Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di valutare in modo non invasivo i cambiamenti strutturali e funzionali cardiaci in un modello murino della malattia di cuore creato da trasversali costrizione aortica, con B e M-mode ecocardiografia e colore / impulsi di imaging onda Doppler.
Protocol
Il protocollo segue le linee guida del Comitato Cura e uso istituzionale animali dell'Università di Washington.
1. Procedura chirurgica e preparazione per l'imaging
- Soggetto C57BL / 6 topi per TAC o la chirurgia sham come descritto in precedenza 10.
- Una settimana dopo la TAC o la chirurgia sham, anestetizzare il mouse nella camera di induzione con il 2% isoflurano mescolato con 1 L / min O 2. Verificare il corretto anestesia per mancanza di risposta alla punta o la coda pizzicare. Usare pomata veterinario occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Rimuovere i peli del torace applicando crema depilatoria. Disinfettare la pelle del mouse con il 70% di etanolo.
- Fissare il mouse per una piattaforma di gestione degli animali in posizione supina. Per mantenere un livello costante di anestesia, utilizzare un nosecone per fornire 0,5-1% isoflurano mescolato con 1 L / min O 2.
- Applicare il gel degli elettrodi alle zampe del mouse e incollate al pad elettrodi.
- Inserire una sonda rettale per controllare la temperatura del corpo. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C tramite una piastra elettrica o lampada.
- Applicare uno strato di gel ultrasuoni pre-riscaldato al petto mouse, principalmente zona sovrastante cuore. Nota: rimuovere gel per ultrasuoni e asciugare il mouse con garza sterile dopo la procedura di imaging.
2. Nella aortico vista, utilizzare B-mode e Doppler Imaging per valutare trasversale aortica Costrizione
- Utilizzare l'impostazione B-mode per ottenere la vista arco aortico per visualizzare l'aorta, grandi rami arteriosi, e il sito costrizione.
- Inclinare il lato sinistro della piattaforma fino, per quanto possibile ruotare il mouse in decubito partita. Tenere il trasduttore a ultrasuoni dal basamento in posizione verticale e posizionarlo sul petto lungo la linea parasternale destra, con la tacca di mira verso il mento del mouse. Nota: Non comprimere il torace del mouse quando si abbassa il trasducer; è necessaria quantità minima di pressione.
- Inclinare il trasduttore fino al livello della scapola e ruotare leggermente in senso orario fino a quando aortico entra in vista. Osservare il sito costrizione aortica trasversale, che si trova tra la ramificazione di innominate dell'arteria (IA) e di sinistra arteria carotide comune (LCCA) (Figura 1).
Nota: Non costrizione viene rilevato nel topo sham-operated.
- Fare clic sul pulsante "color Doppler" sulla stazione di lavoro per passare alla modalità Doppler colore per monitorare la direzionalità e la velocità del flusso di sangue attraverso il sito costrizione. Acquisire e memorizzare le immagini facendo clic sul pulsante "store cine".
- Fare clic sul pulsante "PW Doppler" per passare a pulsare modalità onda Doppler, e il volume posto del campione (la casella del cursore tratteggiata) immediatamente distale al sito di costrizione per cercare il getto stenotica con la più alta velocità, quindi fare clic sul pulsante "PW Doppler" per ottenere forme d'onda di fl aorticavelocità di picco ow e misurare (Figura 2).
- Calcola gradiente di pressione attraverso il sito costrizione utilizzando il modificata di Bernoulli equazione: gradiente di pressione = 4 x V max 2. includere solo topi con un gradiente di pressione compresa da 40 a 80 mmHg per ulteriori analisi.
3. Nella parasternale asse lungo View, Usa B-mode e M-mode Imaging per valutare cardiache Dimensioni e della contrattilità
- Con il mouse giace in posizione supina sulla piattaforma, tenere il trasduttore in modo verticale con la punta tacca alla testa del mouse. Abbassare il trasduttore sul torace parallelo alla linea parasternale sinistra e ruotare di 30 ° in senso antiorario.
- Utilizzare immagini B-mode per ottenere un asse lungo pieno "sagittale" del cuore. Regolare l'angolo del trasduttore e concentrarsi profondità di visualizzare ventricolo sinistro, la parete del setto intraventricolare, e un leggero porzione della parete ventricolare destra. Save le immagini per le misurazioni successive di spessore della parete cardiaca e dimensione della camera. Utilizzando "pacchetto cardiaco", selezionare i parametri come IVS o LVAW, LVID e LVPW, quindi fare clic sull'immagine per disegnare le linee corrispondenti per ogni parametro per ottenere le misurazioni.
- Osservare schemi di movimento della parete cardiaca e verificare la presenza di eventuali anomalie di movimento, tra cui acinesia, ipocinesia, e asincronia.
Nota: Acinesia e ipocinesia denotare perdita totale e parziale di movimento della parete cardiaca, rispettivamente. Asincronia denota irregolare, scoordinato movimento della parete cardiaca. - Passare M-mode, posto cursore M-mode perpendicolare alle pareti LV a livello del muscolo papillare, e acquisire immagini per la misurazione successiva di dimensioni cardiaci e accorciamento frazionale (Figura 3).
4. Nella parasternale asse corto View, Usa B-mode e M-mode Imaging cardiaco per valutare Morfologia e funzione
- from la vista parasternale asse lungo, ottenere parasternale asse corto ruotando il trasduttore di 90 ° in senso orario. Regolare il trasduttore che invia un trasversale vista orizzontale "trasversale" del cuore in B-mode, con entrambi i muscoli papillari chiaramente visibili e situati a destra (posizione 2 e 4:00).
- Passare M-mode e posizionare l'asse M-mode a metà del livello del ventricolo sinistro. Acquisire e memorizzare immagini per le misure successive di spessore della parete cardiaca, dimensione della camera, e un accorciamento frazionale (Figura 4). Utilizzando "pacchetto cardiaco", selezionare i parametri in SAX (asse corto) tra cui IVS o LVAW, LVID, e LVPW, e fare clic sull'immagine per disegnare linee corrispondenti per ogni parametro per ottenere le misurazioni.
Nota: Le misurazioni ottenute qui devono correlare strettamente a quelli ottenuti nel lungo vista dell'asse parasternale (Figura 5).
5. Nella vista apicale quattro camere, UsaDoppler Imaging Per valutare sistolica e funzione diastolica
- Ottenere la vista apicale quattro camere di visualizzare ventricoli destro e sinistro con atri in basso dello schermo. In B-mode, dal asse corto, inclinare l'angolo superiore sinistro della piattaforma di angolo di testa del mouse e orientare il trasduttore verso la spalla destra del mouse. Ciò è essenzialmente di ottenere una vista "coronale" del cuore guardando verso l'apice.
- Visualizzare la valvola mitrale in B-mode, e passare alla modalità colore Doppler, ponendo il volume del campione (casella cursore tratteggiata) alla punta della valvola mitrale.
- Passa alla modalità PW Doppler per valutare schemi di flusso attraverso la valvola mitrale. Allineare la sonda Doppler cursore parallelo alla direzione del flusso sanguigno mitrale. Utilizzare un angolo sonda meno di 20 ° per determinare la velocità di picco (Figura 6).
- Salvare le immagini per le misurazioni successive. Utilizzare "pacchetto cardiaco" e selezionare "flusso MV. "Fare clic su ogni parametro e disegnare linee corrispondenti per ottenere le misure misure disponibili sono:. Velocità e di picco (riempimento iniziale con il rilassamento ventricolare attiva), il picco una velocità (in ritardo di riempimento con la contrazione atriale), mitrale relax isovolumetrico e tempi di contrazione (IVRT e IVCT, rispettivamente), e il tempo di eiezione (ET).
- Calcolare l'indice prestazioni miocardica (MPI) di MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
Trattamento 6. post-procedurale di Animal
- Dare analgesia e / o soluzione salina sterile per via intraperitoneale ad animali chirurgiche quando necessario.
- Lasciare che l'animale di recuperare su una piastra elettrica in posizione prona. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito la procedura per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
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Representative Results
La figura 1 mostra le immagini B-mode della vista aortico del cuore del mouse sottoposti a sham (Figura 1A) o la chirurgia TAC (Figura 1B). L'arco aortico, arteria anonima, ha lasciato l'arteria carotide comune, e l'arteria succlavia sinistra sono mostrati. Si noti che costrizione aortica è chiaramente visibile nel TAC, ma non sham cuore. Immagini Color Doppler da vista aortica sono mostrati nella Figura 2A. Le forme d'onda di flusso aortico attraverso il sito costrizione stati catturati da PW Doppler (Figura 2B). Successful TAC porterà ad una velocità di flusso notevolmente aumentato a valle del sito di costrizione (tipicamente ~ 4 m / sec in topi TAC). Gradiente di pressione attraverso la costrizione è stato calcolato sulla base di velocità del flusso di picco, secondo l'equazione della modificata di Bernoulli (Figura 2C).
Figura 3 (Figura 3A) o TAC cardiaca (Figura 3B). Il pannello superiore mostra le immagini B-mode del ventricolo sinistro, il setto interventricolare, ed una porzione del ventricolo destro da topi simulate o TAC. Il pannello inferiore mostra i tracciati M-mode di diversi cicli cardiaci da topi sham o TAC. Le misurazioni di dimensioni cardiache sono indicate, tra cui lo spessore del ventricolo sinistro parete anteriore (LVAW), diametro interno del ventricolo sinistro (LVID), del ventricolo sinistro spessore della parete posteriore (LVPW) in diastole e la sistole. Nota significativamente aumentato spessore della parete nel cuore del mouse sottoposto a TAC rispetto alla chirurgia farsa.
Figura 4 mostra le immagini del parasternale asse corto di finzione (Figura 4A) o TAC cardiaca (Figura 4B). La parte superiore di ciascun pannello mostra l'asse M-mode (dottlinea ed) posto al centro del ventricolo sinistro. La parte inferiore di ciascun pannello è il modo M tracciare linee indicano le dimensioni cardiache come descritto sopra. Come un marker di ipertrofia ventricolare e lo spessore della parete del setto può essere determinato con precisione. I topi sottoposti a TAC hanno mostrato un aumento dello spessore della parete come valutato dal LVAWd e LVPWd, dilatazione ventricolare valutata mediante LVISd e LVISs, diminuita contrattilità come valutato dal LVFS e FEVS, ed ha aumentato la massa LV (Figura 5).
La figura 6 mostra B-mode apicale quattro camere (Figura 6A, B) e PW Doppler immagini di modelli di flusso transmitralico (Figura 6C, D). Le misurazioni sono mostrati di picco E e A velocità, IVCT, IVRT, e ET. Il rapporto E / A e MPI sono calcolate (Figura 6E - I). Un cuore sano del mouse ha un rapporto E / A ≥1 e un valore ≤0.5 MPI. In condizioni patologiche con diametroStolic o disfunzione cardiaca sistolica, come in topi sottoposti a TAC, un ridotto rapporto E / A e / o un aumento del valore di MPI sono tipicamente osservati.
Figura 1. B-mode immagine della aortico Vista del Cuore mouse Sottoposto a Sham Chirurgia (A) o TAC (B). Le principali rami aortici tra cui innominate arteria (IA), ha lasciato comune carotide (LCCA), e l'arteria succlavia sinistra (LSA) sono mostrati. Si noti che costrizione aortica trasversale (indicata dalla freccia bianca) possono essere visualizzati in TAC, ma non sham cuore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Colore / PW Doppler Imaging del Transverse Aorta sangue Fow dal aortico View. Colore (A) e PW (B) le immagini Doppler da sham e TAC cuori sono mostrati. Peak velocità aortica ottenuti dalle immagini PW Doppler viene utilizzato per calcolare gradiente di pressione secondo l'equazione di Bernoulli modificata (C). Questi dati confermano un intervento chirurgico di successo TAC con il gradiente di pressione di ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Sham. I dati sono espressi come media ± sem n = 15 per Sham e n = 13 per TAC. Test t stata utilizzata per determinare la significatività statistica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. parasternale asse lungo (plax) Veduta del Cuore mouse sottoposto a Sham Chirurgia (A) o TAC (B). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .
Figura 4. parasternale asse corto (PSAX) Vista Cuore mouse sottoposto a Sham Surgery (A) o TAC (B). Immagini di modo M indicano la posizione del volume del campione (linea tratteggiata gialla nel pannello superiore) e la misurazione delle cardiaco dimensioni in diastole e la sistole (linee blu nel pannello inferiore). Gli asterischi indicano muscoli papillari. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Valutazione della ecocardiografica cardiaca morfologica e cambiamenti funzionali seguito TAC. Immagini M-mode in asse corto è stato eseguito come in Figura 4. (A) LVAWd, sinistra spessore della parete ventricolare anteriore in diastole. (B) LVPWd, sinistra ventricolare spessore della parete posteriore in diastole. (C) LVIDd, ha lasciato diametro interno del ventricolo in diastole. (D), LVIDs sinistra diametro interno del ventricolo in sistole. (E) LVFS, del ventricolo sinistro accorciamento frazionale. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) FEVS, frazione di eiezione ventricolare sinistra. FEVS (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV e LVESV denotano volume telediastolico e telesistolico del ventricolo sinistro, rispettivamente. volume di LV e frazione di eiezione sono appunto valutati da Simpso Il metodo di n. volume di LV è stimata da raccordo numerosi dischi nel ventricolo: Volume Simpson = [zona (1) + zona (2) + ... + zona (n)] x lunghezza. zona Simpson e la lunghezza sono ottenuti tracciando il confine endocardico del ventricolo sinistro in asse lungo e asse corto. (G) LV (ventricolo sinistro) di massa. LV di massa (mg) = 1.05 x [(+ LVIDd LVPWd + IVSD) 3 - (LVIDd) 3]. Il fattore 1,05 rappresenta la densità specifica del miocardio. (H) HR, la frequenza cardiaca. * P <0,05 vs. Sham. Il numero di topi analizzati è mostrato nelle barre di ciascun pannello. I dati sono espressi come media ± t-test di Student sem stata utilizzata per determinare la significatività statistica. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 6. Valutazione della transmitralico flusso sanguigno dal Doppler Imaging. (A e B) B-mode apicale quattro camere di sham (A) o TAC cardiaca (B). LV, ventricolo sinistro; RV, ventricolo destro; MV, valvola mitrale; TV, valvola tricuspide; LA, a sinistra dell'atrio; RA, atrio destro. (C e D) PW Doppler forma d'onda del flusso sanguigno trans-mitrale in sham (C) o TAC (D) cuore. le misurazioni rilevanti sono mostrati. (E) E / A, picco E e un rapporto di velocità. (F) IVCT, tempo di contrazione isovolumic. (G) IVRT, tempo di rilassamento isovolumetrico. (H) ET, il tempo di espulsione. (I) MPI, indice di performance miocardica. * P <0,05 vs. Sham. Il numero di topi analizzati è mostrato nelle barre di ciascun pannello. I dati sono espressi come media77; t-test di Student sem stata utilizzata per determinare la significatività statistica. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'ecocardiografia è stato ampiamente utilizzato per valutare la funzione cardiaca in modelli di roditori di malattie cardiache 2,6. Rispetto alle metodologie invasive o terminali, come la pressione-volume di misura del ciclo 11 e ex vivo di lavoro del cuore 12, l'ecocardiografia fornisce un potente, strumento non invasivo per valutare i cambiamenti strutturali e funzionali cardiache in corso in animali viventi. Per ottenere dati affidabili, è importante mantenere la temperatura corporea e la frequenza cardiaca nel range fisiologico 13 mediante accurata regolando l'apparecchio di riscaldamento e il livello di anestesia. Tutte le immagini devono essere acquisiti e analizzati costantemente secondo le procedure di imaging standardizzate, per facilitare il confronto tra i topi di ceppo o genotipo diverso.
TAC è comunemente usato per indurre l'ipertrofia cardiaca e insufficienza cardiaca nei topi 1. la misurazione non invasiva del gradiente di pressione attraverso il sito costrizione da DopplerImaging rappresenta una valutazione affidabile del grado di sovraccarico di pressione nei topi. Il successo TAC in genere produce un gradiente di pressione ≥40 mmHg. Solo i topi sottoposti a simili grado di sovraccarico di pressione dovrebbero essere inclusi per ulteriori analisi, mentre i topi con un gradiente di pressione troppo bassa o troppo alta dovrebbero essere esclusi. Dopo TAC, i topi sono tenuti a sviluppare ipertrofia cardiaca entro 1-2 settimane, e dilatazione cardiaca dopo 4 settimane, a seconda del grado di sovraccarico di pressione e il background genetico dei topi testati. Il rimodellamento cardiaco dinamica e cambiamenti funzionali seguenti TAC possono essere attendibilmente valutati mediante imaging ecocardiografico come descritto sopra.
In contrasto con il suo utilizzo frequente negli esseri umani 14, colore / PW Doppler è stato recentemente disponibile in roditori imaging ad ultrasuoni 9 solo. Anche qui abbiamo descritto le applicazioni dell'imaging Doppler nella misurazione gradiente di pressione così come le prestazioni sistolica e diastolica. Misurarezione di mitrale e tricuspide direzionalità del flusso sanguigno e la velocità (ad es., rapporto E / A, IVRT, IVCT, ET, e MPI) fornisce informazioni importanti sulla funzione cardiaca. Così l'imaging ecocardiografico rappresenta uno strumento importante per lo studio della fisiologia cardiaca e fisiopatologia nei piccoli animali.
La limitazione di ecografia cardiaca è correlata alla variabilità misurazione e riproducibilità. Per ridurre inter e intra variabilità dell'operatore, è importante standardizzare modo le immagini vengono acquisiti ed analizzati. Le misurazioni devono essere eseguite da più finestre acustiche e modalità (B-mode, M-mode, e PW / color Doppler) e almeno 3 misurazioni separate devono essere mediati per garantire l'accuratezza e l'affidabilità. In aggiunta, ci sono finestre acustiche limitate e le immagini a volte di bassa qualità sono ottenuti in piccoli roditori sottoposti a procedure chirurgiche come TAC, a causa di gonfiore dei tessuti, cicatrici chirurgiche, ed edema polmonare che interferiscono con gli ultrasuonitravi. Per Doppler, a volte è difficile da onde A E separata e ed ottenere una forma d'onda completa del flusso mitrale, a causa di un tasso relativamente alto del cuore in piccoli roditori, soprattutto in topi sottoposti a TAC o MI chirurgico. L'abbassamento della frequenza cardiaca può essere utile per ottenere misurazioni, ma questo influenzerà valori ottenuti mediante Doppler e quindi l'interpretazione dei dati.
Con i recenti progressi tecnici, sistemi a ultrasuoni appena rilasciati forniscono immagini ad alta risoluzione e frame rate / di campionamento per assicurare una misurazione quantitativa accurata nei piccoli animali. Le nuove tecnologie ecocardiografia anche migliorare la sensibilità della valutazione ecocardiografica della funzione cardiaca e permettere la diagnosi precoce di patologia cardiaca. Ad esempio, l'imaging ceppo speckle-tracking 15 è stato utilizzato per misurare con precisione la funzione miocardica regionale. Le nuove tecnologie trasduttori attualmente in fase di sviluppo fornirà il potenziale in tempo reale, 3D o 4Dimaging. Contrasto ecocardiografia che è in sviluppo avanzato consentirà di misurazioni volumetriche, valutazioni perfusione tissutale, imaging molecolare di malattie cardiovascolari, e la consegna di agenti terapeutici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
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