Introduction
Prioner er alvorlige nevrodegenerative sykdommer som påvirker sentralnervesystemet. Prionsykdommer et resultat av uriktig folding av den normale cellulære prion protein, PrP C, ved en infeksiøs isomer kalt PrP Res. Disse sykdommene påvirke en rekke arter inkludert bovin spongiform encefalopati hos kyr, skrapesyke hos sau, kronisk sløse sykdom i hjortedyr, og Creutzfeldt-Jakobs sykdom hos mennesker 1-3. Prioner føre nevrodegenerasjon som starter med synaptiske tap, og utvikler seg til vacuolization, gliose, neuronal tap, og plakk innskudd. Til slutt, noe som resulterer i døden av dyr / individuell 4. I flere tiår har forskere undersøkt forbindelser ment å bremse eller stoppe utviklingen av prion sykdom. Men forskerne har ikke funnet enten en vellykket behandling eller en effektiv systemisk levering kjøretøy.
Endogen PrP C ekspresjon er nødvendig for utvikling av prionsykdommer 5 C ekspresjon resulterer i en forsinkelse eller lindring av sykdommer. Flere grupper opprettet transgene mus med reduserte nivåer av PrP C eller injisert lentivectors uttrykker shRNA direkte inn murine hjernevev å undersøke hvilken rolle PrP C uttrykk nivåer i prion sykdom. Disse forskerne funnet å redusere mengden av nevronale PrP C resulterte i å stanse progressiv nevropatologi av prionsykdommer og forlenget levetid for dyrene 6-9. Vi har rapportert at PrP C siRNA behandling resulterer i clearance av PrP Res i mus neuroblastom celler 10. Disse studiene tyder på at bruk av behandlinger for å redusere PrP C-ekspresjonsnivåer, som små interfererende RNA (siRNA), som spalter mRNA, kan i tilstrekkelig grad forsinke progresjonen av prionsykdommer. Imidlertid var de fleste behandlinger undersøkt for prionsykdommer levert på en måte som ikke ville være praktiski en klinisk setting. Derfor må et siRNA terapi et systemisk avleveringssystem, som leveres intravenøst og målrettet til CNS.
Forskere har studert bruken av liposomer som bærere for levering genterapi produkter. Kationiske og anioniske lipider er begge brukes i dannelsen av liposomer. Kationiske lipider er mer utbredt enn anioniske lipider, fordi ladningsforskjell mellom det kationiske lipid og DNA / RNA muliggjør effektiv pakking. En annen fordel med kationiske lipider er at de krysser cellemembranen lettere enn andre lipider 11-14. Men kationiske lipider er mer immunogen enn anioniske lipider 13,14. Derfor har forskerne begynt å skifte fra å bruke kationisk til anioniske lipider i liposomer. Genterapi produkter kan effektivt pakket inn anioniske liposomer ved hjelp av positivt ladede peptidet protaminsulfat, som kondenseres DNA / RNA-molekyler 15-19. Siden anioniske Lipids er mindre immunogene enn kationiske lipider de kan ha økt sirkulasjonstider, og kan bli mer tolereres i dyremodeller 13,14. Liposomer er rettet mot spesifikke vev ved hjelp av targeting peptider som er festet til liposomer. Den RVG-9r neuropeptid, som binder seg til nikotin-acetylcholin-reseptorer, har blitt brukt til å målrette siRNA og liposomer til CNS 17-20.
Denne rapport beskriver en protokoll for å fremstille tre siRNA levering av kjøretøy, og til å pakke og levere den siRNA til nerveceller (figur 1). Liposom-siRNA-peptid-komplekser (LSPCs) er sammensatt av liposomer med siRNA og RVG-9r rettet mot peptidet elektrostatisk festet til den ytre overflaten av liposomet. Peptidet løses liposom-innkapslede terapeutiske siRNA (PALETS) er sammensatt av siRNA og protamin innkapslet i liposomet, med RVG-9r kovalent bundet til lipid PEG-grupper. Bruke nedenfor metoder for å generere LSPCs og PALETS, PrP C siRNA avtar PrP C uttrykk opp til 90% i neuronale celler, som har meget lovende for å kurere eller i det vesentlige forsinke utbruddet av prionsykdom patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble avlet og holdt på Lab Animal Resources, akkreditert av Association for Assessment and Accreditation av Lab Animal Care International, i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Colorado State University.
1. Utarbeidelse av LSPCs
- Bruke en 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimetylammonium-propan): kolesterol-forholdet for LSPCs. For en 4 nmol liposompreparat, bland 2 nmol av DOTAP og 2 nmol av kolesterol til 10 ml av en 1: 1 kloroform: metanol løsning i en kolbe.
- Fordamp 9 ml av kloroform: metanol løsning ved hjelp av N2-gass i en avtrekkshette. Fordampe de siste 1 ml væske i en avtrekkshette over natten uten gass. Observere en tynn lipidfilm på bunnen av kolben.
- Varme 10 ml av en 10% sukroseløsning til 55 ° C.
- Hell den oppvarmede 10% sukrose-oppløsning på den tynne lipidfilmen langsomt, dvs. 1 ml / min, mens gently virvlende kolben. Opprettholde 10% sukrose og kolbe med lipider ved 55 ° C, slik at lipidmolekylene blir værende i gel-væskefasen. Rehydrering resultater i multilamellære vesikkel (MLV) dannelse.
- Tillat lipider for å rehydrere ved 55 ° C i minst en time før dimensjonering av liposomene.
- Monter en ekstruder henhold til produsentens anvisninger med 1,0 mikrometer filtre eller bruke 1,0 mikrometer sprøytefiltre for dimensjonering.
- Tilsett 1 ml av den oppvarmede liposomsuspensjonen til en av sprøytene på ekstruderen, og passerer suspensjonen mellom de to sprøytene 11 ganger. Sørg for at suspensjonen er i motsatt sprøyte enn å starte sprøyten etter de 11 passerer.
- Størrelse liposomene igjen gjennom 0,45 mikrometer deretter 0,2 mikrometer filtrene til å generere store unilamellære vesikler (LUV'er). Hold liposomsuspensjonen oppvarmet for enklere dimensjonering.
- Inkuber 20 ul av 4 nmol liposomsuspensjonen (200 pM) med 200 ul av en 20 uM (4-nmol totalt) lager siRNA-løsning i 10 minutter ved romtemperatur.
- Inkuber 80 ul av en 500 um (40 nmol totalt) lager RVG-9r løsningen med siRNA / liposom-løsning i 10 minutter ved RT. LSPCs bør brukes så raskt som mulig, men kan brukes opp til flere timer etter fremstillingen. Oppbevar LSPCs ved 4 ° C i flere timer etter tilberedning.
2. Utarbeidelse av PALETS
- Bruke en 55: 40: 5 molart forhold på enten DSPE (1,2-distearoyl-sn-glysero-3-phosphoethanolamine): kolesterol: DSPE-PEG eller DOTAP: kolesterol: DSPE-PEG for PALETS. For en 4 nmol liposompreparat, bland 2,2 nmol enten DSPE eller DOTAP, 1,6 nmol av kolesterol, og 0,2 nmol DSPE-PEG i 10 ml av en 2: 1 kloroform: metanol løsning i en kolbe.
- Fremstille liposom-suspensjon nøyaktig som beskrevet i trinn 1.1 og 1.2 ovenfor. Rehydrere DSPE liposomer i 10 ml 1 x PBS oppvarmet til 75 ° C, tilsetning av 1 ml / min. Tillat lipider for å rehydrere ved 75 ° C iminst 1 time før liming.
- Størrelse liposomsuspensjonen nøyaktig som beskrevet i trinn 1.6 til 1.8.
- Pipetter 20 ul av hver av de fire nmol (200 uM) liposomsuspensjoner til engangsbruk alikvoter etter DOTAP og DSPE liposomer har vært størrelse, og lyofilisere i 30 minutter ved hjelp av en bord- frysetørker (figur 2).
- Inkubere 200 ul av en 20 um (4 nmol totalt) lager siRNA løsning med 1,4 pl av en 26,6 mM oppløsning av protamin-sulfat i 10 minutter ved RT i siRNA som skal innkapsles i DSPE palets liposomer.
- Rehydrere DOTAP palets liposomer med 200 ul av en 4 nmol stamløsning av siRNA eller rehydrere DSPE palets liposomer med 201,4 mL av siRNA / protamin løsning. Inkuber liposom / siRNA-løsning i 10 minutter ved RT.
- Tilsett 10 ul av en 60 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimidhydroklorid (EDC) løsning av liposom / siRNA løsning for både DOTAP og DSPE PALETS.
- Tilsett 10 mL av en 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) løsning på liposom / siRNA løsning for både DOTAP og DSPE PALETS.
- Inkuber EDC og sulfo-NHS med siRNA / liposom-suspensjonen i 2 timer ved RT.
- Inkuber 80 ul av en 500 um (40 nmol totalt) lager RVG-9r løsningen med siRNA / liposom-tverrbindingsløsning i 10 minutter ved RT.
MERK: EDC / sulfo-NHS lar RVG-9r til kovalent binding til PEG lipider. Bruk PALETS innen flere timer etter tilberedning. Oppbevar PALETS ved 4 ° C i flere timer etter tilberedning. - For å bestemme siRNA innkapsling effektivitet av PALETS:
- Måle konsentrasjonen av siRNA før og etter tilsetning av protamin og liposomer ved hjelp av et spektrofotometer innstilt på 260 nm.
- Filtrer innkapslet siRNA fra liposomoverflaten / innkapslet siRNA suspensjonen med 50 kDa sentrifugal filtre. Sentrifuger ved 1000 xg i 20 min.
- Måle konsentrasjonen avuinnkapslet siRNA i filtratet og konsentrasjonen av innkapslet siRNA i retentatet ved hjelp av et spektrofotometer ved 260 nm.
3. Injeksjon mus med LSPCs eller PALETS
- Expose mus for 5-10 min til en varmelampe for å utvide blodkar.
- Anesthetize mus med en 2-3% isofluorane / oksygen strømme 5-10 min før injeksjon, og under injeksjon. Bekreft anesthetization når dyret er ikke lenger ambulant og respirasjon har bremset ved å gjøre en tå klype. Plasser musen på ryggen eller på siden for å få tilgang til halevenen. Bruk veterinær salve på musens øyne for å hindre uttørking mens under anestesi.
- Tørk / spray halen med 70% EtOH og injisere 300 ul LSPCs eller PALETS på halevenen til musen ved hjelp av en 26 G insulinsprøyte. Begynn å injisere distalt i halevenen og flytte proksimalt hvis vene kollapser eller brudd.
- Plasser musen i et rent bur inntil det opprettholder sternal recumbency. Ikke plasser mobruk med andre bur kamerater før den er helt frisk igjen. Mus bør komme seg i 5 til 15 min. De kan plasseres på en varmepute eller under en varmelampe for å opprettholde kroppstemperaturen dersom utvinning tar lengre tid. Mus bør overvåkes nøye for å sikre mot overoppheting.
- Overvåk dyret flere timer etter injeksjonen for å sikre anestesi slites av, og det er ingen dårlig effekt av behandlingen. La de LSPCs eller PALETS å sirkulere i minst 24 timer.
4. Analyse av Protein Expression via flowcytometrisystemer
- Avlive mus med en 20% CO 2 strømningshastighet i 15 min.
- Dissekere ut en halv halvkule av hjernen ved å skjære bort huden og skalle av musen med saks. Skrelle bort en halv halvkule av hjerne bort fra hodeskallen ved hjelp av en tang eller slutten av en saks.
- Trykk halv en halvkule av hjerne fra hver mus via en 40 um maskecelle sil med 2,5 ml FACS-buffer (1xPBS, 1% føtalt bovint serum, 10 mM EDTA) i en petriskål med stempelet i en sprøyte.
- Skyll celle sil og petriskål med ytterligere 2,5 ml FACS buffer. Sett enkeltcelle-suspensjon i et 15 ml konisk rør på is.
- Pipetter 100 ul av 5 ml enkelt cellesuspensjon til et 1,5 ml mikrosentrifugerør og sentrifuger i 5 minutter ved 350 x g. Kast supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml FACS-buffer. Spin 350 xg i 5 min. Gjenta med en annen 1 ml FACS buffer. Hold cellesuspensjonen på is.
- Cellene inkuberes i 100 ul av 1: 100 fortynning av en 0,5 mg / ml rotte-anti-muse-Fc-blokk i FACS-buffer i 30-60 minutter på is. Pellet og vaske cellene som i trinn 4.5. Hold cellesuspensjonen på is.
- Cellene inkuberes i 100 ul av en 20 ug / ml fluorescerende antistoff mot mus PrP C i 7% museserum i FACS-buffer på is i 30-60 min. Pellet og vaske cellene som i trinn 4.5. Hold cellesuspensjonenpå is.
- Pellet og re-suspendere cellene i 1 ml av RBC-lyseringsbuffer (1 x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO3, 0,1 mM EDTA) i 1 min. Pellet som i trinn 4.5 og resuspender cellene i 1 ml FACS-buffer. Hold cellesuspensjonen på is.
- Analyser PrP C uttrykk ved hjelp av et strømningscytometer som beskrevet tidligere 10. Gate leve celler fra total cellepopulasjon. Gate PrP C + celler fra levende celle befolkningen å bestemme MFI (median fluorescerende intensitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å øke effektiviteten av siRNA innkapsling innen anioniske PALETS ble siRNA blandet med protamin. For å bestemme den beste protamin-konsentrasjon for den siRNA, ble siRNA blandet med forskjellige konsentrasjoner av protamin, fra 1: 1 til 2: 1 (figur 3A). Det var en 60-65% siRNA innkapslingseffektivitet i anioniske liposomer uten bruk av protamin. Prøver med protamin: siRNA molare forhold fra 1: 1 til 1,5: 1 (133-266 nM) hadde 80-90% siRNA innkapsling. Molare forhold over 1,5: 1 resulterte i utfelling av siRNA / protamin-komplekser. Disse utfelte komplekser ble ikke innkapslet i anioniske liposomer. Etter tilsetning av protamin til siRNA var det en liten nedgang i konsentrasjonen av siRNA, på grunn av fortynning; imidlertid holdt konsentrasjonen stabil etter tilsetning av protamin (figur 3B). Etter filtrering liposomene med 50 kDa-filtre, 90-95% av siRNAvar assosiert med liposomet retentatet, mens 5-10% av siRNA var "gratis" i filtratet. Ingen siRNA ble påvist i protamin eller liposome bare prøver (Figur 3C).
For å bestemme effekten av LSPCs in vivo, ble villtype-mus behandlet med LSPCs i 24 timer. PrP C ekspresjonsnivåene av villtype-mus behandlet med LSPCs ble sammenlignet med mus behandlet med 1 x PBS og til PrP knockout (PrP KO) mus (figur 4). Strømningscytometrisk analyse av PrP C i hjernen hos mus behandlet med LSPCs viste en reduksjon i PrP-C-nivåer (figur 4A og 4B). I ett eksperiment, alle musene hadde 80-90% reduksjon av PrP C nivåer, i nærheten av PrP C-nivåer som ble observert i de PrP KO-mus (figur 4A). Mus behandlet med LSPCs i ytterligere to uavhengige eksperimenter viste en 40-80% reduksjon av PrP C </ sup> nivåer (Figur 4B). Ut av de totale LSPCs behandlet mus (n = 14), var det bare en mus hadde ingen svar på LSPCs.
Figur 1:. Oversikt over protokoll for å generere palets / LSPCs og levere siRNA Intravenøst til CNS av mus liposomer ble generert via den tynne lipid film hydrering metode. PrP C siRNA ble deretter festet til liposomene enten gjennom en elektrostatisk interaksjon eller ved innkapsling. De PALETS eller LSPCs ble avsluttet ved tilsetning av CNS målretting peptid RVG-9r. Etter montering, de PALETS / LSPCs ble injisert i hale årer av mus, og 24 timer etter behandling PrP C uttrykk ble undersøkt via flowcytometri. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Protokoll for Thin Film lipid Hydrering metode for å generere DSPE liposomer for PALETS leveringsmiddelet Lipidene ble oppløst og blandet i et kloroform:. Metanol-oppløsning, som ble inndampet for å generere en tørr lipidfilm. Den tørre lipidfilm ble resuspendert i 1 x PBS for å lage multilamellære vesikler (MLV). MLV ble så jevnt størrelse ved hjelp av en ekstruder å generere LUV. De LUV kan deretter brukes i suspensjon eller frysetørket i engangsbruk porsjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Innkapsling Effektivitet av siRNA inn DSPE PALETS u Sing protaminsulfat. (a) ca. 60-65% av den siRNA ble innkapslet uten tilsetning av protamin. Med tillegg av protamin, var det en 90% innkapslingseffektivitet mellom 1: 1 og 1,5: 1 protamin: siRNA-forhold. (B) Etter frafiltrering ut av liposomene fra en hvilken som helst fri siRNA, ble 90% av siRNA som finnes i den liposomale fraksjonen, mens 5-10% av ikke-innkapslet siRNA ble funnet i filtratet. (C) Protamine og liposom bare løsninger er fri for innkapslet siRNA. Omtrent 60-65% av siRNA ble innkapslet i liposomer DSPE uten bruk av protamin. Med bruk av protamin ved en konsentrasjon på 186,2 nM, ble omtrent 90% av den siRNA innkapslet i liposomene DSPE. Feilfelt indikerer SEM. **** Indikerer P <0,0001. * Indikerer p <0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. Representative flowcytometrisk analyse av hjernecellesuspensjoner 24 timer etter behandling med LSPCs LSPCs ble injisert inn i halevenen av villtype-mus og hjernene ble høstet 24 timer senere. PBS ble anvendt som en kontroll behandling, og en PrP KO mus ble brukt som en kontroll for PrP C-nivå. (A) Mus ble behandlet med LSPCs viste en signifikant reduksjon av PrP-C-nivåer sammenlignet med PBS-kontroll, som viser villtype-PrP C-nivå. De LSPCs behandlede mus viste PrP C nivåer nær at av en PrP KO mus. (B) Kumulative data fra tre uavhengige eksperimenter som bruker den samme 24-timers behandlingsprotokoll viste den relative mengde av PrP C i PBS villtype og LSPCs behandlede mus. Tvers av de tre forsøkene, mus behandlet med LSPCs shogifte betydelig nedgang i PrP C nivå i forhold til PBS villtype kontroller. Feilfelt indikerer SEM. *** Indikerer p <0,0003. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne rapporten beskriver en protokoll for å lage to målrettede leveringssystemer som effektivt transporterer siRNA til CNS. Tidligere metoder for å levere siRNA til CNS inkludert å injisere siRNA / shRNA vektorer direkte inn i hjernen, intravenøs injeksjon av målrettet siRNA eller intravenøs injeksjon av ikke-målrettede liposom-siRNA komplekser. Injeksjon av siRNA / shRNA vektorer inn i CNS medfører en reduksjon i mål protein uttrykk nivåer. Imidlertid ikke siRNA / shRNA ikke diffundere fritt gjennom CNS. Videre har disse injeksjonene føre til skade på den tilstøtende nervevev 6-9. Den intravenøse injeksjon av målrettet siRNA resulterer også i reduksjon av målproteinet. Men de fleste av de siRNA forringes av serumproteiner 20. Til slutt, intravenøs injeksjon av vilkårlige liposom-komplekser siRNA resulterer i innfanging av siRNA i leveren og nedbrytning av det mononukleære fagocyttsystemet 21. SiRNA leveringkjøretøyer som er beskrevet ovenfor, LSPCs og PALETS, gi en tryggere, mer effektiv og effektiv levering system enn tidligere metoder ved å levere siRNA direkte til CNS. De LSPCs og PALETS er også i stand til å transportere andre lite molekyl medikamenter til CNS.
PALETS eller LSPCs bør brukes i løpet av få timer etter montering. Ellers er det en risiko for at siRNA å bli ikke-fungerende / degradert. Den andre kritiske trinnet som ikke kan stoppes / avbrytes er fremstillingen og driften av cellesuspensjonen for strømningscytometri. Det er viktig å utføre flowcytometri på den samme dag som cellesuspensjonen fremstilles, siden suspensjonen inneholder levende celler som har behov for å være i live for analyse.
Det er noen skritt innenfor protokoll som kan endres avhengig av om LSPCs eller PALETS vil bli brukt in vitro eller in vivo, på hva lite molekyl narkotika er lastet inn i LSPCs eller PALETS, og på arbeidskraftAtory preferanse. For det første kan lipid molare forhold mellom LSPCs og PALETS være optimalisert for andre anvendelser. Imidlertid, fosfatidyletanolamin (PE i DSPE) hydrerer dårlig når det brukes ved en 60% vekt / vekt eller høyere. Når de anvendes ved disse høyere konsentrasjoner, vil DSPE molekyler aggregere med hverandre og danner en uoppløselig masse av lipider. Denne massen av lipider er ikke i stand til å kapsle siRNA. Hvis N2-gass ikke er tilgjengelig, kan lipid blandingen tørkes ved hjelp av fordampning. Fordampning tar ca 3 dager, og bør utføres i en avtrekkshette på grunn av bruk av metanol og kloroform. I denne protokollen, ble den tynne lipidfilmen resuspendert med 1 x PBS, men det kan også være resuspenderes med andre væskebuffere. Andre buffere inkluderer vann, 10% sukrose, eller en hvilken som helst annen vandig buffer. Valget av rehydrering-buffer er avhengig av den påtenkte anvendelse av liposomene og det middel som innkapsles i liposomer 22,23. Hydratiseringen buffer bør holdes over den gel-liquid krystall overgangstemperatur (Tc eller Tm) av lipider eller liposomene vil ikke rehydrere ordentlig. I den beskrevne protokoll, ble de suspenderte liposomene uniformt størrelsessortert ved anvendelse av en ekstruder. Imidlertid kan liposomene også være dimensjonert ved hjelp av sprøytefilter eller lydbehandling. De samme filter porestørrelser som brukes til ekstruderen kan anvendes som sprøytefiltre. Dessuten kan liposomsuspensjonen bli endret etter hydrering med siRNA løsning. Imidlertid observerte vi et tap av siRNA fra liposomer når størrelse av ekstruderen etter hydrering trinn (upubliserte data).
Siden den biologiske rolle av PrP C ennå ikke er forstått 5, er det mulig at det kan være noen skadelige effekter produsert ved reduksjon av PrP C-nivå. Imidlertid, fordi prion protein mangelfull mus utvikler, oppfører seg, og alder normalt 24, er det sannsynlig at disse skadelige virkninger ville enten være mindre eller ikke synlig synlig. Videre siRNA knockdown av PrP <sup> C uttrykk ville ikke helt avskaffe protein uttrykk og er fullstendig reversibel uten mulighet for viral onkogenese, i motsetning lentivector RNAi 23.
Begrensninger med leveringssystemer inkluderer redusert opptak av anioniske PALETS i biologiske membraner, og immuniteten til LSPCs grunn av kationiske lipider. Dersom immunogenisiteten av de LSPCs observeres, kan PALETS brukes som et alternativ. Redusert opptak av anioniske PALETS til anioniske biologiske membraner kan overvinnes ved hjelp av kationiske PALETS, eller ved å reformulere anioniske PALETS med en blanding av kationiske og anioniske lipider.
I denne rapporten, reduksjon av PrPC varierer mye fra mus til mus. Denne variasjon kan skyldes en rekke faktorer: variasjon mellom mus, den lille diameter av årer i mus, eller degradering av siRNA. Bruken av innavlede mus skal eliminere mye av variasjonen mellom mus, men variasjonen er alltid mulig selvmed innavlede mus. Også mus har svært små blodårer i forhold til andre dyremodeller. Så, å injisere et stort volum inn i venene i mus kan være problematisk. Vi anbefaler å trene injeksjoner før du prøver å injisere PALETS eller LSPCs. Men selv med praksis, noen ganger tar det fortsatt et par injeksjoner for å få alle volumet av palets / LSPCs i musen, og venen kan kollapse når som helst en av disse injeksjonene. Så kan en mus motta all volumet av palets / LSPCs, mens en annen mus kan bare motta 75-90% av palets / LSPCs volum.
Andre mulige kilder for variasjon omfatter sirkulasjonstiden og nedbrytning av siRNA av serumproteiner. De palets / LSPCS kan sirkulere lenger før nå hjernen i en mus i forhold til en annen, noe som kan forklare variasjonen. Vi har bare lov LSPCs å sirkulere i 24 timer før euthanizing mus i det foregående eksperiment. Dersom sirkulasjonstiden forårsaker variasjonen, deretter øke Circulasjon tid utover 24 timer bør redusere litt variasjon. Selv om vi pakke siRNA med palets / LSPCs, er det alltid en sjanse for degradering av siRNA og / eller levering kjøretøy. Som tidligere nevnt, de kationiske lipider er svakt immunogene. Så hvis immunceller i blodet angriper biler, så det ville ta lengre tid for kjøretøyene som skal leveres til hjernen eller kjøretøyer kan bli degradert. Bytte fra kationiske lipider til anionisk PALETS kan bidra til å redusere langsom sirkulasjon tid eller nedbrytning ved bruk av kationiske lipider.
Den RVG-9r peptid transporterer LSPCs og PALETS til en celle i CNS som inneholder nikotin acetylkolin reseptorer. Dette inkluderer både nerveceller mikrogliaceller celler og astrocytter 26. For PALETS eller LSPCs å være en effektiv behandling for prionsykdommer er det viktig å målrette alle celler som bidrar til patogenesen prion. Nerveceller inneholder mest PrP C 27,28. Målretting neuronale celler og redusere cellenes PrP C uttrykk kan resultere i en reduksjon av prion patogenese. Imidlertid neuronale celler er ikke den eneste celletype som bidrar til prionsykdom. Astrocytter har vært innblandet i replikering av prioner 29,30. Derfor, ikke bare er det viktig å målrette nevronale celler, men også å målrette astrocytter for å redusere prion patogenese.
Avleveringssystemene som beskrives her er mottagelig for forskjellige strategier for optimalisering som ville gjøre dem egnet for et bredt spekter av sykdoms anvendelser. LSPCs og PALETS er i stand til å transportere ethvert lite molekyl medikament til sentralnervesystemet, ikke bare siRNA, noe som gir kjøretøyene potensiale til å behandle mer enn bare nevrodegenerative sykdommer. PALETS og LSPCs kan brukes til å behandle noen sykdom som påvirkerhjernen avhengig av lite molekyl medikament er lagt inn i kjøretøyene. Dessuten endrer målretting peptid kan tillate levering kjøretøy for å levere små molekyl narkotika til en bestemt undergruppe av celler i CNS, i stedet for en celle som har acetylkolin reseptorer. PALETS og LSPCs representerer en ny, mer effektiv og fleksibel levering system for bioteknologiske legemidler til behandling av sykdommer som påvirker sentralnervesystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
