Summary
El objetivo de este protocolo es evaluar de forma no invasiva los cambios estructurales y funcionales cardiacas en un modelo de ratón de la enfermedad cardíaca creado por constricción de la aorta transversal, utilizando B y en modo M ecocardiografía y color / de pulso Doppler de onda.
Protocol
El protocolo sigue las directrices del Comité para el Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Washington.
1. Procedimiento Quirúrgico y preparación de la Imagen
- Asunto C57BL / 6 ratones para TAC o cirugía simulada como se describió previamente 10.
- Una semana después de TAC o cirugía simulada, anestesiar el ratón en la cámara de inducción con 2% de isoflurano mezclado con 1 L / min O 2. Confirmar la anestesia adecuada por falta de respuesta a los pies o pellizcar la cola. Utilice la pomada veterinaria en los ojos para evitar la sequedad, mientras que bajo anestesia. Quitar el pelo en el pecho mediante la aplicación de crema de depilación. Desinfectar la piel del ratón con un 70% de etanol.
- Asegure el ratón a una plataforma de manejo de los animales en la posición supina. Para mantener un nivel constante de anestesia, utilizar un cono de nariz para entregar 0,5-1% de isoflurano mezclado con 1 L / min O 2.
- Aplicar el gel de electrodos a las patas del ratón y papeles pegados a la almohadilla de electrodo.
- Insertar una sonda rectal para controlar la temperatura del cuerpo. Se mantiene la temperatura corporal a 37 ° C a través de una almohadilla térmica o una lámpara.
- Aplicar una capa de gel de ultrasonido pre-calentado en el pecho ratón, principalmente la zona que recubre el corazón. Nota: remover el gel de ultrasonido y secar el ratón con una gasa estéril después del procedimiento de formación de imágenes.
2. En el arco aórtico ver, utilizar el modo B y Doppler Imaging para Evaluar constricción de la aorta transversa
- Use la configuración en modo B para obtener el punto de vista del arco aórtico con el fin de visualizar la aorta, las principales ramas arteriales, y el sitio de la constricción.
- Incline el lado izquierdo de la plataforma hasta la medida de lo posible girar el ratón en posición de decúbito izquierdo. Mantener el transductor de ultrasonido por stand en posición vertical y colocarlo en el pecho a lo largo de la línea paraesternal derecha, con la que apunta la muesca hacia la barbilla del ratón. Nota: No comprimir el tórax del ratón al bajar el TRANSDucer; Se requiere cantidad mínima de presión.
- Inclinar el transductor al nivel de la escápula y gire ligeramente hacia la derecha hasta el arco aórtico está a la vista. Observe el sitio de constricción de la aorta transversal, que se encuentra entre la bifurcación de la arteria innominada (IA) e izquierda de la arteria carótida común (ACCV) (Figura 1).
Nota: No se constricción se detecta en ratones con operación simulada.
- Haga clic en el botón "Doppler color" en la estación de trabajo para cambiar al modo Doppler color para controlar la direccionalidad y la velocidad del flujo sanguíneo a través del sitio de la constricción. Adquirir y almacenar las imágenes haciendo clic en el botón de "tienda de cine".
- Haga clic en el botón "Doppler" para cambiar al por pulso Doppler de onda, y el volumen de ejemplo de lugar (el cursor de cuadro de trazos) inmediatamente distal al lugar de la constricción para buscar el chorro estenótica con la velocidad más alta, a continuación, haga clic en el botón "Doppler" para obtener formas de onda de fl aórticala velocidad de pico flujo y medir (Figura 2).
- Calcula gradiente de presión a través del sitio de la constricción del uso de Bernoulli modificada ecuación: gradiente de presión = 4 x 2 V máx. Sólo incluir ratones con un gradiente de presión que varía de 40 a 80 mmHg para su posterior análisis.
3. En el eje paraesternal largo ver, utilizar el modo B y M-modo de imagen para valorar la contractilidad cardíaca y Dimensiones
- Con el ratón tumbado en posición supina en la plataforma, mantener el transductor de forma vertical con la muesca apuntando a la cabeza del ratón. Bajar el transductor sobre el tórax paralela a la línea paraesternal izquierda y girar 30 ° en sentido antihorario.
- Usar imágenes en modo B para obtener un eje largo completo "sagital" del corazón. Ajuste el ángulo del transductor y centrarse profundidad de visualizar ventrículo izquierdo, la pared septal intraventricular, y una ligera parte de la pared ventricular derecha. Save las imágenes para las mediciones posteriores de espesor de la pared cardíaca y dimensión de la cámara. El uso de "paquete cardiaca", seleccionar parámetros tales como IVS o LVAW, DdV y VEPP, y haga clic en la imagen para dibujar líneas correspondientes de cada parámetro para obtener las mediciones.
- Observar los patrones de movimiento de la pared cardíaca y controlar los posibles anomalías en el movimiento, incluyendo la acinesia, hipocinesia, y la asincronía.
Nota: acinesia e hipocinesia denotar pérdida completa y parcial de movimiento de la pared cardíaca, respectivamente. Asincronía denota movimiento irregular, falta de coordinación cardiaca pared. - Cambiar al modo M, el modo M-lugar del cursor perpendicular a las paredes del LV a nivel del músculo papilar, y adquirir imágenes para la medición posterior de las dimensiones cardíacas y la fracción de acortamiento (Figura 3).
4. En el eje corto paraesternal ver, utilizar el modo B y M-modo de imagen para valorar la función cardiaca y Morfología
- from el eje longitudinal paraesternal, obtener paraesternal eje corto rotando el transductor 90 ° en sentido horario. Ajuste el transductor para dar una visión horizontal de la sección transversal "transversal" del corazón en modo B, con las dos músculos papilares claramente visibles y situados a la derecha (la posición 2 y 4 en punto).
- Cambiar al modo M y colocar el eje en modo M en el nivel medio del ventrículo izquierdo. Adquirir y almacenar imágenes para mediciones posteriores del espesor de la pared cardiaca, dimensión de la cámara, y la fracción de acortamiento (Figura 4). El uso de "paquete cardiaca", seleccionar los parámetros en SAX (eje corto) incluyendo IVS o LVAW, DdV y VEPP, y haga clic en la imagen para dibujar líneas que corresponden a cada parámetro para obtener las mediciones.
Nota: Las mediciones obtenidas aquí deben correlacionarse estrechamente con los obtenidos en el eje largo paraesternal (Figura 5).
5. En el apical de cuatro cámaras Vista, usoDoppler para evaluar la función sistólica y diastólica
- Obtener el plano apical de cuatro cámaras para visualizar los ventrículos derecho e izquierdo con las aurículas en la parte inferior de la pantalla. En el modo B, desde el punto de vista de eje corto, incline la esquina superior izquierda de la plataforma al ángulo de la cabeza del ratón y orientar el transductor hacia el hombro derecho del ratón. Esto es esencialmente a lograr una visión "corona" del corazón mirando hacia el ápice.
- Visualizar la válvula mitral en modo B, y cambiar al modo Doppler color, colocando el volumen de muestra (el cursor de cuadro de trazos) en la punta de la válvula mitral.
- Cambiar a modo Doppler para evaluar los patrones de flujo a través de la válvula mitral. Alinear la sonda Doppler cursor paralelo a la dirección del flujo sanguíneo mitral. Utilice un ángulo de sonda de menos de 20 ° para determinar la velocidad de pico (Figura 6).
- Guardar las imágenes para las mediciones posteriores. Use "paquete cardiaco" y seleccione "flujo MV. "Haga clic en cada parámetro y trazar líneas correspondientes para obtener las mediciones mediciones disponibles incluyen:. Pico de la onda E mitral (a principios de llenado con la relajación ventricular activo), velocidad máxima de la (finales de llenado con la contracción auricular), la relajación isovolumétrica mitral y tiempos de contracción (TRIV y IVCT respectivamente), y el tiempo de eyección (ET).
- Calcular el índice de función miocárdica (MPI) MPI = (+ IVCT TRIV) / ET.
6. Tratamiento Post-procesal de los Animales
- Dar analgesia y / o solución salina estéril por vía intraperitoneal a los animales quirúrgicos cuando sea necesario.
- Deje que el animal se recupere en una almohadilla térmica en la posición prona. No deje un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. No devuelva un animal que ha sido sometido al procedimiento de la compañía de otros animales hasta que esté completamente recuperado.
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Representative Results
La figura 1 muestra las imágenes en modo B de la vista del arco aórtico del corazón de ratón sometido a tratamiento simulado (Figura 1A) o cirugía TAC (Figura 1B). El arco de la aorta, la arteria innominada, arteria carótida común izquierda y la arteria subclavia izquierda se muestran. Tenga en cuenta que la constricción de la aorta es claramente visible en la TAC, pero no simulado corazón. Las imágenes en color Doppler de vista de la aorta se muestran en la Figura 2A. Las formas de onda de flujo aórtico a través del sitio constricción fueron capturados por PW Doppler de formación de imágenes (Figura 2B). TAC éxito dará lugar a un aumento significativo en la velocidad del flujo aguas abajo del sitio de constricción (típicamente ~ 4 m / seg en ratones TAC). Gradiente de presión a través de la constricción se calculó basándose en la velocidad de flujo máximo, de acuerdo con la ecuación de Bernoulli modificada (Figura 2C).
figura 3 (Figura 3A) o el corazón TAC (Figura 3B). El panel superior muestra las imágenes en modo B del ventrículo izquierdo, el tabique interventricular, y una parte del ventrículo derecho de ratones sham o TAC. El panel inferior muestra los trazados en modo M de varios ciclos cardíacos de ratones sham o TAC. Las mediciones de las dimensiones cardíacas se muestran, incluyendo el grosor del ventrículo izquierdo pared anterior (LVAW), diámetro interno del ventrículo izquierdo (DdV), del ventrículo izquierdo grosor de la pared posterior (VEPP) en diástole y sístole. Nota aumentado considerablemente el espesor de pared en el corazón de ratón sometidas a TAC en comparación con la cirugía simulada.
La figura 4 muestra imágenes del eje corto paraesternal de simulada (Figura 4A) o el corazón TAC (Figura 4B). La parte superior de cada panel muestra el eje en modo M (la dottlínea ed) colocado en el centro del ventrículo izquierdo. La parte inferior de cada panel es el modo M rastreo con líneas que indican las dimensiones cardíacas como se describe anteriormente. Como marcador de hipertrofia ventricular y grosor de la pared septal puede determinarse con precisión. Los ratones sometidos a TAC mostraron un aumento de espesor de pared según la evaluación de LVAWd y LVPWd, dilatación ventricular según la evaluación de LVISD y LVISs, disminución de la contractilidad según la evaluación de LVFS y la FEVI, y el aumento de la masa ventricular izquierda (Figura 5).
La figura 6 muestra el modo B-apical de cuatro cámaras (Figura 6 A, B) y PW Doppler imágenes de los patrones de flujo transmitral (Figura 6C, D). se muestran las mediciones de pico E y una velocidad, IVCT, TRIV, y ET. La relación E / A y MPI se calculan (Figura 6 E - I). Un corazón ratón sano tiene una relación E / A ≥1 y un valor ≤0.5 MPI. En condiciones patológicas con diaStolic o disfunción cardíaca sistólica, tal como en ratones sometidos a TAC, un E disminuido / A ratio y / o un mayor valor MPI se observan típicamente.
Figura 1. B-Modo de imagen de la Arco aórtico Vista de ratón del corazón sometido a cirugía simulada (A) o TAC (B). Las principales ramas de la aorta arteria innominada incluyendo (IA), salió de la arteria carótida común (ACCV), y la arteria subclavia izquierda (LSA) se muestran. Tenga en cuenta que la constricción aórtica transversal (indicada por la flecha blanca) puede ser visualizado en la TAC, pero no simulada corazón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Color / Doppler de imágenes de la Transverse aorta sangre Fow desde el arco aórtico Ver. Color (A) y las imágenes Doppler PW (B) de farsa y TAC corazones se muestran. Velocidad aórtica picos obtenidos a partir de imágenes Doppler PW se utiliza para calcular el gradiente de presión de acuerdo con la ecuación de Bernoulli modificada (C). Estos datos confirman una cirugía TAC éxito con el gradiente de presión de ~ 70 mmHg. * P <0,05 frente. Impostor. Los datos se expresan como media ± SEM n = 15 para Sham y n = 13 para TAC. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Vista paraesternal eje largo (PLAX) de ratón del corazón sometido a cirugía simulada (A) o TAC (B). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 4. Eje corto paraesternal Ver (PSAX) de ratón del corazón sometido a cirugía simulada (A) o TAC (B). Imágenes en modo M indican la colocación del volumen de la muestra (línea punteada de color amarillo en el panel superior) y la medición de cardiaco dimensiones en la diástole y la sístole (líneas azules en el panel inferior). Los asteriscos indican los músculos papilares. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Evaluación ecocardiográfica de la cardíaco cambios morfológicos y funcionales de la TAC. De imágenes en modo M en el eje corto se llevó a cabo como en la figura 4. (A) LVAWd, espesor de la pared anterior del ventrículo izquierdo en diástole. (B) LVPWd, izquierda grosor de la pared posterior del ventrículo en diástole. (C) LVIDd, dejó diámetro interno del ventrículo en diástole. (D) LVIDs, diámetro interno del ventrículo izquierdo en sístole. (E) LVFS, del ventrículo izquierdo fracción de acortamiento. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) FEVI: fracción de eyección del ventrículo izquierdo. FEVI (%) = (VTDVI-VTS) / VTDVI x100%. VTDVI y VTSVI denotan volumen telediastólico y telesistólico del ventrículo izquierdo, respectivamente. el volumen del VI y fracción de eyección se evalúan con precisión por Simpso el método de n. el volumen del VI se estima por numerosos discos de ajuste en el ventrículo: volumen = Simpson [zona (1) + zona (2) + ... + área (n)] x longitud. área de Simpson y la longitud se obtienen mediante el trazado de la frontera del endocardio del ventrículo izquierdo en el eje largo y eje corto. (G) LV (ventricular izquierda) en masa. Masa del ventrículo izquierdo (mg) = 1,05 x [(+ LVIDd LVPWd + IVSD) 3 - (LVIDd) 3]. El factor de 1,05 representa la densidad específica del miocardio. (H) HR, ritmo cardíaco. * P <0,05 frente. Impostor. El número de ratones analizados se muestra en las barras de cada panel. Los datos se expresan como media ± se utilizó la prueba t de Student SEM para determinar la significación estadística. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 6. Evaluación del flujo sanguíneo transmitral con Doppler Imaging. (A y B) en modo B apical de cuatro cámaras de tratamiento simulado (A) o TAC cardíaca (B). VI, del ventrículo izquierdo; VD: ventrículo derecho; MV, de la válvula mitral; TV, válvula tricúspide; LA, aurícula izquierda; AI: aurícula derecha. (C y D) PW Doppler forma de onda del flujo de sangre trans-mitral en simulado (C) o TAC corazón (D). se muestran las mediciones pertinentes. (E) E / A, E y A pico de relación de velocidad. (F) IVCT, tiempo de contracción isovolumétrica. (G) TRIS: tiempo de relajación isovolumétrica. (H) ET, tiempo de eyección. (I) MPI, índice de rendimiento miocárdico. * P <0,05 frente. Impostor. El número de ratones analizados se muestra en las barras de cada panel. Los datos se expresan como media77; Se utilizó la prueba t de Student SEM para determinar la significación estadística. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La ecocardiografía se ha utilizado ampliamente para evaluar la función cardíaca en modelos de roedores de 2,6 enfermedades del corazón. En comparación con los métodos invasivos o terminales tales como presión-volumen de medición de bucle 11 y ex vivo de trabajo del corazón 12, ecocardiografía proporciona una herramienta poderosa, no invasivo para evaluar los cambios estructurales y funcionales cardíacos en curso en animales vivos. Para obtener datos fiables, es importante mantener la temperatura corporal y el ritmo cardíaco dentro del rango fisiológico 13 por cuidado de ajustar el aparato de calefacción y el nivel de anestesia. Todas las imágenes deben ser capturados y analizados constantemente de acuerdo con los procedimientos de imagen normalizados, para facilitar la comparación entre los ratones de diferente cepa o genotipo.
TAC se utiliza comúnmente para inducir la hipertrofia cardíaca y la insuficiencia cardíaca en ratones 1. la medición no invasiva de la gradiente de presión a través del sitio de la constricción por Dopplerformación de imágenes representa una evaluación fiable del grado de sobrecarga de presión en ratones. El éxito de TAC normalmente produce un gradiente de presión ≥40 mm Hg. Sólo los ratones sometidos a un grado similar de sobrecarga de presión deben ser incluidos para su posterior análisis, mientras que los ratones con un gradiente de presión demasiado baja o demasiado alta deben ser excluidos. Después de TAC, se espera que los ratones de desarrollar hipertrofia cardiaca dentro de 1-2 semanas, y la dilatación cardiaca después de 4 semanas, dependiendo el grado de sobrecarga de presión y el fondo genético de ratones ensayados. La remodelación cardiaca dinámica y cambios funcionales siguientes TAC se pueden evaluar de forma fiable por imagen ecocardiográfico como se describe anteriormente.
En contraste con su uso frecuente en el ser humano 14, color / Doppler sólo ha sido recientemente disponible en roedores de imágenes por ultrasonido 9. Aquí también hemos descrito las aplicaciones de imágenes Doppler en la medición del gradiente de presión, así como el rendimiento sistólica y diastólica. Medidación de las válvulas mitral y tricúspide direccionalidad del flujo sanguíneo y la velocidad (es decir., relación E / A, TRIV, IVCT, ET, y MPI) proporciona información importante sobre la función cardíaca. Por lo tanto ecocardiografía representa una herramienta importante para estudiar la fisiología y la fisiopatología cardiaca en animales pequeños.
La limitación de la ecografía cardíaca está relacionado con la variabilidad de medición y la reproducibilidad. Para reducir la variabilidad inter e intra operador, es importante la estandarización de cómo se adquirieron y analizaron imágenes. Las mediciones deben realizarse desde múltiples ventanas acústicas y modos (B-mode, modo M, PW y / Doppler color) y al menos 3 mediciones independientes deben promediarse para asegurar la exactitud y fiabilidad. Además, hay ventanas acústicas limitados e imágenes de baja calidad a veces se obtienen en pequeños roedores sometidos a procedimientos quirúrgicos, como TAC, debido a la hinchazón del tejido, cicatrices quirúrgicas, y edema pulmonar que interfieren con el ultrasonidovigas. Para Doppler, a veces es difícil de E independiente y ondas A y obtener una forma de onda completa del flujo mitral, debido a la relativamente alta tasa de corazón en roedores pequeños, especialmente en ratones sometidos a cirugía de TAC o IM. La reducción de la frecuencia cardíaca puede ser útil para obtener mediciones, pero esto afectará a los valores obtenidos por Doppler y por tanto la interpretación de los datos.
Con los recientes avances técnicos, sistemas de ultrasonido recién liberados proporcionan alta resolución y frecuencia de imagen / de muestreo para garantizar una medición cuantitativa exacta en pequeños animales. Las nuevas tecnologías de ecocardiografía también mejorarán la sensibilidad de la evaluación ecocardiográfica de la función cardiaca y permitir la detección precoz de la patología cardiaca. Por ejemplo, las imágenes cepa speckle-tracking 15 se ha utilizado para medir con precisión la función miocárdica regional. Las nuevas tecnologías de transductores actualmente en desarrollo proporcionarán la posibilidad de que en tiempo real, 3D o 4Dformación de imágenes. Ecocardiografía de contraste que se encuentra en desarrollo avanzado permitirá mediciones volumétricas, las evaluaciones de la perfusión tisular, la imagen molecular de la enfermedad cardiovascular, y el suministro de agentes terapéuticos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H. Transthoracic echocardiography in mice. J Vis Exp. (39), e1738 (2010).
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. Transverse aortic constriction in mice. J Vis Exp. (38), e1729 (2010).
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
