Introduction
Prionen zijn ernstige neurodegeneratieve ziekten die het CZS beïnvloeden. Prionziekten voortvloeien uit het verkeerd vouwen van de normale cellulaire prioneiwit PrP C door een infectieus isomeer genaamd PrP Res. Deze ziekten treffen diverse soorten waaronder bovine spongiforme encefalopathie bij runderen, scrapie bij schapen, Chronic Wasting Disease bij hertachtigen en ziekte van Creutzfeldt-Jakob bij mensen 1-3. Prionen veroorzaken neurodegeneratie dat begint met synaptische verlies, en zich ontwikkelt tot vacuolisatie, gliosis, neuronaal verlies, en plaque deposito's. Uiteindelijk resulterend in de dood van het dier / individu 4. Al tientallen jaren, hebben de onderzoekers onderzochten verbindingen bedoeld om te vertragen of stoppen van de progressie van prionziekte. Onderzoekers hebben echter niet gevonden ofwel een succesvolle therapie of een effectieve systemische afgifte vehikel.
Endogene PrP C expressie is vereist voor de ontwikkeling van prionziekten 5 C expressie resulteren in een vertraging of verbetering van de ziekte. Verschillende groepen die transgene muizen met verlaagde PrP C of geïnjecteerd lentivectors shRNA tot expressie direct in muizen hersenweefsel om de rol van PrP C expressieniveaus in prionziekte onderzocht. Deze onderzoekers vonden verminderen van de hoeveelheid neuronale PrP C leidde tot het stoppen van de geleidelijke neuropathologie van prionziekten en verlengde de levensduur van de dieren 6-9. We hebben gemeld dat de behandeling PrP C siRNA resultaten in klaring van PrP Res in de muis neuroblastoma cellen 10. Deze studies suggereren dat het gebruik van therapieën om PrP C expressieniveaus verlagen, zoals kleine interfererende RNA (siRNA), die splitst mRNA kan te vertragen de progressie van prionziekten. De meeste therapieën onderzocht voor prionziekten afgeleverd op een manier die niet praktisch zou zijnin een klinische setting. Daarom is een siRNA therapie heeft een systemische afgifte, dat intraveneus wordt geleverd en gericht op het CZS.
De onderzoekers hebben het gebruik van liposomen als levering voertuigen voor gentherapie producten bestudeerd. Kationische en anionische lipiden worden zowel bij de vorming van liposomen. Kationische lipiden worden meer gebruikt dan anionogene lipiden, omdat het verschil in lading tussen de kationische lipiden en DNA / RNA maakt efficiënt verpakken. Een ander voordeel van kationische lipiden is dat het overschrijden van de celmembraan gemakkelijker dan andere lipiden 11-14. Echter, kationische lipiden zijn meer immunogeen dan anionogene lipiden 13,14. Daarom hebben onderzoekers begonnen te verschuiven gebruiken kationische lipiden in liposomen anionogene. Gentherapie producten efficiënt kunnen worden verpakt in anionische liposomen met de positief geladen peptide protaminesulfaat, waarin DNA / RNA-moleculen 15-19 condenseert. Sinds anionische Lipids minder immunogeen dan kationische lipiden zij circulatietijden toegenomen, en kunnen meer worden getolereerd in diermodellen 13,14. Liposomen gericht op specifieke weefsels middels gerichte peptiden die zijn bevestigd aan de liposomen. Het RVG-9r neuropeptide, dat bindt aan nicotinische acetylcholinereceptoren, is gebruikt om siRNA gericht en liposomen de CNS 17-20.
Dit rapport schetst een protocol tot drie siRNA levering voertuigen te produceren en te verpakken en leveren de siRNA tot neuronale cellen (figuur 1). Liposoom-siRNA-peptidecomplexen (LSPCs) bestaan uit liposomen met siRNA en het RVG-9R gericht peptide elektrostatisch gehecht aan het buitenoppervlak van het liposoom. Peptide gericht liposoom ingekapseld therapeutisch siRNA (PALETS) bestaan uit siRNA en protamine ingekapseld in het liposoom met RVG-9 R covalent gebonden aan lipide PEG groepen. Met behulp van de onderstaande methoden om LSPCs en PALET genererenS, PrP C siRNA vermindert PrP C expressie tot 90% in neuronale cellen, die enorme belofte te genezen of aanzienlijk vertragen van het begin van prionziekte pathologie bezit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden gefokt en gehouden op Lab Animal Resources, geaccrediteerd door de Vereniging voor evaluatie en accreditatie van het laboratorium Animal Care International, in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de Colorado State University goedgekeurd.
1. Bereiding van LSPCs
- Met een 1: 1 DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan): cholesterol ratio voor LSPCs. Voor een 4 nmol liposoompreparaat, meng 2 nmol DOTAP en 2 nmol cholesterol in 10 ml van een 1: 1 chloroform: methanol oplossing in een kolf.
- Damp 9 ml van de chloroform: methanol oplossing met behulp van N2 gas in een zuurkast. Damp de laatste 1 ml oplosmiddel in een zuurkast 's nachts zonder gas. Zich aan een dunne lipidefilm op de bodem van de kolf.
- Verhit 10 ml van een 10% sucrose oplossing van 55 ° C.
- Giet het verwarmde 10% sucrose oplossing op de dunne lipide film langzaam met 1 ml / min, terwijl gently wervelende de kolf. Handhaaf de 10% sucrose en fles met lipiden bij 55 ° C zodat de lipide moleculen in de gel-vloeistoffase blijven. Rehydratatie resulteert in de vorming van multilamellaire blaasjes (MLV).
- Sta lipiden te hydrateren bij 55 ° C gedurende ten minste één uur voor de dimensionering van de liposomen.
- Monteer een extruder instructies van de fabrikant met 1,0 urn filters of gebruik 1,0 pm spuitfilters voor maatvoering.
- Voeg 1 ml van de verwarmde liposoomsuspensie één van de spuiten op de extruder, en passeert de suspensie tussen de twee spuiten 11 maal. Zorg ervoor dat de schorsing in de tegenovergestelde spuit dan het starten van de spuit na de 11 passeert.
- Grootte de liposomen weer door 0,45 urn dan 0,2 urn filters om grote unilamellaire vesicles (LUV's) te genereren. Houd het liposoom suspensie verwarmd eenvoudiger maatvoering.
- Incubeer 20 ui van het 4 nmol liposoomsuspensie (200 uM) met 200 pi van een 20 pM (4nmol totaal) stock siRNA gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer 80 ul van een 500 uM (40 nmol totaal) stock RVG-9R oplossing met de siRNA / liposoom oplossing 10 minuten bij kamertemperatuur. LSPCs moet zo snel mogelijk worden gebruikt maar kunnen worden gebruikt om verschillende uur na bereiding. LSPCs opslag bij 4 ° C gedurende enkele uren na bereiding.
2. Voorbereiding van PALETS
- Gebruik een 55: 40: 5 molverhouding hetzij DSPE (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfo): cholesterol: DSPE-PEG of DOTAP: cholesterol: DSPE-PEG voor PALETS. Voor een 4 nmol liposoompreparaat, meng 2,2 nmol van hetzij DSPE- of DOTAP, 1,6 nmol cholesterol en 0,2 nmol DSPE-PEG in 10 ml van een 2: 1 chloroform: methanol oplossing in een kolf.
- Bereid liposoomsuspensie precies zoals beschreven in stap 1.1 en 1.2 hierboven. Rehydrateren DSPE liposomen in 10 ml 1x PBS verwarmd tot 75 ° C, toevoegen van 1 ml / min. Sta lipiden te hydrateren bij 75 ° C gedurende tenminimaal 1 uur voordat de grootteklasse.
- Grootte de liposoomsuspensie precies zoals beschreven in stap 1,6-1,8.
- Pipetteer 20 ul van elk van de 4 nmol (200 uM) liposoomsuspensies in afzonderlijke aliquots na DOTAP en DSPE liposomen formaat, en lyofiliseren gedurende 30 min met een benchtop vriesdroger (figuur 2).
- Incubeer 200 pi van een 20 pM (4 nmol totaal) stock siRNA oplossing met 1,4 pi van een oplossing van 26,6 uM protaminesulfaat gedurende 10 min bij kamertemperatuur siRNA dat moet worden ingekapseld in liposomen DSPE PALETS.
- Hydrateren de DOTAP PALETS liposomen met 200 ul van een 4 nmol voorraad oplossing van siRNA of rehydrateren DSPE PALETS liposomen met 201,4 ul van de siRNA / protamine oplossing. Incubeer liposoom / siRNA oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 10 ul van 60 mM 1-ethyl-3- oplossing (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) aan de liposoom / siRNA oplossing voor zowel DOTAP en DSPE PALETS.
- Voeg 10 ul van een 150 mM N-hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS) oplossing van het liposoom / siRNA oplossing voor zowel DOTAP en DSPE PALETS.
- Incubeer de EDC en sulfo-NHS de siRNA / liposoom suspensie gedurende 2 uur bij KT.
- Incubeer 80 ul van een 500 uM (40 nmol totaal) stock RVG-9R oplossing met de siRNA / liposoom verknoping gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
OPMERKING: De EDC / sulfo-NHS maakt het RVG-9 R covalent binden aan de PEG-lipiden. Gebruik PALETS binnen een paar uur na de bereiding. PALETS opslag bij 4 ° C gedurende enkele uren na bereiding. - Om siRNA inkapseling efficiëntie van PALETS te bepalen:
- Meet de concentratie van siRNA vóór en na de toevoeging van protamine en liposomen onder toepassing van een spectrofotometer ingesteld op 260 nm.
- Filter de ingekapselde siRNA van het liposoom / ingekapselde siRNA ophanging met behulp van 50 kDa centrifugale filters. Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 20 min.
- Meet de concentratie vaningekapselde siRNA in het filtraat en de concentratie van ingekapselde siRNA in het retentaat met een spectrofotometer bij 260 nm.
3. Injecteren Muizen met LSPCs of PALETS
- Expose muizen voor 5-10 min tot een warmtelamp om bloedvaten te verwijden.
- Verdoven muis met een 2-3% isofluorane / zuurstof vloeien 5-10 minuten vóór de injectie, en tijdens de injectie. Bevestig verdoving wanneer dier niet meer ambulant en ademhaling hebben vertraagd door het doen van een teen knijpen. Plaats de muis op zijn rug of zij toegang krijgen tot de staartader. Gebruik vet zalf op de ogen muis om uitdroging te voorkomen en tegelijkertijd onder verdoving.
- Veeg / spuit de staart met 70% EtOH en injecteer 300 ul van LSPCs of PALETS op de staartader van de muis met behulp van een 26 G insulinespuit. Begin het injecteren distaal in de staartader en proximaal bewegen als de ader instort of breuken.
- Plaats de muis in een schone kooi totdat hij onderhoudt borstligging. Plaats geen mogebruiken met andere mates kooi totdat deze volledig is hersteld. Muizen moeten herstellen in 5 tot 15 minuten. Ze kunnen op een verwarmingselement of onder een warmtelamp om de lichaamstemperatuur te handhaven indien herstel langer duurt worden geplaatst. Muizen moeten nauwlettend worden gevolgd om te beschermen tegen oververhitting.
- Monitor het dier enkele uren na de injectie te waarborgen verdoving uitgewerkt, en er zijn geen nadelige effecten van de behandeling. Laat de LSPCs of PALETS circuleren gedurende tenminste 24 uur.
4. Analyse van eiwitexpressie via flowcytometrie
- Euthanaseren muizen met een 20% CO2 stroomsnelheid gedurende 15 min.
- Ontleden halve hemisfeer van de hersenen door het wegsnijden van de huid en de schedel van de muis met een schaar. Afpellen halve hemisfeer van de hersenen verwijderd uit de schedel met een tang of het einde van een schaar.
- Druk halve hemisfeer van de hersenen van elke muis door een 40 urn maas zeef gebruik 2,5 ml FACS-buffer (1x, PBS, 1% foetaal runderserum, 10 mM EDTA) in een Petri schaal met de zuiger van een injectiespuit.
- Spoel de cel zeef en de petrischaal met een extra 2,5 ml FACS buffer. Zet de enkele celsuspensie in een 15 ml conische buis op ijs.
- Pipetteer 100 ul van het 5 ml enkelvoudige celsuspensie in een 1,5 ml microcentrifuge buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 350 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer celpellet in 1 ml FACS buffer. Spin bij 350 xg gedurende 5 minuten. Herhalen met een andere 1 ml FACS buffer. Houd de celsuspensie op ijs.
- Incubeer de cellen in 100 pl 1: 100 verdunning van een 0,5 mg / ml rat anti-muis Fc blok in FACS buffer gedurende 30-60 min op ijs. Pellet en was de cellen zoals in stap 4,5. Houd de celsuspensie op ijs.
- Incubeer de cellen in 100 ul van een 20 ug / ml fluorescent antilichaam tegen muizen PrP C in 7% muizenserum in FACS-buffer op ijs gedurende 30-60 min. Pellet en was de cellen zoals in stap 4,5. Houd de celsuspensieop ijs.
- Pellet en resuspendeer de cellen in 1 ml RBC lysis buffer (1x PBS, 155 mM NH4CI, 12 mM NaHCO 3, 0,1 mM EDTA) gedurende 1 min. Pellet in stap 4,5 en resuspendeer de cellen in 1 ml FACS buffer. Houd de celsuspensie op ijs.
- Analyseer PrP expressie C met een flow cytometer zoals hiervoor 10 beschreven. Gate levende cellen van de totale celpopulatie. Gate PrP C + cellen uit levende cellen populatie MFI (mediaan fluorescentie-intensiteit) te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de efficiëntie van inkapseling siRNA binnen anionogene PALETS verhogen, werd de siRNA gemengd met protamine. Om de beste protamine concentratie voor siRNA te bepalen werd de siRNA gemengd met verschillende concentraties protamine, van 1: 1 tot 2: 1 (Figuur 3A). Er was een 60-65% siRNA inkapselingsefficiëntie in anionische liposomen zonder het gebruik van protamine. Monsters met protamine: siRNA molverhoudingen van 1: 1 tot 1,5: 1 (133-266 nM) hadden 80-90% siRNA inkapseling. Molverhoudingen boven 1,5: 1 resulteerde in precipitatie van siRNA / protamine complexen. De geprecipiteerde complexen werden niet ingekapseld in anionische liposomen. Na de toevoeging van protamine aan het siRNA was er een lichte daling van de concentratie van het siRNA, door verdunning; De concentratie bleef stabiel na toevoeging van protamine (figuur 3B). Na affiltreren van de liposomen met 50 kDa filters, 90-95% van de siRNAwas geassocieerd met het liposoom retentaat, terwijl 5-10% van de siRNA 'vrije' in het filtraat was. Nr siRNA werd gedetecteerd in protamine of liposoom uitsluitend monsters (Figuur 3C).
Om het effect van LSPCs in vivo te bepalen werden wildtype muizen behandeld met LSPCs voor 24 uur. PrP C expressieniveaus van wildtype muizen behandeld met LSPCs werden vergeleken met muizen behandeld met 1x PBS en knockout PrP (PrP KO) muizen (figuur 4). Flow cytometrische analyse van PrP c in de hersenen van muizen behandeld met LSPCs een daling in PrP C niveaus (figuur 4A en 4B). In één experiment, alle muizen hadden 80-90% reductie van PrP C niveaus dicht bij PrP C niveaus die in de PrP KO muizen (Figuur 4A) waargenomen. Muizen behandeld met LSPCs in twee onafhankelijke experimenten toonden een vermindering van 40-80% PrP C </ sup> niveaus (Figuur 4B). Van de totale LSPCs behandelde muizen (n = 14), was er slechts één muis had geen antwoord op de LSPCs.
Figuur 1:. Overzicht van het protocol bij PALETS / LSPCs Genereer and Deliver siRNA intraveneus aan de CNS van muizen liposomen werden gegenereerd via de dunne lipide film hydratatie methode. De PrP C siRNA werd vervolgens door een elektrostatische interactie of door inkapseling aan de liposomen. De PALETS of LSPCs werden voltooid door de toevoeging van de CNS gericht peptide RVG-9.R. Na de montage, de PALETS / LSPCs werden geïnjecteerd in de staart aderen van muizen, en 24 uur na de behandeling PrP C-expressie werd bepaald via flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Protocol van de dunne lipide film hydratatie Werkwijze Generate DSPE liposomen voor PALETS Delivery Vehicle De lipiden werden opgelost en gemengd in chloroform. Methanol oplossing, die werd ingedampt tot een droge lipide film genereren. De droge lipide film werd opnieuw gesuspendeerd in 1 x PBS om multilamellaire vesicles (MLV's) te creëren. MLVs werden vervolgens uniforme grootte onder toepassing van een extruder LUV's genereren. De LUV's kan vervolgens worden gebruikt in suspensie of gevriesdroogd in voor eenmalig gebruik aliquots. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het inkapselen Efficiëntie van siRNA in DSPE PALETS u zingen protaminesulfaat. (A) Ongeveer 60-65% van de siRNA ingekapseld zonder de toevoeging van protamine. Met de toevoeging van protamine, was er een 90% inkapselingsefficiëntie tussen 1: 1 en 1,5: 1 protamine: siRNA verhouding. (B) Na het uitfilteren van de liposomen van een vrije siRNA, 90% van de siRNA werd gevonden in de liposomale fractie, dat 5-10% van niet-ingekapselde siRNA werd gevonden in het filtraat. (C) Protamine en liposoom enige oplossingen zijn vrij van ingekapseld siRNA. Ongeveer 60-65% van siRNA werd ingekapseld in liposomen DSPE zonder het gebruik van protamine. Met het gebruik van protamine in een concentratie van 186,2 nM, ongeveer 90% van de siRNA werd ingekapseld in de liposomen DSPE. Foutbalken geven SEM. **** Geeft P <0,0001. * Geeft P <0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Vertegenwoordiger Flow cytometrische analyse van de Brain Cell Schorsingen 24 uur na behandeling met LSPCs LSPCs werden in de staart aderen van wild-type muizen en hersenen geïnjecteerd werden 24 uur later geoogst. PBS werd gebruikt als behandelregelcircuit en een PrP KO muizen werd gebruikt als controle voor PrP C niveaus. (A) Muizen behandeld met LSPCs vertoonden een significante daling van PrP C niveaus in vergelijking met de PBS controle, die wildtype PrP C niveaus toont. De LSPCs behandelde muizen vertoonden PrP C niveau dichtbij dat van een PrP KO muis. (B) Cumulatieve gegevens van drie onafhankelijke experimenten met dezelfde 24 uur behandelingsprotocol bleek de relatieve hoeveelheid PrP C in PBS wildtype en LSPCs behandelde muizen. Over de drie experimenten, muizen behandeld met LSPCs showed significante dalingen in PrP C niveaus in vergelijking met PBS wildtype controles. Foutbalken geven SEM. *** Geeft p <0,0003. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit rapport beschrijft een protocol om twee systemen voor gerichte toediening die efficiënt siRNA transporten naar het centrale zenuwstelsel te creëren. Eerdere werkwijzen leveren siRNA het CNS opgenomen injecteren siRNA / shRNA vectoren direct in de hersenen, intraveneuze injectie van gerichte siRNA of intraveneuze injectie van niet-gerichte siRNA-liposoom complexen. Injectie van siRNA / shRNA vectoren in het CZS veroorzaakt een afname doeleiwit expressieniveaus. Echter, het siRNA / shRNA niet vrij diffunderen door het CZS. Bovendien zijn deze injecties leiden tot schade aan de aangrenzende zenuwweefsel 6-9. De intraveneuze injectie van gerichte siRNA leidt ook tot vermindering van het doeleiwit. De meeste van de siRNA wordt afgebroken door serumeiwitten 20. Tenslotte intraveneuze injectie ongerichte liposoom-siRNA complexen resulteert in het invangen van het siRNA in de lever en afbraak door het mononucleaire fagocytsysteem 21. Het siRNA leveringvoertuigen bovenbeschreven LSPCs en PALETS, zorgen voor een veiliger, effectief en efficiënt afgiftesysteem dan eerdere methoden leveren siRNA rechtstreeks aan het CZS. De LSPCs en de PALETS ook kan transporteren andere orale geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel.
PALETS of LSPCs moet worden gebruikt binnen een paar uur na de montage. Anders bestaat het risico van de siRNA worden niet-functionele / afgebroken. De andere kritische stap die niet kan worden gestopt / onderbroken is de voorbereiding en uitvoering van de celsuspensie voor flowcytometrie. Het is belangrijk om flowcytometrie uitgevoerd op dezelfde dag dat de celsuspensie wordt bereid, omdat de suspensie levende cellen die moeten leven voor analyse te bevat.
Er zijn een aantal stappen in het protocol dat kan worden aangepast naargelang de LSPCs of PALETS worden gebruikt in vitro of in vivo, wat kleinmoleculige geneesmiddel in de LSPCs of PALETS geladen en op arbeidAtory voorkeur. Ten eerste kan de lipide molaire verhoudingen van de LSPCs en PALETS worden geoptimaliseerd voor andere toepassingen. Echter, fosfatidylethanolamine (PE in DSPE) hydrateert slecht bij gebruik in een 60% gewicht / gewicht of hoger. Bij gebruik bij deze hogere concentraties zal DSPE moleculen aggregeren met elkaar en vormen een onoplosbare massa lipiden. Deze massa van lipiden niet kan kapselen siRNA. Als N 2 gas niet beschikbaar is, kan de lipide mix worden gedroogd met behulp van verdamping. Verdamping duurt ongeveer 3 dagen, en moet worden uitgevoerd in een zuurkast door het gebruik van methanol en chloroform. In dit protocol werd de dunne lipide film opnieuw gesuspendeerd met 1 x PBS, maar het kan ook worden geresuspendeerd met andere buffers hydratatie. Andere buffers omvatten water, 10% sucrose of andere waterige buffer. De keuze van rehydratatie buffer afhankelijk van het beoogde gebruik van de liposomen en het middel dat wordt ingekapseld in het liposoom 22,23. De hydratatie buffer behandeling moet de gel-liq bewaarduid crystal overgangstemperatuur (Tc of Tm) van de lipiden of liposomen niet goed hydrateren. In de beschreven protocol werden de liposomen gesuspendeerd uniforme grootte met een extruder. Echter, de liposomen ook worden gerangschikt met behulp spuitfilters of sonicatie. Hetzelfde filter poriegrootte voor de extruder kan worden gebruikt als spuitfilters. Ook kan de liposoomsuspensie worden aangepast na hydratatie de siRNA oplossing. Echter, zagen we een verlies van siRNA van liposomen als gesorteerde de extruder na de hydratie stap (ongepubliceerde gegevens).
Aangezien de biologische rol van PrP C nog niet begrepen 5, is het mogelijk dat kunnen er enkele schadelijke effecten veroorzaakt door verlaging PrP C niveaus. Omdat prioneiwit deficiënte muizen ontwikkelen, gedragen en op normale 24, is het waarschijnlijk dat deze schadelijke effecten als klein of niet zichtbaar duidelijk zal zijn. Bovendien siRNA knockdown van PrP <sup> C expressie zou niet volledig af te schaffen eiwit expressie en is volledig omkeerbaar zonder de mogelijkheid van virale oncogenese, in tegenstelling tot lentivector RNAi 23.
Beperkingen met de levering systemen omvatten verminderde opname van anionische PALETS in biologische membranen en de immunogeniciteit van LSPCs als gevolg van de kationische lipiden. Als immunogeniciteit van de LSPCs wordt waargenomen, kan PALETS worden gebruikt als alternatief. Verminderde opname van anionisch PALETS in anionische biologische membranen kan worden overwonnen door kationische PALETS of past de formulering anionische PALETS met een mengsel van kationische en anionische lipiden.
In dit rapport, de vermindering van PrPC varieert sterk van muis tot muis. Dit verschil kan worden veroorzaakt door een aantal factoren: variatie tussen muizen, de kleine diameter van de aderen in muizen of slechte siRNA. Het gebruik van inteelt muizen moet veel van de variabiliteit tussen muizen elimineren, maar variatie is altijd nogmet inteeltmuizen. Ook muizen zeer kleine aders vergeleken met andere diermodellen. Dus, het injecteren van een groot volume in de aderen van muizen kan problematisch zijn. We raden u aan het oefenen injecties voordat je probeert om PALETS of LSPCs injecteren. Maar zelfs met de praktijk soms duurt nog een paar injecties om de hoeveelheid PALETS / LSPCs krijgen in de muis, en de ader kan instorten een van deze injecties. Zo zou men de muis al het volume van PALETS / LSPCs ontvangen, terwijl een andere muis slechts 75-90% van het volume PALETS / LSPCs mochten ontvangen.
Andere mogelijke bronnen van variatie onder meer omlooptijd en afbraak van het siRNA door serumeiwitten. De PALETS / LSPCS misschien langer voordat het bereiken van de hersenen in één muis vergeleken met een ander, die het verschil kunnen verklaren circuleren. We mogen alleen LSPCs circuleren 24 uur voor euthanasie muizen in het bovengenoemde experiment. Als de circulatie tijd wordt veroorzaakt door de variatie, dan is het verhogen van de circulatie tijd na 24 uur moet wat variatie te verminderen. Hoewel we de siRNA verpakken met PALETS / LSPCs, is er altijd een kans op afbraak van het siRNA en / of bestelwagens. Zoals eerder vermeld, de kationische lipiden enigszins immunogeen. Dus, als immuuncellen in het bloed zijn aanval op de auto, dan zou het langer duren voordat de voertuigen aan de hersenen te leveren of de voertuigen zou afgebroken worden. Overschakelen van kationische lipiden tot PALETS anionogene zou kunnen helpen verminderen de trage circulatietijd of degradatie bij het gebruik van kationische lipiden.
Het RVG-9.R peptide transporteert de LSPCs en pallets op een willekeurige cel in het CZS dat nicotine acetylcholine receptoren bevat. Dit omvat zowel neuronale cellen microgliacellen en astrocyten 26. Voor PALETS of LSPCs een effectieve behandeling voor prion ziekten is het belangrijk om alle cellen die bijdragen aan prion pathogenese targeten. Neuronale cellen bevatten de PrP C 27,28. Targeting neuronale cellen en het verminderen PrP C expressie de cellen kan leiden tot een vermindering van prion pathogenese. Echter, neuronale cellen niet het enige celtype die bijdraagt aan prionziekte. Astrocyten zijn betrokken bij de replicatie van prionen 29,30. Daarom is het niet alleen belangrijk om neuronale doelcellen, maar ook gericht astrocyten prion pathogenese verminderen.
De afgiftesystemen beschreven zijn ontvankelijk voor verschillende optimalisatiestrategieën dat ze geschikt zijn voor een groot aantal ziekten toepassingen daarvan. LSPCs en PALETS kunnen transporteren elke kleinmoleculige geneesmiddelkandidaten het CNS, niet alleen siRNA, dat het voertuig de mogelijkheid om niet alleen neurodegeneratieve ziekten geeft. PALETS en LSPCs zou kunnen worden gebruikt voor de behandeling van een ziekte die van invloedde hersenen afhankelijk van kleinmoleculige geneesmiddelkandidaten geladen in de voertuigen. Ook verandert de-gericht peptide kan leiden tot de overbrengingsmiddelen om orale geneesmiddelen te leveren aan een specifieke subset van cellen in het CZS, in plaats van elke cel die acetylcholinereceptoren heeft. PALETS en LSPCs vertegenwoordigen een nieuwe, meer efficiënte en flexibele systeem voor kleine molecule geneesmiddelen voor de behandeling van ziekten die het centrale zenuwstelsel beïnvloeden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOTAP lipid | Avanti Lipids | 890890 | |
| Cholesterol | Avanti Lipids | 700000 | |
| DSPE | Avanti Lipids | 850715 | |
| DSPE-PEG | Avanti Lipids | 880125 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | AC268320010 | |
| Methanol | EMD Millipore | 113351 | |
| N2 Gas | AirGas | ||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Extruder | Avanti Lipids | 610023 | |
| 1.0, 0.4, and 0.2 μm filters | Avanti Lipids | 610010, 610007, 610006 | |
| PBS | Life Technologies | 70011-044 | |
| Protamine sulfate | Fisher Scientific | ICN10275205 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | Aliquoted for single use |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | Aliquoted for single use |
| 40 μm Cell Strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| Rat anti-mouse CD16/CD32 Fc block | BD Pharmigen | 553141 | |
| Anti-PrP antibody (PRC5) | Proprietary - PRC |
References
- Bolton, D. C., Mckinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
- McKinley, M. P., Bolton, D. C., Pruisner, S. B. A protease-resistant protein is a structural component of the scrapie prion. Cell. 35 (1), 57-62 (1983).
- Pruisner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jeffrey, M., McGovern, G., Sisò, S., González, L. Cellular and sub-cellular pathology of prion diseases: relationship between morphological changes, accumulation of abnormal prion protein and clinical disease. Acta Neuropathologica. 121 (1), 113-134 (2011).
- Büeler, H., et al. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73 (7), 1339-1347 (1993).
- Pfeifer, A., et al. Lentivector-mediated RNAi efficiently suppresses prion protein and prolongs survival of scrapie-infected mice. J Clin Invest. 116 (12), 3204-3210 (2006).
- White, M., Farmer, M., Mirabile, I., Brandner, S., Collinge, J., Mallucci, G. Single treatment with RNAi against prion protein rescues early neuronal dysfunction and prolongs survival in mice. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10238-10243 (2008).
- Gallozzi, M., et al. Prnp knockdown in transgenic mice using RNA interference. Transgenic Research. 17 (5), 783-791 (2008).
- Mallucci, G., et al. Targeting cellular prion protein reverses early cognitive deficits and neurophysiological dysfunction in prion-infected mice. Neuron. 53 (3), 325-335 (2007).
- Pulford, B., et al. Liposome-siRNA-peptide complexes cross the blood-brain barrier and significantly decrease PrPC on neuronal cells PrPRes in infected cultures. PLoS One. 5 (6), (2010).
- Malone, R. W., Felgner, P. L., Verma, I. M.
- Liu, Y., et al. Factors influencing the efficiency of cationic liposome-mediated intravenous gene delivery. Nat Biotechnol. 15, 167-173 (1997).
- Freimark, B. D., et al. Cationic lipids enhance cytokine and cell influx levels in the lung following administration of plasmid: cationic lipid complexes. J Immunol. 160 (9), 4580-4586 (1998).
- Balzas, D. A., Godbey, W. T. Liposomes for use in gene delivery. J Drug Deliv. , (2011).
- Srinivasan, C., Burgess, D. J. Optimization and characterization of anionic lipoplexes for gene delivery. J Control Release. 136 (1), 62-70 (2009).
- Lakkaruju, A., Dubinsky, J. M., Low, W. C., Rahman, Y. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J Biol Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Tao, Y., Han, J., Dou, H. Brain-targeting gene delivery using a rabies virus glycoprotein peptide modulated hollow liposomes: bio-behavioral study. J Mater Chem. 22, 11808-11815 (2012).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Li, S., Rizzo, M. A., Bhattacharya, S., Huang, L. Characterization of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes for intravenous gene delivery. Gene Ther. 5 (7), 930-937 (1998).
- Kumar, P., et al. Transvascular delivery of small interfering RNA to the central nervous system. Nature. 448, 39-43 (2007).
- Voinea, M., Simionescu, M. Designing of 'intelligent' liposomes for efficient delivery of drugs. J Cell Mol Med. 6 (4), 465-474 (2002).
- Lakkaraju, A., et al. Neurons are protected from excitotoxic death by p53 antisense oligonucleotides delivered in anionic liposomes. J. Biol. Chem. 276 (34), 32000-32007 (2001).
- Li, S., Huang, L. In vivo gene transfer via intravenous administration of cationic lipid-protamine-DNA (LPD) complexes. Gene Ther. 4 (9), 891-900 (1997).
- Büeler, H., et al. Normal development and behaviour of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein. Nature. 356 (6370), 577-582 (1992).
- Dykxhoorn, D., Novina, C., Sharp, P. Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (6), 457-467 (2003).
- Graham, A., Ray, M., Perry, E., Jaros, E. Differential nicotinic acetylcholine receptor subunit expression in the human hippocampus. J Chem Neuroanat. 25 (2), 97-113 (2003).
- Kretzschmar, H. A., Prusiner, S. B., Stowring, L. E. Scrapie prion proteins are synthesized in neurons. Am J Pathol. 122 (1), 1-5 (1986).
- Moser, M., Colello, R., Pott, U., Oesch, B. Developmental expression of the prion protein gene in glial cells. Neuron. 14 (3), 509-517 (1995).
- Cronier, S., Laude, H., Peyrin, J. M. Prions can infect primary cultured neurons and astrocytes and promote neuronal cell death. Proc Natl Acad Sci. 101 (33), 12271-12276 (2004).
- Diedrich, J., Bendheim, P., Kim, Y. Scrapie-associated prion protein accumulates in astrocytes during scrapie infection. Proc Natl Acad Sci. 88 (2), 375-379 (1991).
