Abstract
Hjerteinfarkt indusert av koronar ligation har vært brukt i mange dyremodeller som et verktøy for å studere mekanismene for hjerte reparasjon og regenerering, og å definere nye mål for behandlingsformer. I flere tiår, modeller av komplett hjerte regenerering eksisterte i amfibier og fisk, men et pattedyr motstykke var ikke tilgjengelig. Den nylige oppdagelsen av en postnatal vindu der mus har regenerative evner har ført til etablering av et pattedyr modell av hjerte regenerering. En kirurgisk modell av pattedyr hjerte regenerering i nyfødt mus er presentert her. Kort fortalt er postnatal dag 1 (P1) mus bedøvd av isofluran og plassert på en is pad for å indusere hypotermi. Etter at brystkassen er åpnet, og den venstre fremre nedstigende koronararterie (LAD) er anskueliggjort, er en sutur plassert rundt LAD å påføre myokardial ischemi i den venstre ventrikkel. Den kirurgiske prosedyren tar 10-15 min. Visualisere koronararterieavgjørende for nøyaktig sutur plassering og reproduserbarhet. Hjerteinfarkt og hjertesvikt er bekreftet av trifenyl-tetrazoliumklorid (TTC) farging og ekkokardiografi, henholdsvis. Komplett regenerering 21 dager etter hjerteinfarkt er bekreftet ved histologi. Denne protokollen kan bli brukt som et verktøy for å forstå mekanismene for pattedyrhjerte regenerering etter hjerteinfarkt.
Introduction
Hjerteinfarkt (MI) er en ledende dødsårsaken i verden, og er fortsatt ansvarlig for om lag en tredel av hjertesvikt tilfeller 1. Mens bruk av perkutan intervensjon og kontinuerlig optimalisering av bruken av trombolytisk reperfusjon har økt følgende MI, kardiomyocytt død og tap av kontraktile myokard likevel inntreffer. Det gjenstår også et stort antall "no-alternativet" pasienter som ikke er kandidater for eller ikke ser nytte av disse tiltakene. Disse pasientene fortsetter å oppleve invalid iskemi fører til arrdannelse og skadelig ventrikkel ombygging som en mekanisme for infarkt healing. Denne prosessen til slutt resulterer i hjertesvikt, der prognosen er fortsatt dårlig til tross for optimal farmakologisk styring med angiotensin-konvertering enzym (ACE) hemmere og betablokkere. Dessverre er fremdeles ett års dødelighet for pasienter med alvorlig nedsatt venstre ventrikkelfunksjon somhøy som 26% 2. Hjertetransplantasjon er det siste behandlingsalternativ for pasienter med hjertesvikt. Imidlertid ikke begrenset donor pool for hjertetransplantasjon ikke gjøre dette til et levedyktig alternativ for de fleste pasienter. Dermed oppdagelsen av nye terapeutiske midler for å gjenopprette den skadede hjertemuskelen er fortsatt viktig å løse hjertesykdom problem. Pålitelig dyremodeller av hjerteskade er derfor nødvendig som en viktig del av denne prosessen.
Tradisjonell dogme har diktert at voksne cardiomyocytes er post-mitotisk, terminalt differensierte celler, ute av stand til å dele eller de-differensierende å erstatte den skadede hjertemuskelen tre. Som sådan, kan en voksen pattedyr hjerte aldri helt seg selv igjen fra skade, og tapte cardiomyocytes ville bli erstattet med bindevev. Dermed har forskningen fokusert primært på terapeutiske midler for å redusere infarkt ekspansjon og redusere arrdannelse. Mer nylig har imidlertid et paradigmeskifte skjeddei tenkningen rundt hjerte healing og mange forskningsinnsats er blitt omdirigert til å fokusere på potensialet for hjerte regenerering 4.
Inntil nylig var in vivo studier av hjerte regenerering begrenset til ikke-virveldyr modeller, slik som de i urodele amfibier og teleost fisk 5-7. Imidlertid har oppdagelsen av kapasiteten for hjerte regenerering i neonatale mus førte til utviklingen av to kirurgiske modeller av pattedyrhjerte regenerering: reseksjon av kardial apex og koronar arterieokklusjon å indusere hjerteinfarkt 8,9. I 2011 ble en mus apex reseksjon modellen som brukes for å vise at fullstendig hjerte regenerering er mulig ved postnatal dag 1 (P1). Men avtar denne kapasiteten raskt etter den første nyfødtperioden. Pattedyr hjertet mister sin regenererende potensial kort tid etter fødselen på P7 som stamcelle tall nedgang, og cardiomyocytes bli binucleated, taperderes proliferative kompetanse, og permanent avslutte cellesyklusen 10,11. Forstå grunnleggende forskjeller mellom den neonatale og voksne pattedyr hjerte kan føre til ny innsikt i hjerte gjenfødelse.
Mens apex reseksjon faktisk gir innblikk i re-veksten av kontraktile vev, gjør modellen ikke simulere typisk menneskelig hjerteskade, og dermed ikke egner seg så vel til utvikling av legemiddel. Koronar okklusjon modell, men simulerer mer direkte de patofysiologiske aspekter av MI patologi, og dermed kan gi mer nyttig innsikt i mekanismene som kan være aktuelt for terapeutisk avansement for menneskelig bruk.
Kirurgisk koronarligering er blitt anvendt som en nyttig eksperimentell teknikk i mange dyremodeller 12-14. I den voksne koronarligering modellen blir dyrene bedøvet og intubert for å tillate åpning av brysthulen under opprettholdelse respiratipå. Hjertet fortsetter å slå regelmessig, tillater visualisering av koronar blodkar og muliggjør nøyaktig sutur plassering. Videre er det fortsatt hjertet rosa som perfusjon fortsetter, og etter ligation iskemisk hjertemuskelen vises blek, indikerer vellykket koronar ligation. Protokollen er beskrevet i neonatale mus, men er mindre pålitelige som kransarterien ikke er visualisert og kirurgen må anslå hvor plassere sutur 15. Selv om den generelle anatomi av den koronare blodkar er den samme, enkelte dyr variasjon i den retning og forgrening av LAD eksisterer 16. Så når "går i blinde," arterien kan lett bli savnet. Andre teknikker slik som ekkokardiografi er da nødvendig for å bekrefte vellykket induksjon av MI, og for å sikre at alle operasjoner resulterer i en tilsvarende infarktstørrelse. Beskrevet her er en forbedring på en nylig publisert metode 15, hvor posisjonen av LAD kan Estabblert og således LAD kan bli ligert til reproduserbart å indusere MI.
Denne teknikk krever ikke endotracheal intubasjon eller mekanisk ventilasjon, som toraktomi i en hypotermisk tilstand i den neonatale mus ikke resulterer i lungekollaps. Men i tidligere beskrevet metode, alvorlig hypotermi må induseres til poenget med både komplett apnea og opphør av hjerterytmen 15. Den store begrensning av denne tilnærmingen er at kransarterien ikke lenger perfusert og hjertet synes bleke selv før LAD ligering. I den metode som er beskrevet heri, er koronar visualisering mulig ved et punkt av dvale før dyp nedkjøling og hjerterytmen opphør, med full restitusjon av den neonatale mus etter operasjonen. Denne metoden gir en stor fordel med 100% reproduserbarhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hekkende par av C57BL / 6 og CD-1 IG-S mus ble kjøpt fra Charles River. Dyr brukt i denne studien ble håndtert i henhold til retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care, og studieprotokoller ble godkjent av Animal Bruk Subcommittee ved Western University, London, Canada.
1. Animal Care
- Etter fødselen er fullført, og valpene har vært utgangspunktet ammet av sin mor for et par timer, plassere dem i en annen bur med en CD-en fostermor. CD-en mødre vise et roligere fenotype med en sterk fostring instinkt, og har en lavere tendens til å slutte med skadde valper 15.
2. kirurgi
- Indusere anestesi ved å plassere pup i et forseglet kammer isofluran (ca. 500 ul av 100% volum / volum isofluran tillatt å spre over 1300 cm3 kammer). Holde musen i kammeret inntil opphør av bevegelse (ca. 30 sekunder).
- Fjern mobruke fra isofluran kammer og indusere hypoterme anestesi ved å plassere musen på våt is. For å unngå frostskader, plasser is inne i en steril kirurgisk hanske, pakk musen i hanske og dekke hanske med is eller pakk musen i sterile våt gasbind og plassere den på is.
MERK: Mus kjøle raskere ved kontakt med isen er over et større område, og som sådan smeltet isen kan forkorte hypotermi induksjons tid. - Bekreft anestesi ved mangel på bevegelse respons på tå og hale klemme.
MERK: Opphør av provosert bevegelse oppstår ved en kroppstemperatur mellom 15 ° C og 8 ° C. (Cooling tid til denne temperaturen ca 1 min). Komplett apnea og asystole er ikke nødvendig for LAD ligering. - Flytt isen sengen til kirurgisk område utstyrt med et operasjonsmikroskop. Sørg for at musen valpen forblir på is under hele kirurgiske prosedyren.
MERK: Den kirurgiske området, gasbind og kirurgiske instrumenter bør steriliseres. maintai sterile felt gjennom hele prosedyren, og slitasje engangsbruk, sterile kirurgiske hansker. Oftalmisk salve er ikke nødvendig som mus er født med øynene lukket 17. - Plasser musen valpen i riktig lateral decubitus posisjon. Desinfiser brystet ved å tørke forsiktig med povidon-jod-løsning etterfulgt av en etanol pinne.
- Utfør snitt i huden på venstre bryst langs midt aksillærlinje ved å kutte huden mellom xyphoid og venstre armhule noen få millimeter under venstre forben. Også bruke saks til å skjære gjennom den underliggende brystmuskelen lag.
- Utfør en venstre thoracotomy i 4. interkostalrom ved å skille ribben og interkostalrom muskler med pinsett.
MERK: Neonatal ribbeina er veldig skjøre og kan lett brytes. For å unngå dette, forsiktig separate ribbeina ved å åpne tang langs intercostalmuskler (i stedet for å ta tak ribbeina). - Visual venstre fremre nedstigende koronar (LAD) dukker opp fra venstre auricle bak lungevenen og synkende utover den store hjerte blodåre.
MERK: I denne tidlige neonatal vinduet, er thymus ofte visualisert og kan dekke en del av hjerte basen. Den LAD kan ses som kommer ved siden av posisjonen til thymus, avhengig av vinkelen av thorax innsnitt. - Ligate LAD ved å sende en 11-0 nylon sutur (0,007 mm diameter nål) under arterien gjennom midten ventrikkel under venstre atriet (figur 1C). Iskemi er bekreftet med forvelling av hjertemuskelen under sutur området (figur 1G).
- Lukk thorax snitt bruker 8-0 nylon suturer (nål diameter 0,15 mm). Bruk to sting for å lukke ribbeina. Plasser begge rib sting før ligering for å sikre at nålen ikke punktere lungene når de passerer gjennom kroppens hulrom.
- Etter stengetid ribbeina, fjerne musen fra isen sengen. Hold musen innenfor den kirurgiske området og plassere den direkte på sterile kirurgiske tilWEL over en varm varmeputen ved 37 ° C for å begynne oppvarming.
- Når på sterile oppvarmet areal, lukke muskel og hud lag som bruker 8-0 nylon suturer (nål diameter 0,15 mm). Bruk en sutur for muskel lag og bruke to sting for huden snittet.
MERK: muskel og hud lag kan bli stengt på en varmepute for å redusere nedkjøling eksponeringstid. Mus temperaturen begynner å stige en gang plassert på varmeputen, men forblir tilstrekkelig lav nok for anestesi vedlikehold i muskel og hud nedleggelse.
3. Kirurgisk Recovery
- Fortsett raske oppvarmingen på en varm varmepute til retur av spontan bevegelse. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Fjern povidon-jod og blod ved å forsiktig tørke skade området med etanol pinne.
- Etter tilstrekkelig utvinning fra anestesi, fjerne den fra sterile kirurgiske området, smøre den med sengetøy fra fostremorens bur, og retur valp til fostermor. Dette bidrar til å hindre mors avvisning eller kannibalisering.
MERK: Ikke returner valper til et bur med andre dyr før fullt restituert. Hvis en hel kull ikke har blitt brukt, og kullsøsken bli hos fostermor, plasserer gjenvunnet valper i midten av kullet. Hvis du utfører flere enn én operasjon, komplett alle operasjoner som kreves for en privatperson kull før retur mus til sin fostermor. - Observere atferden til fostermor mot valpen hver 10-15 min for 2-3 timer for å sikre aksept av valpen. Hvis mor viser aggresjon mot den skadde valpen, fjerne valpen og avlive av isofluran overdose (> 5%, til pustestans), etterfulgt av halshogging. MERK: Perioperativ analgesi medisiner er ikke nødvendig som de sentrale smerte refleksene ikke er fullt utviklet på dette tidlig alder 15.
4. Måling av hjerteinfarkt størrelse 4 -6 timer etter MI
- Tillat valper å komme i omsorgen for en CD-en fostermor for en periode på 4-6 timer. Fjern valpen fra bur med mor og avlive den med isofluran overdose etterfulgt av halshogging med store saks.
- Eksisere dette under dissekere mikroskop, forsiktig for ikke å rippe hjertemuskelen.
- Kutt i huden fra xyphoid prosessen til toppen av brystkassen. Åpne bukveggen under brystkasse. Ta tak i nedre brystkassen og skjære gjennom ribbeina og muskulaturen i lengderetningen langs venstre mid-aksillarlinje fra mellomgulvet til armhulen.
- Hold saks i tverrgående plan og nøye skjære gjennom membranen fra venstre til høyre side. Sørg for å plassere en saks under nivået av hjertet for å unngå eventuelle skader på apex.
- Ta tak brystkassen og kuttet rett side av ribbeina og muskulaturen langs høyre midt aksillarlinje. Fjern alle vaskulære forbindelser til sentrum med saks. Ta hjertet fra brysthulen ved å gripebasen.
- § hjertet i tre deler ved hjelp av et kirurgisk karbonstål barberblad. Gjør det første kuttet langs den korte aksen av hjertet på midtpunktet mellom sutur og hjerte apex. Gjør den andre snitt på nivå av suturen (figur 3A).
MERK: Dette etterlater en apex seksjon omtrent 0,75 mm tykk veide 0,0018 g; en midtbunnseksjon ca 1 mm tykt, som veier 0,0065 g; og bunnen av hjertet. - Plasser hjerteseksjoner i 1% 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) ved romtemperatur i 10 - 15 min. Nøye se prøven for å unngå over-farging.
- For å øke kontrast, fikse farget hjerte skiver med 4% paraformaldehyde natten ved 4 ° C. For å beregne% infarktet området, fotografi hjerteseksjoner og måle infarktet området på bildebehandling. Den levedyktig hjertemuskelen flekker rødt mens infarktet området er avgrenset som hvit 18.
5. Måling avHjertefunksjonen med Ekkokardiografi Post-MI
- Tillat valper å komme i omsorgen for en CD-en fostermor for en periode på 24-48 timer. Innledning av anestesi ved å plassere valpen i en forseglet isofluran kammer (5% isofluran). Holde musen i kammeret inntil opphør av bevegelse (ca. 30 sekunder).
- Fest valp i liggende stilling på en oppvarmet dock (temperatur 37 ° C) med snuten i en membran for å levere 0,5 til 1% isofluran (for anestesi vedlikehold). Plasser forvarmes ekko gel på venstre brystområdet.
- Få tak i en parasternal lang akse visning av venstre ventrikkel (LV). Sikrer bildene blir oppnådd under nivået av suturen i LV. Etter å skaffe posisjonen, drei ultralyd probe (40 MHz) 90 ° for å oppnå en parasternal kort-aksen visning, og posten M-mode ekkokardiografi bilder.
- Mål slutten diastolisk og ende systolisk venstre ventrikkel indre diameter fra de kortakse M-mode bilder. Beregn ejeksjonsfraksjon og fractional forkorting.
6. Måling av hjerteinfarkt størrelse 24 timer etter MI
- Tillat valper å komme i omsorgen for en CD-en fostermor for en periode på 24 timer. Fjern valpen fra bur med mor og avlive den med isofluran overdose etterfulgt av halshogging med store saks.
- Åpne brystet hulrom som i trinn 4.2. Før excising hjertet, forsiktig tak i thorakalaorta like over membranen med fine tang. Hold gode saks i den koronale flyet, flatt mot brystveggen, og kutte thorakalaorta av bakre brystveggen beveger saks i kranie retning.
- Skjær aorta fri fra brystveggen og eventuelle andre forbindelser før den når hjertet. Skjære hjertet ved å gripe den overlegne vena cava og kutte alle andre vaskulære forbindelser til kroppen.
- Skyll hjertet (med aorta vedlagt) i saltvann. cannulate thorakalaorta med en 30 gauge nål nøye og knyt enOrta til kanylen med 8-0 nylon sutur tråden.
- Perfuse hjertet med 1 ml av saltløsning gjennom aorta via en 30 gauge nål med en hastighet på 1 ml / min. Perfuse hjertet med 150 ul av 2% Evans blått-oppløsning ved en hastighet på 1 ml / min. Ta hjertet fra kanylen, seksjon det i tre biter og flekken det med TTC som beskrevet i kapittel 4.
- For å beregne infarktstørrelsen, fotografi hjerteseksjoner og måle infarktet området på bildebehandling. Den levedyktig hjertemuskelen flekker blå området på risiko flekker rødt, og infarktområdet er avgrenset som hvit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den hjerteinfarkt prosedyre på P1 kan være ferdig i 10 - 15 min og har en dødelighet på 7,8% (5 av 64 unger). Etter operasjonen, mus gjenopprette fra hypoterme anestesi innen de neste 5-20 min (tid for utvinning avhenger av kroppstemperaturen nådd under anestesi og hastigheten på kirurg). Ved bruk av P7 unger (for sammenligning med en ikke-regenerativ myokard), er en lengre periode med avkjøling nødvendig for å nå dvale. P7 valpene er mye større og har mer problemer med å komme seg fra både hjerteskader og nedkjøling, noe som resulterer i en mye høyere dødelighet på 26,9% (14 av 52 valper).
Resultater fra tidligere studier har bekreftet heri, indikerer induksjon av anestesi hypoterme på nær 10 ° C (mellom 8 ° C og 15 ° C) 19. Innenfor denne temperaturen vinduet, gjør pulsen treg,men rytmen fortsetter ved hastigheter på mellom 24 bpm og 11 bpm. Den lav puls på dette nivået av kjøling reduserer intraoperativ blødning betydelig. Gutten kan enkelt visualiseres og bundet ved disse temperaturer (figur 1). Gutten er synlig inntil kroppen temperaturer nå mellom 9,6 ° C og 4,9 ° C, forårsaker senking av hjertefrekvens til 2 bpm eller asystole.
Etter LAD ligering på P1, valpene komme seg helt og vokse til en kroppsstørrelse sammenlignes med kullbror kontroller. Når plassert tilbake med sin fostermor, valpene gjenvinne bevissthet og fôring evner sammenlignes med kullsøsken i ca 10 min. Ved histologisk undersøkelse 3 dager etter MI, det er tegn på hjerteinfarkt, med infiltrerende betennelsesceller, en typisk post-infarkt respons (figur 2). På dag 7 post-MI, vises venstre ventrikkel vev normalt. Ved dag 21 post-MI, komplett cardiac regenerering har oppstått.
2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) farging 4. - 6. timers post-MI ble anvendt som en bekreftelse på konsistent induksjon av MI. Den røde området representerer levedyktig hjertemuskelen og det hvite området representerer iskemisk dødt vev. I totalt 13 LAD ligerings-operasjoner, 100% av hjertene var infarkt, med en gjennomsnittlig infarktstørrelse på 36% (figur 3). TTC farging med Evans blå perfusjon ble også utført ved 24 timer post-MI å demonstrere utholdenhet av infarkt vev og måle infarktstørrelse basert på areal ved risiko (figur 4). I disse hjerter, flekker levedyktig hjertemuskelen blå området på risiko flekker røde, og infarktområdet er avgrenset som hvit. Infarktstørrelsen ble beregnet som en prosent av arealet i fare. I 4 LAD ligation kirurgi, 100% av hjerter var infarkt, med en gjennomsnittlig infarktstørrelse på 49% av arealet i fare (figur 4).
<p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> For å bekrefte infarktet induksjon, ekkokardiografi ble utført ved 24 og 48 timer etter MI. Ved 24-timers post-MI, ble ejeksjonsfraksjon (EF) signifikant redusert fra 84% til 74%, og fraksjonell forkortning (FS) signifikant redusert fra 50% til 40% (figur 5). Ved 48 timer etter MI, ble EF ytterligere redusert til 46%, sammenlignet med 80% i kontrollene og FS ble også vesentlig redusert til 25%, sammenlignet med 50% i kontrollene. Videre var det en signifikant reduksjon i systolisk venstre ventrikkel indre diameter på 48 timer (figur 6). LV fremre veggtykkelse var ikke signifikant redusert på enten 24 eller 48 timer etter MI (figurene 5 og 6).
Figur 1. koronar er synlig under Neonatal LAD Prosedyre. P1 neonatal mus after hypoterme anestesi, snitt i huden, muskler snitt og sideveis torakotomi i det fjerde interkostalrom. A) Venstre fremre nedstigende koronararterie (LAD) er synlig. BD) 11-0 nylon suturer blir ført gjennom midten av ventrikkelen. E) LAD er ligert og blanche~~POS=TRUNC observert under suturen området. F) og G) er forstørrelser av A) og E) henholdsvis. OCC. LAD, okkludert venstre fremre nedstigende arterie. LA, venstre atrium. LV, venstre ventrikkel. GCV, flott koronar vene. Hvit pil, LAD. Svart pil hode, gjenskinn fra belysning. Skala barer er 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bevis på Komplett Cardiac Regeneration Etter LAD hemorroider i Neonatal Mus. Masson er Trichrome flekker etter LAD ligation i P1 mus. Hele hjerter og forstørrelser ved infarkt områdene er vist på dag 3, 7 og 21 etter LAD ligering. Merk myocyte tap og provoserende celle infiltrere i infarkt regionen på dag 3 post-MI (hvit pil). Komplett infarktet sone regenerering begynner på dag 7 etter MI. Lite bevis for fibrose bemerket på dag 21 post-MI. Skala barer er 200, 100 og 50 mikrometer for 40X, 200X, og 630x forstørrelse, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Neonatal LAD hemorroider er 100% reproduserbare. A) Linjer av seksjonering av hele sitt hjerte for å skape en 0,75 mm apex stykke og en 1 mm mid-base-brikke for TTCfarging. B) Representative bilder av TTC farget humbug kontroll og LAD ligert hjerter. Skala barer er 1 mm. C) infarktstørrelse på 13 LAD ligations i P1 neonatale mus. Hearts samlet 4-6 timer etter MI og infarktstørrelsen målt etter TTC farging. Rødt indikerer levedyktig hjertemuskelen; hvit indikerer nekrose. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Neonatal LAD hemorroider Resultater i Pålitelig Infarkt. A) infarktstørrelsen i% av iskemisk området etter LAD ligation i P1 neonatal mus (n = 4). Hjerter ble samlet 24 timer etter MI og infarktstørrelse ble målt etter Evans blå og TTC flekker. Blå indikerer levedyktig hjertemuskelen; rødt indikerer område i fare; hvit indikerer necrosis. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. B) Representative bilder av Evans blå og TTC farget LAD bundne hjerter etter LAD ligering. Scale Bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Neonatal LAD Ligerings Resultater i hjertefunksjon ved 24 timer etter MI. Hjertefunksjonen ble vurdert ved ekkokardiografi. A) Representant M-mode bilder for både humbug operert og LAD ligert mus. Ende-diastole og systole end-er angitt med piler. B) Måling av fraksjonell forkortning, ejeksjonsfraksjon, og venstre ventrikkel indre diameter på både diastole og systole. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. N = 8 og 7 for humbug og koronar ligation (CAL) hhv. * P <0. 05. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Neonatal LAD Ligerings Resultater i hjertefunksjon på 48 timer etter MI. Hjertefunksjonen ble vurdert ved ekkokardiografi. A) Representant M-modus bilder som viser slutt diastolen (lange piler) og slutt systolen (korte piler) for både humbug opererte og LAD ligert mus. B) Hjerte funksjonelle målinger av ekkokardiografi inkludert fractional forkorte, ejeksjonsfraksjon, og venstre ventrikkel indre diameter på både diastole og systole. Dataene er gjennomsnitt ± SEM. N = 4 og 6 for humbug og koronar ligation (CAL), henholdsvis. * P <0,05, ** p <0,01.target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kirurgiske LAD ligation demonstrert her er en pålitelig metode for å produsere MI i neonatale mus. Denne modellen gir forskere med en reproduserbar modell som å studere pattedyr hjerte regenerering. Visualisering av koronar blodkar er en viktig del av denne metoden, sikrer korrekt sutur plassering og dermed garantere reproduserbarhet. Mens voksne mus ikke har vekselvarme evner, er kroppstemperaturen og metabolic rate av neonatal mus nært forbundet med omgivelsestemperatur. Videre er den lille størrelsen på nyfødte mus gjør dem ideelle for hypotermisk induksjon av overflatekjøling. Tidspunktet for kirurgi og mus kroppstemperatur er avgjørende for nøyaktighet i å kopiere denne prosedyren, og dermed må overvåkes nøye. Ligering så snart som mulig etter at torpor er nådd, gir mulighet til å visualblanchering av myokard etter ligering, noe som bekrefter kirurgisk suksess.
Det er multiple metoder som kan brukes for å bekrefte MI induksjon. Disse inkluderer TTC flekker, ekkokardiografi og histologisk analyse. TTC farging er lav kostnad, reproduserbar og pålitelig og lett utført med høy gjennomstrømning. Av disse grunner har TTC farging blitt mye brukt. Ekkokardiografi kan brukes til ikke-invasiv overvåke endringer i hjertefunksjon etter MI over tid. Definitive bevis på MI kan demonstreres gjennom histologisk analyse. I den foreliggende studien ble alle tre av de ovennevnte teknikker anvendes for å bekrefte vellykket induksjon av MI.
Visualisering av LAD er kritisk for vellykket MI induksjon. Hvis etterforskeren opplever problemer med å visualisere LAD (trolig på grunn av dyp hypotermi induksjon), kan den venstre atriet løftes noe med tang, som den viktigste roten av LAD er større enn de mer distale segmenter og kan være lettere synlig. Hvis LAD ikke kan visualiseres, bør etterforsker ikke anta arterie lokasjon. Denne valpen skal ikke brukes for eksperimentell ligering og kan heller brukes som en humbug operert kontroll.
Riktig inntreden i brysthulen på 4. interkostalrom er viktig for å få optimal visualisering og plass for LAD ligering. Dette kan oppnås gjennom nøye telling av interkostalrom mellomrom. I tillegg, hvis en mindre mengde av blødning oppstår under prosedyren, kan den fjernes med sterilt gasbind. Hvis blødningen er betydelig, imidlertid, at kirurgen har sannsynligvis ikke avkjølt mus tilstrekkelig før begynnelsen av fremgangsmåten, og ytterligere avkjøling er nødvendig. Vær oppmerksom på at graden av kjøling bør kontrolleres nøye for å sikre at hjertefrekvensen på rundt 20 bpm for å visualisere koronar.
På grunn av den lille størrelsen på neonatale mus, er høy oppløsning ekkokardiografi er nødvendig for å oppnå klare bilder M-modus for analyse av hjertefunksjonen. For best resultat, sikre hjertefrekvens på400 bpm med lett anestesi (0,5 - 1% isofluran inhalasjon) og opprettholde normal kroppstemperatur (oppvarmet dock og varmet ekko gel). Bilder er best kjøpt hvis kroppen er vippet litt mot høyre skulder (~ 5 ° kranialt og 5 ° mot høyre). Sørg for tilstrekkelig ekko gel brukes for å redusere støy.
Selv om denne fremgangsmåten ikke har 100% reproduserbarhet, kan størrelsen av infarkt være noe variabel avhengig av kransarterien forgrening anatomi av den enkelte nyfødte (figur 3). Som et resultat av dette kan høyere n tall være nødvendig for å oppnå statistisk signifikans ved bestemmelse av virkningene av forskjellige behandlinger eller genetiske manipulasjoner på hjertets regenerering. Men har denne tilnærmingen store fordeler framfor både neonatal apex reseksjon og cryoinjury som patofysiologien av disse skademekanismer kan være helt forskjellig fra MI og derfor kanskje ikke nøyaktig gjennåværende menneskelige MI 8,20. Denne fremgangsmåten etterligner mer direkte typisk human skade, og kan brukes til å studere hjerte regenerering i innstillingen av pattedyr MI.
Denne modellen er unik fordi den gir mulighet for å studere forskjellene i mekanismene for utvinning fra hjerteskade mellom ikke-regenerativ (voksen) og den regenerative (neonatal) pattedyr hjertemuskelen. For eksempel, de voksne mus MI modellresultater i permanent arrdannelse. Ventrikulær brudd oppstår ofte som et resultat av infarkt ekspansjon. Vår erfaring med denne modellen (> 100 operasjoner, upubliserte data), er fullstendig regenerering tydelig 21 dager etter infarkt og ventrikulær brudd er ikke observert. Informasjonen påløpt fra bruken av denne modellen kan tilby ny innsikt i mekanismer som kan fremme hjerte regenerering i voksen.
Nyere bevis tyder kardiomyocytt spredning er en stor bidragsyter til hjerte regenerering 9 4,21. Videre forskning ved hjelp av protokollen som presenteres her kan peke til terapeutiske mål for induksjon av hjerte regenerering post-MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-0 Nylon Suture | Microsurgery Instruments | 8-0 Nylon | |
| 11-0 Nylon Suture | Shanghai Pudong Medical Products Co Ltd | H1101 | |
| Fine Scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | |
| Small forceps | Fine Science Tools | 11063-07 | |
| Micro Needle Holder | Fine Science Tools | 12060-02 | |
| Zeiss Opmi 6s/S3 Microscope | Zeiss | 300002 | |
| Isoflurane | Baxter | CA2L9100 | |
| Isoflurane Chamber | Made in Feng laboratory | ||
| Bead Sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| 2,3,5-Triphenyltetraolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | |
| Stereomicroscope SteREO Discovery. V8 | Zeiss | 435400 | |
| AxioVision 8.0 | Zeiss | ||
| Axiocam Icc5 | Zeiss | 426554 | |
| Heat pad | Sunbeam | 731A0-CN | |
| Sterile Gloves | VWR | 414004-430 | |
| Gauze Sponges | Ducare | 90212 | |
| Ice | |||
| Ultrasound imaging system, Vevo2100 | Visual Sonics | VEVO2100 | |
| Ultrasound transducer, 40 MHz | Visual Sonics | MS400 |
References
- Rosamond, W., et al. Heart disease and stroke statistics--2008 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 117 (4), 25-146 (2008).
- Meta-analysis Global Group in Chronic Heart Failure. The survival of patients with heart failure with preserved or reduced left ventricular ejection fraction: an individual patient data meta-analysis. Eur Heart J. 33 (14), 1750-1757 (2012).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am J Physiol. 272, 220-226 (1997).
- D'Uva, G., et al. ERBB2 triggers mammalian heart regeneration by promoting cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nat Cell Biol. 17 (5), 627-638 (2015).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. J Exp Zool. 187 (2), 249-253 (1974).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T.
- Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Haubner, B. J., et al. Complete cardiac regeneration in a mouse model of myocardial infarction. Aging. 4 (12), 966-977 (2012).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271, 2183-2189 (1996).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J Mol Cell Cardiol. 28 (8), 1737-1746 (1996).
- Feng, Q., et al. Elevation of an endogenous inhibitor of nitric oxide synthesis in experimental congestive heart failure. Cardiovasc Res. 37 (3), 667-675 (1998).
- Xiang, F. L., et al. Cardiomyocyte-specific overexpression of human stem cell factor improves cardiac function and survival after myocardial infarction in mice. Circulation. 120 (12), 1065-1074 (2009).
- van Kats, J. P., et al. Angiotensin-converting enzyme inhibition and angiotensin II type 1 receptor blockade prevent cardiac remodeling in pigs after myocardial infarction: role of tissue angiotensin II. Circulation. 102 (13), 1556-1563 (2000).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nat Protoc. 9 (2), 305-311 (2014).
- Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (3), 1201-1207 (2004).
- Kao, W. W., Xia, Y., Liu, C. Y., Saika, S. Signaling pathways in morphogenesis of cornea and eyelid. Ocul Surf. 6 (1), 9-23 (2008).
- Redfors, B., Shao, Y. Z., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Experimental & Clinical Cardiology. 17 (4), 268-272 (2012).
- Phifer, C. B., Terry, L. M. Use of hypothermia for general anesthesia in preweanling rodents. Physiol Behav. 38 (6), 887-890 (1986).
- Jesty, S. A., et al. c-kit+ precursors support postinfarction myogenesis in the neonatal, but not adult, heart. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (33), 13380-13385 (2012).
- Mahmoud, A. I., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
