Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, nicht-invasiven Herz strukturelle und funktionelle Veränderungen in einem Mausmodell der Herzkrankheit durch Quer Aortakonstriktion geschaffen beurteilen zu können, unter Verwendung von B- und M-Mode-Echokardiographie und Farbe / Puls-Doppler-Bildgebung.
Protocol
Das Protokoll folgt den Richtlinien der Institutional Animal Care und Use Committee der University of Washington.
1. Chirurgische Verfahren und Vorbereitung für die Imaging
- Gegenstand C57BL / 6 - Mäusen zu TAC oder Scheinoperation , wie zuvor beschrieben 10.
- Eine Woche nach der TAC oder Scheinoperation, betäuben die Maus in die Induktionskammer mit 2% Isofluran gemischt mit 1 l / min O 2. Bestätigen Sie die richtige anesthetization durch Teilnahmslosigkeit bis Fuß oder Schwanz einklemmen. Verwenden Veterinär Salbe auf die Augen Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Entfernen Sie die Brusthaare durch Enthaarungscreme Anwendung. Desinfizieren Sie die Haut von Mäusen mit 70% Ethanol.
- Sichern Sie die Maus auf ein Tier-Handling-Plattform in der Rückenlage. Um einen konstanten Niveau der Narkose erhalten, verwenden Sie eine nosecone 0,5 zu liefern - 1% Isofluran mit 1 l / min O 2 gemischt.
- Bewerben Elektroden-Gel auf die Pfoten der Maus und klebt sie an die Elektroden-Pad.
- Legen Sie eine rektale Sonde Körpertemperatur zu überwachen. Aufrechterhaltung der Körpertemperatur bei 37 ° C über ein Heizkissen oder eine Lampe.
- Tragen Sie eine Schicht vorgewärmten Ultraschall-Gel auf die Maus Brust, vor allem der Bereich des Herzens liegt. Hinweis: Entfernen Sie Ultraschall-Gel und trocknen Sie die Maus mit steriler Gaze nach dem Bildgebungsverfahren.
2. Geben Sie im Aortenbogen Ansicht, Verwenden B-Mode und Doppler-Imaging Quer Aortakonstriktion zur Bewertung
- Verwenden Sie die B-Modus-Einstellung, um den Aortenbogen Ansicht zu erhalten, um die Aorta, Hauptarterienäste und die Verengung Ort zu visualisieren.
- Kippen Sie die linke Seite der Plattform so weit wie möglich mit der Maus in die linke Dekubitus Position zu drehen. Halten Sie den Ultraschallwandler durch Ständer in vertikaler Position und legen Sie es auf der Brust auf der rechten Parasternallinie, mit der Kerbe zeigt in Richtung Kinn der Maus. Hinweis: Verwenden Sie die Maus nicht Thorax komprimieren, wenn die TRANSD SenkungÜçer; minimale Menge an Druck erforderlich.
- Kippen Sie den Wandler auf der Ebene der Skapula und drehen leicht nach rechts, bis Aortenbogen in Sicht kommt. Beachten Sie die Quer Aortakonstriktion Stelle, die zwischen der Verzweigung der Truncus (IA) und linken Arteria carotis communis (LCCA) (Abbildung 1) befindet.
Hinweis: Keine Verengung in Sham-Maus erkannt wird.
- Auf den "Farb-Doppler" -Taste auf der Arbeitsstation zu Farb-Doppler-Modus zu wechseln Direktionalität und die Geschwindigkeit des Blutflusses über der Verengungsstelle zu überwachen. Erwerben und Speichern von Bildern von den "cine speichern" klicken.
- Klicken Sie auf die "PW-Doppler" Taste zum Wechseln zwischen Welle Doppler-Modus zu pulsieren, und Platz Probenvolumen (die gestrichelte Cursor-Box) unmittelbar distal der Engstelle Stelle für den stenotischen Strahl mit der höchsten Geschwindigkeit zu suchen, klicken Sie auf die "PW-Doppler" Taste zu erhalten, Wellenformen von Aorten-flow und messen Spitzengeschwindigkeit (Abbildung 2).
- Berechnen Druckgradienten über die Website Engstelle unter Verwendung der modifizierten Bernoulli-Gleichung: Druckgefälle = 4 x V max 2. Nur gehören Mäuse mit einem Druckgradienten von 40 bis 80 mmHg für eine weitere Analyse reichen.
3. Im Parasternal langen Achse, den Einsatz B-Modus und M-Modus Bildgebung zur Beurteilung Cardiac Dimensions und Kontraktilität
- Mit der Maus auf die Plattform in der Rückenlage liegen, halten Sie die Wandler in vertikaler Art und Weise mit der Kerbe zeigt auf den Kopf der Maus. Senken Sie den Wandler auf dem Thorax parallel zur linken Parasternallinie und drehen 30 ° gegen den Uhrzeigersinn.
- Verwenden B-Modus-Bildgebung eine volle lange Achse "sagittal" Ansicht des Herzens zu erhalten. Stellen Sie den Winkel des Wandlers und Fokustiefe linken Ventrikels sichtbar zu machen, die intraventrikuläre septalen Wand und einen kleinen Teil der rechten Ventrikelwand. Save die Bilder für die spätere Messungen der Herzwanddicke und Kammer Dimension. Mit "Herz-Paket", wählen Sie Parameter wie IVS oder LVAW, LVID und LVPW, und klicken Sie dann auf das Bild für jeden Parameter entsprechenden Linien zu zeichnen, um die Messungen zu erhalten.
- Beobachten Herzwandbewegungsmuster und prüfen, ob mögliche Bewegungsstörungen, einschließlich Akinese, Hypokinesie und Asynchronität.
Hinweis: Akinese und Hypokinesie bezeichnen vollständige und teilweise Verlust der Bewegung der Herzwand sind. Asynchrony bezeichnet unregelmäßig, unkoordinierte Herzwandbewegung. - Schalter zu M-Modus, place M-mode - Cursor senkrecht zu den LV Wänden auf Höhe der Papillarmuskel und erfassen Bilder für die spätere Messung des Herzabmessungen und fractional shortening (Abbildung 3).
4. Im Parasternal Kurzachsenansicht, den Einsatz B-Modus und M-Modus Imaging Herz Morphologie beurteilen und Funktion
- From die parasternal langen Achse, erhalten parasternal Kurzachsenansicht des Wandlers 90 ° im Uhrzeigersinn durch Drehen. Einstellen der Wandler eine horizontale Querschnitts "quer" Ansicht des Herzens, in B-Modus zu geben, wobei beide Papillarmuskeln deutlich sichtbar und auf der rechten Seite (der 2 und 4-Uhr-Position).
- Wechseln Sie in den M-Modus und legen Sie die M-Mode-Achse in der mittleren Ebene des linken Ventrikels. Erwerben und Speichern von Bildern für die spätere Messungen der Herzwanddicke, Kammer Dimension und fraktionelle Verkürzung (Abbildung 4). Mit "Herz-Paket", wählen Sie Parameter in SAX (kurze Achse) einschließlich IVS oder LVAW, LVID und LVPW, und klicken Sie auf das Bild für jeden Parameter entsprechenden Linien zu zeichnen, um die Messungen zu erhalten.
Hinweis: Die Messungen hier erhalten eng mit denen in der parasternal langen Achse (Abbildung 5) korrelieren sollte.
5. Im Apikale Vierkammerblick, VerwendenDoppler-Bildgebung zur Beurteilung systolisch und diastolisch Funktion
- Erhalten, die apikalen Vierkammerblick beide linken und rechten Ventrikel mit den Vorhöfen am unteren Rand des Bildschirms sichtbar zu machen. Im B-Modus, von der kurzen Achse Ansicht, kippen Sie die linke obere Ecke der Plattform Winkel der Kopf der Maus nach unten und den Wandler in Richtung der rechten Schulter der Maus orientieren. Dies ist im Wesentlichen eine "koronalen" Ansicht des Herzens gegen die Spitze oben schauen zu erreichen.
- Visualisieren Sie die Mitralklappe in B-Modus, und schalten Sie auf Farb-Doppler-Modus, indem die Probe Volumen (die gestrichelte Cursor-Box) an der Spitze der Mitralklappe.
- Wechseln Sie in den PW-Doppler-Modus Strömungsmuster über die Mitralklappe zu beurteilen. Ausrichten der Doppler-Sonde Cursor parallel zur Richtung der Mitral Blutung. Verwenden einer Sondenwinkel von weniger als 20 ° zur Spitzengeschwindigkeit (6) bestimmen.
- Speichern Sie die Bilder für die spätere Messungen. Verwenden Sie "Herz-Paket" und wählen Sie "MV Flow. "Jeden Parameter Klicken Sie auf und ziehen Linien entsprechen, um die Messungen zu erhalten Verfügbare Messungen umfassen:. Peak E Geschwindigkeit (früh mit aktiver ventrikuläre Entspannung Füllung), Peak A Geschwindigkeit (spät mit Vorhofkontraktion Füllung), Mitral isovolumetrischen Entspannung und Kontraktionszeiten (IVRT und IVCT jeweils) und Auswurfzeit (ET).
- Berechnen myokardiale Performance-Index (MPI) von MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. Post-Verfahrens Behandlung von Tier
- Geben Analgesie und / oder steriler Kochsalzlösung intraperitoneal chirurgische Tiere, wenn notwendig.
- Lassen Sie das Tier auf einem Heizkissen in Bauchlage zu erholen. Verwenden Sie kein Tier unbeaufsichtigt lassen, bis es genügend Bewusstsein zu halten Brustlage wiedergewonnen hat. Nicht ein Tier zurück, die das Verfahren für die Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis sie vollständig erholt.
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Representative Results
Figur 1 zeigt B-Modus - Bilder des Aortenbogens Ansicht Maus Herz unterworfen sham (1A) oder TAC Chirurgie (1B). Der Aortenbogen, Truncus, links Arteria carotis communis und linken Schlüsselbeinarterie gezeigt. Beachten Sie, dass Aortakonstriktion in TAC deutlich sichtbar ist, aber nicht Schein-Herz. Farb - Doppler - Bilder von Aorten - Ansicht sind in 2A gezeigt. Die Wellenformen des Aorten - Strömung über die Einschnürungsstelle wurden von PW - Doppler - Bildgebung (2B) erfasst. Erfolgreiche TAC wird zu einer deutlich erhöhten Strömungsgeschwindigkeit führen stromabwärts der Engstelle Ort (in der Regel ca. 4 m / sec in TAC-Mäuse). Druckgefälle über wurde die Verengung auf Basis von Spitzenströmungsgeschwindigkeit berechnet, nach der modifizierten Bernoulli-Gleichung (Abbildung 2C).
Figur 3 (3A) oder TAC Herz (3B). Das obere Feld zeigt die B-Modus-Bilder des linken Ventrikels, der interventrikulären Septum und einem Teil des rechten Ventrikels von sham oder TAC Mäusen. Das untere Feld zeigt die M-Mode-Kurven von mehreren Herzzyklen von Schein oder TAC-Mäusen. Die Messungen der Herz Dimensionen einschließlich der linken Dicke ventrikuläre vorderen Wand gezeigt, (LVAW), linksventrikuläre Innendurchmesser (LVID), linksventrikuläre hintere Wandstärke (LVPW) in der Diastole und Systole. Hinweis deutlich erhöhte Wandstärke in Mäuseherzen ausgesetzt TAC im Vergleich zu Scheinoperation.
Abbildung 4 zeigt Bilder der parasternal Kurzachsenansicht von Schein (4A) oder TAC Herz (4B). Der obere Abschnitt jedes Paneels zeigt den M-Modus-Achse (die Dotted Linie in der Mitte des linken Ventrikels platziert). Der untere Abschnitt jedes Paneels ist die M-Modus mit Linien Verfolgung angibt Herzdimensionen wie oben beschrieben. Als Marker für Hypertrophie, ventrikulärer und Septumwand Dicke genau bestimmt werden kann. Mäuse TAC unterworfen zeigten Wanddicke erhöht , wie durch LVAWd und LVPWd beurteilt, als ventrikuläre Dilatation beurteilt durch LVISd und LVISs, verminderte Kontraktilität durch LVFS und LVEF bewertet wie und erhöhte LV Masse (Abbildung 5).
6 zeigt B-Modus apikalen Vierkammeransicht (6A, B) und PW - Doppler - Bilder transmitralen Strömungsmuster (6C, D). Die Messungen der Spitzen E und einer Geschwindigkeit, IVCT, IVRT und ET gezeigt. Die E / A - Verhältnis und MPI berechnet (6E - I). Eine gesunde Maus Herz hat einen E / A-Verhältnis ≥1 und einen MPI-Wert ≤0.5. In pathologischen Zuständen mit diaStolic oder systolischen Herzfunktionsstörung, beispielsweise bei Mäusen TAC unterworfen, einer verringerten E / A-Verhältnis und / oder einem erhöhten Wert MPI werden typischerweise beobachtet.
Abbildung 1. B-Modus - Bild des Aortenbogen Ansicht der Maus Herz Subjected Chirurgie Sham (A) oder TAC (B). Die wichtigsten Aortenäste einschließlich Truncus (IA), links Arteria carotis communis (LCCA) und linken Schlüsselbeinarterie (LSA) sind gezeigt. Beachten Sie, dass quer Aortakonstriktion (durch den weißen Pfeil angezeigt wird ) kann in TAC sichtbar gemacht werden , aber nicht Herz Schein. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Farbe / PW - Doppler - Imaging des Transverse Aorta Blut Fow aus dem Aortenbogen Ansicht. Farbe (A) und PW (B) Doppler - Bilder von Schein und TAC Herzen gezeigt. Peak aortic Geschwindigkeit von PW - Doppler - Bildgebung erhalten wird , verwendet Druckgradienten zu berechnen gemäß der modifizierten Bernoulli - Gleichung (C). Diese Daten , die einen erfolgreichen TAC Operation mit dem Druckgradienten von ~ 70 mmHg bestätigen. * P <0,05 vs. Schein. Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt n = 15 für Sham und n = 13 für TAC. Student-t-Test verwendet wurde eine statistische Signifikanz zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Parasternal lange Achse (PLAX) Ansicht der Maus Herz Subjected Chirurgie Sham (A) oder TAC (B). Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen .
Abbildung 4. Parasternal kurze Achse (PSAX) Ansicht der Maus Herz Subjected Chirurgie Sham (A) oder TAC (B). M-Modus - Bilder die Platzierung des Probenvolumens zeigen (gelbe Linie in der oberen Platte punktiert) und Messung des Herz Dimensionen in der Diastole und Systole (blaue Linien in der unteren Platte). Die Sternchen zeigen Papillarmuskeln. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Echokardiographische Beurteilung der Herz Morphologische und funktionelle Veränderungen Nach TAC. M-Mode - Bildgebung im Hinblick auf kurze Achse wurde , wie in Abbildung 4 durchgeführt. (A) LVAWd, in der Diastole linksventrikulären Vorderwandstärke. (B) LVPWd, ventrikuläre hintere Wandstärke in der Diastole links. (C) LVIDd, ventrikuläre Innendurchmesser in der Diastole gelassen. (D) LVIDs, linksventrikuläre Innendurchmesser in der Systole. (E) LVFS, linksventrikulärer Verkürzungsfraktion. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) LVEF, linksventrikuläre Auswurffraktion. LVEF (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV und LVESV bezeichnen linksventrikulären enddiastolischen und endsystolischer Volumens. LV Volumen und Ejektionsfraktion werden gerade durch Simpso bewertet n-Verfahren. Simpson Volumen = [Fläche (1) + Bereich (2) + ... + Fläche (n)] x Länge: LV Volumen wird durch den Einbau von zahlreichen Platten in den Ventrikel geschätzt. Simpson Fläche und Länge werden durch Verfolgen der endokardialen Grenze des LV in der langen Achse und der kurzen Achse Ansicht erhalten. (G) LV (linksventrikuläre) Masse. LV Masse (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWd + IVSd) 3 - (LVIDd) 3]. Der Faktor 1.05 stellt die spezifische Dichte des Myokards. (H) HR, Herzfrequenz. * P <0,05 vs. Schein. Die Anzahl der Mäuse analysiert wird in den Stäben jeder Tafel gezeigt. Die Daten werden ausgedrückt als Mittelwert ± SEM Student-t-Test verwendet wurde eine statistische Signifikanz zu bestimmen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 6. Bewertung der transmitralen Blutfluss durch Doppler - Imaging. (A und B) B-Modus apikalen Vierkammerblick von Schein (A) oder TAC (B) Herz. LV, linker Ventrikel; RV, rechten Ventrikel; MV, Mitralklappe; TV, Trikuspidalklappe; LA, linker Vorhof; RA, rechten Vorhof. (C und D) PW - Doppler - Wellenform von trans-Mitral Blutfluss in der Sham (C) oder TAC (D) Herz. Relevanten Messungen sind gezeigt. (E) E / A, Peak - E und A Geschwindigkeitsverhältnis. (F) IVCT, isovolumetrischen Kontraktionszeit. (G) IVRT, isovolumetrischen Relaxationszeit. (H) ET, Auswurfzeit. (I) MPI, myokardiale Performance - Index. * P <0,05 vs. Schein. Die Anzahl der Mäuse analysiert wird in den Stäben jeder Tafel gezeigt. Daten werden als Mittelwert ausgedrückt77; sem Student-t-Test verwendet wurde eine statistische Signifikanz zu bestimmen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Echokardiographie wurde in großem Umfang verwendet , um die Herzfunktion in Nagetiermodellen von Herzerkrankungen 2,6 beurteilen. Im Vergleich zu invasiven oder Terminal - Methoden wie Druck-Volumen - Schleifenmessung 11 und ex vivo Arbeits Herz 12, Echokardiographie bietet eine leistungsfähige, nichtinvasive Werkzeug zur Beurteilung laufenden Herz strukturelle und funktionelle Veränderungen in lebenden Tieren. Zur Gewinnung zuverlässiger Daten ist es wichtig , die Körpertemperatur und Herzfrequenz innerhalb der physiologischen Bereich 13 durch eine sorgfältige Einstellung der Heizvorrichtung und die Anästhesie Niveau zu halten. Alle Bilder sollten einheitlich erfasst und analysiert werden, entsprechend den standardisierten Bildgebungsverfahren, den Vergleich zwischen Mäuse verschiedener Stämme oder Genotyp zu erleichtern.
TAC wird im Allgemeinen 1 zu induzieren Herzhypertrophie und Herzinsuffizienz bei Mäusen verwendet. Nicht-invasive Messung des Druckgradienten über der Verengungsstelle durch DopplerBildgebung stellt eine zuverlässige Beurteilung des Grades der Druckbelastung in Mäusen. Erfolgreiche TAC erzeugt typischerweise ein Druckgefälle ≥40 mmHg. Nur Mäuse ähnlichen Grad der Druckbelastung ausgesetzt ist für die weitere Analyse aufgenommen werden, während Mäuse, die mit einem Druckgradienten zu niedrig oder zu hoch sein sollte ausgeschlossen. Nach TAC werden die Mäuse zu erwarten Herzhypertrophie in 1-2 Wochen, und Herzdilatation nach 4 Wochen zu entwickeln, je den Grad der Drucküberlastung und den genetischen Hintergrund der getesteten Mäuse. Die dynamische kardialen Remodeling und funktionellen Veränderungen nach TAC zuverlässig durch Echokardiographie beurteilt werden, wie oben beschrieben.
Im Gegensatz zu seiner häufigen Verwendung beim Menschen 14, Farbe / PW - Doppler wurde erst vor kurzem in Nagetier - Ultraschall - Bildgebung 9 zur Verfügung. Auch hier haben wir beschrieben, die Anwendungen von Doppler-Bildgebung bei der Messung Druckgefälle sowie systolischen und diastolischen Leistung. Messenment von Mitral- und Trikuspidalklappe Blutung Direktionalität und Geschwindigkeit (dh., E / A - Verhältnis, IVRT, IVCT, ET und MPI) liefert wichtige Informationen über die Herzfunktion. So Echokardiographie stellt ein wichtiges Werkzeug Herzphysiologie und Pathophysiologie bei Kleintieren zu studieren.
Die Begrenzung der Herz-Ultraschall-Bildgebung ist die Messung Variabilität und Reproduzierbarkeit in Zusammenhang stehen. Zur Reduzierung der inter- und intra Betreiber Variabilität ist es wichtig, zu standardisieren, wie Bilder aufgenommen und analysiert. Die Messungen sollten aus mehreren akustischen Fenstern und Modi (B-Mode, M-Mode und PW / Farbdoppler) und mindestens 3 separate Messungen durchgeführt werden sollten gemittelt werden Genauigkeit und Zuverlässigkeit sicherzustellen. Darüber hinaus gibt es nur begrenzte akustische Fenster und manchmal niedriger Qualität Bilder werden in kleinen Nagetieren unterworfen chirurgische Eingriffe wie TAC, aufgrund von Gewebeschwellung, Operationsnarben und Lungenödem erhalten, die mit dem Ultraschall interferierenStrahlen. Für Doppler-Bildgebung, ist es manchmal schwierig zu trennen E und A-Wellen und eine vollständige Wellenform des Mitral Strömungs erhalten, aufgrund einer relativ hohen Herzfrequenz in kleinen Nagetieren, besonders in Mäusen TAC oder MI Operation unterzogen. Senkung der Herzfrequenz kann hilfreich sein, Messungen zu erhalten, aber dies wird Werte, die durch Doppler-Bildgebung und damit die Interpretation der Daten beeinflussen.
Mit den jüngsten technischen Fortschritte, neu veröffentlichten Ultraschallsysteme bieten eine hohe Bildauflösung und Rahmen / Abtastraten genaue quantitative Messung bei Kleintieren zu gewährleisten. Neue Echokardiographie-Technologien werden auch die Empfindlichkeit der Echokardiographie Beurteilung der Herzfunktion und ermöglichen die Früherkennung von Herzpathologie verbessern. Zum Beispiel Speckle-Tracking - Strain - Imaging 15 wurde verwendet, um genau regionalen myokardialen Funktion messen. Neue Aufnehmertechnologien derzeit in der Entwicklung wird das Potenzial für die Echtzeit, 3D- oder 4D zur Verfügung stellenBildgebung. Kontrast-Echokardiographie, die in fortgeschrittenen Entwicklung ist für Volumenmessungen, Gewebsperfusion Assessments, die molekulare Bildgebung von kardiovaskulären Erkrankungen zu ermöglichen, und Abgabe von therapeutischen Mitteln.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
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