivits i stegen 2.4- 2.4.2 i Tube Formation Assay och alikvot in i en 96-brunnars platta innehållande den extracellulära matrisen vid 50 | j, l per brunn.
Obs: Plate tillräckligt brunnar so att det finns 3 brunnar per läkemedelsbehandling. - Växa celler på extracellulära matrisen under 4 h vid 37 ° C, 5% CO2. Ta bilder innan initiering av läkemedelsbehandling.
- Förbereda 2x koncentrationer av inhibitorn SB225002 CXCR2 såsom beskrivits i steg 2.5 i Tube Formation analys, och tillsätt 50 | il av varje koncentration per brunn i 96-brunnsplatta innehållande HUVEC. Plate varje koncentration i tre exemplar.
- Inkubera plattan under ytterligare 2-12 h vid 37 ° C, 5% CO2. Ta 4 bilder av rören som bildats i varje brunn med ett inverterat mikroskop kamera (ursprunglig förstoring x 100) 11.
4. Kvantifiera Data
- Utvärdera rörbildning fångas i bilderna genom att mäta den totala rörlängden rör i fyra slump mikroskopiska fält med hjälp av mikroskopkamera programvara.
- Öppna bilden i mikroskopkamera programvara, och klicka på "Anteckningar och mätningar9 ;. Enligt "längd", välj "enkel linje" verktyg. Klicka på bilden, sedan dra en linje längs med röret, sedan högerklicka.
Obs: Programvaran kommer automatiskt att beräkna längden på linjen i pixlar och sätta in data i en fil. - Upprepa proceduren för alla tunnelbanelinjer i bilden genom att välja "enkel linje" verktyg de. Klicka på bilden, sedan dra en linje längs med röret, sedan högerklicka.
Obs: Programvaran kommer att registrera längden av varje rad och visa data på skärmen. - Efter mätning varje rör i bilden, klicka på "Export", sedan valde 'Längd till kalkylblad.
Obs: Data längd kommer att exporteras till ett kalkylblad. - Lägg alla rörlängder från kalkylbladet att få den totala rörlängden. Beräkna och registrera den genomsnittliga längden av rören.
Obs: Fyra replikat rekommenderas med medelvärde och standardavvikelse bestäms.
5. Återställning Celler från den extracellulära matrisen Kultur
- Kultur och utföra ett rör bildningsanalys (se avsnitt 2) i större skala som en platta med 96 brunnar kommer inte att ge tillräcklig celltal. För plattor med 12 brunnar, använd 500 pl av extracellulärt matrix och 500 pl av HUVEC cellsuspensionen (1,5x10 5 celler).
- Inkubera cellerna i 4-16 h, för att bilda rör. Därefter aspirera cellodlingsmediet. Skölj cellerna med 1 ml kall 1 x PBS utan kalcium och magnesium.
- Tillsätt 1 ml iskall PBS-2,5 mM EDTA-buffert på kulturen och hålla på is under 10 min.
- Lösgöra cellerna och extracellulära matrisblandningen från skålen med användning av en 1000 mikroliter pipettspets med spets avskuren, och sedan överföra till en kall 15 ml rör, tvätta väl med 4 ml iskall PBS-2,5 mM EDTA och sätta in i röret .
- Sätta rören på is under 1-4 h och invertera röret några gånger tills all av den extracelluläramatrisen är upplöst.
- Centrifugera i 10 min vid 1620 xg vid 0 ° C
- Återsuspendera cellpelletarna med 1 ml kall PBS till en 1.ml rör på is.
- Centrifugera igen i 5 min vid 3000 xg vid 0 ° C, därefter kassera supernatanten.
- Lagra cellerna i -80 ° C.
Representative Results
Betydande, hälsosam endotel rör bildning kan enkelt kontrast till hämmad rör bildning i mikroskopi bilder. Friska rörbildning visas som en organiserad bana av de kapillära liknande strukturer (Figur 1). I jämförelse, manifesterar inhiberade rörbildning sig som spridda celler (Figur 2). Rörbildning analysuppgifter kvantifieras genom mätning av den totala rörlängden av kapillärrör (tabell 1). Förutom den totala rörlängden, kan den genomsnittliga rörlängden, totala antalet rör, eller totalt antal förgreningspunkter mätas. Strukturerad rörbildning ger större netto rörlängd än spridda hämmade rör tillväxt. I figur 3, tillåter en dosresponskurva beräkning av IC 50 under de försöksbetingelser av HUVEC-celler på GFR extracellulär matris och en CXCR2 inhibitor SB225002.
Figur 1. Endothelial t Ube bildning på extracellulär matris och tillväxtfaktor-reducerad (GFR) extracellulär matris. Två bilder visar framgångsrik rörbildning på extracellulär matris (A) och GFR extracellulär matris (B). Den sammankopplade nätverk av rör visar tydligt att tillväxten av rören är frisk i dessa HUVEC. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Hämning av röret bildning på extracellulära och tillväxtfaktor-reducerad (GFR) extracellulär matris av en CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 M). Två bilder visar röretformation som har inhiberats av ett CXCR2 inhibitor SB225002 (5,6 ^ M) på extracellulär matris (A) och GFR extracellulär matris (B). De isolerade klumpar av HUVEC-celler som ses i denna bild visar att cellerna var inte i stånd att bilda rören som är nödvändiga för att ansluta till varandra. Skala bar = 10 mikrometer. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Dos-responskurvan på tillväxtfaktor-reducerad (GFR) extracellulära matrisen. X-axeln visar rörlängden och Y-axeln visar koncentrationen av en CXCR2 inhibitor. Dosresponskurvan visar att HUVEC svar på CXCR2 inhibitorn på GFR extracellulär matris är dosberoende. IC 50 (halva maximala inhibitory koncentration) beräknades med hjälp av programvara 13 och kan jämföras med en dos-responskurva för extracellulär matris, till exempel. IC50 är den koncentration av inhibitom som minskar responsen på 50%. Felstaplar representerar standardavvikelsen.
| Growth Factor Reduced (GFR) extracellulär matris och inhibitor (4 replikat vardera) | Total rörlängd Genomsnittlig (pixlar) (1 pixel = 0,34 um) | Standardavvikelse | P-värde |
| GFR extracellulärmatrix kontroll | 2447 | 168,174 | |
| GFR extracellulär matris + 0,56 ^ iM SB225002 | 1422,5 | 185.4218 | 0.000395 |
| GFR extracellulär matris + 1,1 | iM SB225002 | 1004 | 126.1784 | 2,14 x 10 -5 |
| GFR extracellulär matris + 5,6 | iM SB225002 | 519,25 | 129.6368 | 4,19 x 10 -6 |
| GFR extracellulär matris + 11 | iM SB225002 | 393,75 | 212.6857 | 1,21 x 10 -5 |
Tabell 1. kvantifiera totala rörlängder på tillväxtfaktor-reducerad (GFR) extracellulär matris under varierande förhållanden. En del av en tabell med totalt rörlängder inspelade i prover som odlas på GFR extracellulär matris med varierande koncentrationer av CXCR2 hämmare. Uppgifterna tyder på att CXCR2 hämmaren hämmar rör bildning. Inkluderat är associerade värden som genomsnitt av fyra repliker, standardavvikelse, och P-värde. Mätt i pixlar för att visade data som exporteras. IC 50 kan beräknas med hjälp av statistisk programvara 13. (1 pixel = 0,34 | j, m)
Discussion
Vid utförande av denna analys är det viktigt att hålla den extracellulära matrisen på is eller vid 4 ° C vid alla tidpunkter om inte annat anges. Om den extracellulära matrisen tillåts värmas över 4 ° C, kommer den att polymerisera, och analysen kommer att förstöras. Det är också viktigt att se till att allt som kommer i kontakt (t ex, pipettspetsar, den platta) med den extracellulära matrisen är förkylts av nyss nämnda skäl. Antalet celler sådda i varje brunn är kritisk, kommer alltför få celler inte ge den förväntade banan i kontrollprovet, för många celler kommer att bilda stora cellkluster eller ett monoskikt och analysen kommer inte att vara giltig. En annan viktig faktor i framgången för denna analys är cellpassagen numret på HUVEC. Passageantalet bör alltid vara lägre än tio, annars robust rör bildning får inte förekomma. Dessutom bör man se till att cellodlingsmediet som används inte har löpt ut, eller att cellerna inte kommer att vara livskraftiga. Alternattivt, kan en alikvot på medellång och dess komponenter och förvara dem vid -20 ° C för att bevara för en tidsperiod efter slutdagen. Naturligtvis är det fortfarande fördelaktigt att använda mediet före utgångsdatum
Liksom alla förfaranden, finns det vissa nackdelar som att genomföra de endotelcell röret bildningsanalys. Ett stort problem är att, eftersom det finns olika typer av endotelceller och stödmatriser, kan resultaten av analysen variera mycket beroende på vilken typ av cell och matris används. Endotelcellerna som används (HUVEC, HAECs eller HMVECs) är primära celler, de är dyra att få och ha variation jämfört med odödliggjorda celler. De primära cellerna har begränsade passager för användning, och är därför inte lämplig för långtidsangiogenesförsök 14. För tillförlitliga uppgifter, bör man alltid använda samma typ för analysen. Som med andra in vitro-analyser, bör resultaten av ett rör bildningsanalys vara conbekräftas in vivo, eftersom resultaten från de kontrollerade och konstgjorda villkor för tvådimensionella vävnadskultur inte alltid kan återspeglas i den komplexa biosystem av en levande organism. Det är också viktigt att komma ihåg att denna typ av analys endast kan användas för att visa endotelceller rör bildning, och bör inte användas för att testa andra icke-endotelceller, rör bildande celler.
Denna analys är en ganska enkel och snabb metod för att kvantifiera angiogena potentialen hos en förening. Den bildar också en plattform för ytterligare experiment, som ensam, betyder inte att ge information avseende den specifika mekanism genom vilken föreningen som faktiskt påverkar fartyget formningsprocessen. Emellertid är användningen av olika extracellulära matriser ett exempel på hur man ytterligare kan skapa en ram för forskningsfrågor som inte är vanligt förekommande. Det finns metoder för att studera specifika biokemiska mekanismer för föreningen, inklusive specifika hämmare som riktar komponenter iden angiogenes-vägen. En annan strategi kan vara att extrahera RNA från endotelceller och använda RT-PCR (Real Time PCR) 12 för att analysera förändringar av genexpression som kan göra att tillväxtbeteende observeras i analysen. Framtida tillämpningar av denna metod innefattar transfekterade HUVEC att skapa knock-down analyser för specifika steg i angiogenes vägen. Det finns potential att tillämpa denna metod för att studera lymfangiogenes vägen. Genom att ändra de extracellulära matrixkomponenter, kan interaktionen mellan matrisen och cellulär process stödjer angiogenes i cancer att belysas ytterligare. Utvinningen av RNA och proteiner från endotelceller under dessa särskilda villkor ytterligare kvantifierbara data motsvarande bilddata.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 ) | Fisher | NC9525043 | HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-β (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin. Aliquot the medium and its components and store them at -20 °C, warm in 37 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40230 | Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| MATRIGEL MATRIX 10ML; 10 ml; LDEV-Free | Fisher | CB-40234 | extracellular matrix, keep in -20 °C, warm in 4 °C before use. |
| SB225002 | Fisher | 559405 | CXCR2 inhibitor, keep in -20 °C, warm in room temperature before use. |
| Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ScienCell Research Laboratories | 8000 | culture it according reference 10. |
| Trypsin 0.05%-EDTA phenol red | Invitrogen | 25300-054 | keep in 4 °C, warm in 37 °C before use. |
| Nikon ECLIPSE Ti | Nikon | Inverted Research Microscope. | |
| NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit | Nikon | Inverted Research Microscope software | |
| Graph-pad Prism 5 | GraphPad Software, Inc. | scientific 2D graphing and statistics software, to calculate IC50. |
References
- Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis. Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).
- Birbrair, A., et al. Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis. Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).
- Ferrara, N., Kerbel, R. S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).
- Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer. PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).
- Gu, X., et al. Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells. International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).
- Manjunathan, R., Ragunathan, M. Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line. Biol Proced Online. 17, 10 (2015).
- Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo. Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).
- Li, Y., et al. Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas. Cancer Lett. Aug. , (2015).
- Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis. Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).
- Clonetics Endothelial Cell System Technical Information & Instructions. , Lonza Walkersville, Inc. Available from: http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf (2015).
- The Essence of Cutting-edge Microscopy Research. , Nikon Corporation. Available from: http://www.nikoninstruments.com/images/stories/PDFs/Eclipse_Ti_Brochure.pdf (2008).
- de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture. Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).
- 50% of what? How exactly are IC50 and EC50 defined. , Graphpad Software. Available from: http://www.graphpad.com/support/faqid/1356/ (2015).
- Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria. J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).
