Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys

doi: 10.3791/54112 Published: May 17, 2016

Summary

Detta protokoll beskriver en helt integrerat arbetsflöde för att karakterisera histon posttranslationella modifieringar som använder masspektrometri (MS). Arbetsflödet innehåller histon rening från cellodlingar eller vävnader, histon derivatisering och matsmältning, MS-analys med hjälp av nano-flödet vätskekromatografi och instruktioner för dataanalys. Protokollet är utformat för slutförande inom 2 - 3 dagar.

Abstract

Nukleosomer är den minsta strukturella enhet av kromatin, som består av 147 baspar av DNA lindade kring en oktamer av histonproteiner. Histon-funktion medieras av omfattande post-translationell modifiering av en myriad av nukleära proteiner. Dessa ändringar är kritiska för kärn integritet som de reglerar kromatinstrukturen och rekrytera enzymer som är involverade i genreglering, DNA-reparation och kromosom kondens. Även om en stor del av det vetenskapliga samfundet antar antikroppsbaserade tekniker för att karakterisera histon PTM överflöd, dessa metoder är låg genomströmning och förspänd mot hypermodified proteiner, som epitopen kan hindras av närliggande modifikationer. Detta protokoll beskriver användningen av nano-vätskekromatografi (NLC) och masspektrometri (MS) för noggrann kvantifiering av histon modifieringar. Denna metod är utformad för att karakterisera en stor variation av histon PTMs och den relativa förekomsten av flera histon varianter inom single analyser. I detta protokoll är histoner derivatiserade med propionsyraanhydrid, följt av spjälkning med trypsin för att generera peptider av 5-20 aa i längd. Efter digerering, är den nyligen exponerade N-ändar av de histon peptiderna derivatiseras för att förbättra kromatografisk retentionstid under NLC-MS. Denna metod gör det möjligt för den relativa kvantifiering av histon PTMs spänner fyra tiopotenser.

Introduction

Epigenetik definieras som studiet av ärftliga förändringar i genuttryck som uppstår på annat sätt än att förändra den underliggande DNA-sekvensen en mekanismer. Epigenetisk reglering är kritisk under utveckling som organismen undergår dramatiska fenotypiska förändringar även om dess DNA-innehåll inte ändras. Det finns flera kritiska komponenter som krävs för korrekt epigenetisk underhåll inklusive histon post-translationella modifieringar (PTMs), histon varianter, icke-kodande RNA-sekvenser, DNA-metylering och DNA-bindande faktorer, som var och en påverkar genuttryck genom olika mekanismer 2. Till exempel, medan DNA-metylering är en mycket stabil modifiering som undertrycker gentranslation 3, histon varianter och histon PTMs är mycket mer dynamiskt och kan påverka kromatin i en mängd olika sätt 4.

Histon PTMs är mestadels lokaliserad på de N-terminala svansar, eftersom de är de mest utsatta och flexibla områdetav proteinet. Emellertid är nukleosomen kärnan också kraftigt modifierad jämfört med genomsnittliga proteiner 5. Även om histon märken har i stor utsträckning präglas under det senaste decenniet, många länkar mellan kända histon märken och deras funktion är fortfarande oklart. Detta är till stor del beror på det faktum att de flesta histon PTMs inte arbeta ensam, utan snarare fungerar tillsammans med andra PTMs ( "cross-talk") för att ändra en specifik process som transkription 6,7. Till exempel, den kombinatoriska märket H3S10K14ac på genen p21 aktiverar dess transkription, vilket inte skulle förekomma med endast ett av de två PTMs 8. Protein HP1 komprimerar kromatin genom att erkänna H3K9me2 / ME3 och sprida ändringen till närliggande nukleosomer. Men HP1 kan inte binda H3K9me2 / 3 när intilliggande S10 fosforyleras 9. Acetylering av H3K4 inhiberar bindning av proteinet spChp1 till H3K9me2 / ME3 i Schizosaccharomyces pombe 10. Dessutom histon lysin demethylase PHF8 har den högsta nukleosomen bindningseffektiviteten när tre PTMs H3K4me3, K9ac och K14ac är närvarande 11. Dessa exempel betona vikten av att uppnå en helhetsbild av histon PTM förändringar snarare än att fokusera på enskilda ändringar.

Närvaron av sekvensvarianter också ökar komplexiteten i histon analys, som histon isotyper har i allmänhet mycket liknande sekvenser, men ofta har olika roller i kromatin. Till exempel har H2A.x en C-terminal sekvens som är lättare fosforyleras på DNA-skada jämfört med kanoniska H2A 12, och det krävs för inaktivering av könskromosomer i hanmöss meios 13; På samma sätt ersätter CENP-A kanoniska histon H3 i centromerer 14. Trots deras olika funktioner, dessa varianter delar en stor del av deras aminosyrasekvens med respektive kanoniska histon, vilket gör det svårt att identifiera och kvantifiera dem separat. Antikroppsbaserade tekniker såsom western blotting har i stor utsträckning antagit att karakterisera histoner. Men antikroppsbaserade metoder är begränsade av följande skäl: (i) de kan endast bekräfta förekomsten av en modifiering och kan inte identifiera okända PTMs; (Ii) de är förspända på grund av närvaron av samexisterande märken, som kan påverka bindningsaffiniteten; (iii) att de inte kan identifiera kombi märken, som endast mycket få antikroppar är tillgängliga för detta ändamål och (iv) de korsreagera mellan mycket likartade histon varianter eller liknande PTMs (t.ex. di- och trimethylation av lysinrester). Egelhofer et al. beskrivs som mer än 25% av kommersiella antikroppar misslyckas specificitetstester av dot blot eller Western blöt, och bland specifika antikroppar mer än 20% misslyckas i kromatin immunoprecipitation experiment 15. Masspektrometri (MS) är för närvarande den mest lämpliga analytiska verktyg för att studera nya och / eller kombi PTMs,och det har i stor utsträckning genomförts för histonproteiner (översikt i 16). Detta beror främst på grund av hög känslighet och massa noggrannhet MS, och möjligheten att utföra storskaliga analyser.

Bottom-up-strategi är den mest använda MS-baserade proteomik strategi för histon karakterisering och deras PTMs, varvid den intakta proteinet enzymatiskt rötas till korta peptider (5-20 aa). Denna nedbrytning underlättar både LC separation och MS-detektion. Massorna i intervallet 600 - 2000 Da är vanligen lättare att joniseras och identifieras med högre massa noggrannhet och upplösning än större massor. MS / MS-fragmentering förbättras också, eftersom korta peptider är i allmänhet väl lämpade för kollision inducerad dissociation (CID). Men histoner en utmaning för bottom-up MS som de höganrikat i basiska aminosyrarester, nämligen lysin och arginin. Därför leder trypsin digestion med generering av peptider som är för smallt för LC retention och entydig lokalisering av PTMs. För att kringgå detta problem, inkluderar våra protokoll lysin och peptid N-terminal kemisk derivatisering 17. Användning av propionsyraanhydrid rekommenderas för effektiv kemisk derivatisering i jämförelse med andra reagens 18. Sådana derivatiseringsreaktioner blockerar ɛ-aminogrupperna i omodifierade och monometyl- lysinrester, vilket gör trypsin för att utföra proteolys endast vid C-terminalen av argininrester. Derivatiserade aminer kan inte byta protoner med lösningen och sålunda peptiderna är i allmänhet endast dubbelt eller tredubbelt laddade, vilket underlättar MS och MS / MS-detektion. Dessutom ökar N-terminal derivatisering peptid hydrofobicitet och därmed omvänd fas kromatografisk retention. Här beskriver vi arbetsflödet för att rena histoner och förbereda dem för PTM analys via bottom-up proteomik (Figur 1). Denna strategi ger kvantifiering av enskilda histon märken och kombinatoriska märken feller histon PTMs som är relativt nära i aminosyrasekvensen.

Protocol

1. Insamling av celler från kultur

  1. Om celler odlades i suspension, samla upp celler genom centrifugering vid 300 RCF i 5 min. Om vidhäftande, aspirera och kasta cellmedium. Skölj bifogade cellerna med PBS utan Ca 2 + och Mg 2 + (kallad PBS gå framåt). Inkubera cellerna i antingen trypsin eller trypsin-EDTA (0,025% - 0,5% beroende på cellinjen) med tillräcklig volym för att täcka ytan av plattorna vid 37 ° C tills cellerna lossnar (tid varierar för olika cellinjer).
  2. Samla cellerna genom centrifugering vid 300 RCF i 5 min. Tvätta cellerna två gånger i PBS och samla genom centrifugering.
  3. Uppskatta den packade cellvolymen ungefär från grade markerade på 1,8 ml rör eller 15 ml koniska rör.
    Obs: Celler från kultur kan snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C under obegränsad tid i detta skede.

2. Isolering av kärnor från intakta celler

  • Tö celler på is.
  • Tina kärnisoleringsbuffert (NIB, tabell 1).
  • Förbered cirka 5 ml NIB buffert (tabell 1) för varje 100 l hematokrit. För varje 1 ml NIB-buffert, tillsätt proteashämmare och stabiliseringsmedel enligt följande: 1 | il av 1 M DTT, 2,5 | il av 200 mM AEBSF, 2 | il av 2,5 | iM microcystin och 2 ^ il av 5 M natriumbutyrat. NIB med inhibitorer kommer att kallas NIB från denna punkt framåt.
    Obs: Om studeras histon fosforylering inkluderar EDTA fri proteas och fosfatasinhibitor cocktail.
  • Ta bort en femte volym av NIB-buffert så framställda och tillsätt NP-40 Alternativ (tabell 1) till en slutlig koncentration av 0,2%. De återstående fyra femtedels volym kommer att användas för tvättningar.
  • Tvätt cellpelleten i 01:10 cellpelleten till NIB utan NP-40 Alternativ förhållandet (volym / volym). Avlägsna supernatanten genom centrifugering vid 700 RCF i 5 min.
  • Lysera cell pellets genom att placera den på is och tillsätta 01:10 cellpelleten till NIB med 0,2% NP-40 Alternative (v / v).
  • Om extrahera från vävnadsprover, homogenisera med hjälp av mortel och mortelstöt eller Dounce homogeniserare. Odlade celler kan homogeniseras genom försiktig pipettering.
  • Inkubera homogeniserade celler på is i 5 - 10 min. Cellerna lysera och släppa kärnorna.
  • Centrifugera vid 1000 RCF i 5-10 min vid 4 ° C. Pelleten innehåller mestadels cellkärnor, medan supernatanten innehåller mest cytoplasmatiska komponenter. Spara cytoplasmafraktionen om så önskas.
  • Tvätta kärnor pelleten genom att försiktigt återsuspendera den i 01:10 (volym / volym) NIB utan NP-40 Alternative.
    Obs! Den här tvättsteg är endast att avlägsna spår av rengöringsmedel före att utvinna histoner från kärnor.
  • Centrifugera vid 1000 RCF i 5 minuter vid 4 ° C och avlägsna supernatanten.
  • Upprepa steg 2,10 - 2.11 åtminstone två gånger för att helt ta bort NP-40 Alternativ. Borttagning av NP-40 Alternativ är uppenbart enär försiktig pipettering under tvättsteget inte längre bildar bubblor.
  • För histon extraktion från vävnader:
    1. Skölj färska eller tinade frysta vävnaden i iskall NIB.
    2. Överför vävnaden till en petriskål placerades på is med NIB, precis tillräckligt för att hålla vävnaden fuktig.
    3. Dice i minsta bitar (<1 mm) med rakblad för att öka ytkontakten för kärnor isolering.
    4. Överföra malda vävnaden till en i förväg kyld homogenisator och tvätta i NIB genom att pipettera upp och ned.
    5. Ta bort buffert genom centrifugering vid 300 RCF i 5 min.
    6. Lägga NIB innehållande NP-40 Alternativ till cellerna i a-celler: buffert-förhållande av 01:10 (volym / volym) och homogenisera med 5 - 10 slag.
    7. Kontrollera om cellys och upprepa homogenisering som behövs. En god indikator på att celler har lyserats är reduktionen av pelleten volymen. Pelleten ska endast innehålla kärnor.
    8. Centrifugera vid 700 RCF i 5 minuter och spara pelleten. Denna pellet kan extraheras 1 - 2 mer tidsi 01:10 (v / v) av NIB innehållande NP-40 Alternativ; i detta skede, är histonerna heras ur kromatin och pelleten har krympt avsevärt.
    9. Tvätta två gånger med 2 - 3 ml av NIB utan NP40 Alternative att avlägsna spår av tvättmedlet.
      Obs: interimsstoppställe: Prov kan suspenderas i minsta möjliga volym av NIB + 5% glycerol, och förvarades vid -80 ° C.
  • 3. Extraktion och rening av Histoner från Nuclei

    Notera: Histoner är mycket rika på basiska aminosyrarester, så att de tätt samverka med fosforsyra ryggraden i DNA. Histoner är bland de mest basiska proteiner i kärnan, vilket tillåter dem som skall extraheras i iskall svavelsyra (0,2 MH 2 SO 4) med minimal förorening från icke-histonproteiner, som faller ut i stark syra. Högkoncentrerad TCA (till en slutlig koncentration av 33%) kan sedan användas för att fälla ut histoner från svavelssyra. TCA lagras som 100% i brun flaska vid 4 ° C.

    1. Resuspendera cellkärnorna i 1: 5 (volym / volym) kyld 0,2 MH 2 SO 4 (tabell 1) genom försiktig pipettering.
    2. Inkubera provet med konstant rotation eller varsam skakning under 2-4 timmar vid 4 ° C. Typiskt för prover med mer än 500 l cellpelleten, är en 2 tim extraktion tillräcklig för att extrahera histoner; längre inkubationstid kan resultera i utvinning av andra grundläggande proteiner. För mindre kärn pellets (<200 ^), ger 4 timmar extraktion en bättre avkastning.
    3. Centrifugera vid 3400 RCF vid 4 ° C under 5 min.
    4. Överför supernatanten till ett nytt rör.
    5. Upprepa steg 3,3-3,4 för avlägsnande av eventuellt olösligt material.
    6. Att fälla ut histonerna, tillsätt kyld 100% TCA (tabell 1) till den insamlade supernatanten (som nu innehåller histoner) i förhållandet 1: 3 (volym / volym), för att erhålla en slutlig TCA koncentration av 33%. Blanda genom att vända röret några tIME.
      Notera: De prover blir grumlig vid tillsats av TCA, vilket indikerar närvaron av histoner.
    7. Inkubera blandningen på is under åtminstone en timme. För mindre utgångspelletstorlekar, är natten nederbörd rekommenderas.
    8. Centrifugera vid 3400 RCF i 5 minuter. Den histoner belägga sidorna av rören och också sätta in vid botten. En vit olöslig pellet bildar också vid själva botten av röret, som till största delen innehåller icke-histon-proteiner och andra biomolekyler. Avlägsna supernatanten genom aspiration, noga utan att skrapa sidorna eller pelleten.
    9. Genom användning av en glas pasteurpipett, skölj röret med iskall aceton + 0,1% HCl (Tabell 1) så att den täcker de utfällda proteinerna beläggning sidorna och botten.
    10. Centrifugera vid 3400 RCF i 2 minuter och aspirera supernatanten försiktigt utan att skrapa sidorna eller pelleten.
    11. Upprepa steg från 3,9 till 3,10 med användning av 100% iskall aceton.
    12. Torr pellet med luftflöde eller med en Vacuum centrifugera, eller bara genom att lämna röret öppet. Aceton avdunstar snabbt.
    13. Lös histonerna med DDH 2 O (dubbeldestillerat vatten) i minsta volym möjligt att lösa det vita lagret helt. Histoner är lättlösliga i vatten. För pellets i en 1,5 ml mikrocentrifugrör, är 100 l DDH 2 O brukar räcka för att samla histoner.
    14. Centrifugera vid 3400 RCF i 2 minuter och överför supernatanten till ett nytt rör.

    4. Uppskattning av proteinkoncentration och renhet

    1. För mätning proteinkoncentration använda BCA, Bradford-proteinanalys eller aminosyraanalys (AAA). Använd inte tekniker som antar absorbans vid 280 nm, enligt histoner är fattiga i aromatiska aminosyrarester.
    2. Kontrollera renheten av extraherade histoner genom SDS-PAGE-analys med en akrylamidgel 15% och Coomassie-färgning (valfritt).
    3. Om hög renhet enda histon varianter önskas, fortsätta att HPLC-UV fraktionering avhiston varianter (avsnitt 5). Om inte, gå direkt till provberedning för bottom-up histon PTM analys (avsnitt 6).

    5. Separation av Histone Varianter genom omvänd fas HPLC (Valfritt)

    Notera: Hög renhets histon varianter kan erhållas genom fraktionering av den råa histon blandningen med användning av omvändfas-HPLC kopplad till en UV-detektor. Dessa renade histoner är användbara för studier som kräver högre känslighet och renhet. Men för standard histon PTM karakterisering, detta steg kan hoppas över eftersom analysen är tillräckligt känslig och uttömmande. Fraktionering av intakt histon varianter idealt kräver minst 100-300 mikrogram av utgångsmaterial.

    1. Anslut en lämplig C 18 5 ^ m kolonn till en HPLC beroende på utgångs histon koncentration: med ca 100 ^ g av histoner, använd 2,1 mm x 250 mm kolonn med en flödeshastighet på 0,2 ml / min; med omkring 300 | j, g histoner, använd 4,6 x 250 mm kolonn meden flödeshastighet av 0,8 ml / min. Förbered buffert A och B med hjälp av speciell glas enligt följande:
      1. Förbereda Buffert A: 5% HPLC-kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vatten.
      2. Förbereda Buffert B: 95% HPLC-kvalitet acetonitril, 0,1% TFA i HPLC-kvalitet vatten.
    2. Anslut kolonnen till en UV-detektor, och ställa absorbansen till 210-220 nm.
    3. Surgör histon provet löstes i vatten med 100% TFA för att uppnå en slutlig koncentration av 0,1-1% TFA.
    4. Jämvikta kolonnen med 100% buffert A under minst 15 min vid den rekommenderade flödeshastighet, som ungefär motsvarar tre kolonnvolymer. Använder denna signal för att ställa in noll absorbans nivå av UV-detektorn.
    5. Förbered lämplig storlek rör för att samla fraktioner antingen manuellt eller i en automatisk provsamlare.
    6. Injicera provet vid en koncentration av approximativt 1 | j, g / | al eller högre. Prover lösta i större volymer kan förändra utjämning av kolonnen during lastning och leda till lägre retention.
    7. Köra gradienten, programmerad enligt följande: från 0 till 30% B i 1 min, 30 till 60% B i 90 min, och 60 till 90% B på 1 min.
    8. Samla fraktioner (t.ex. kromatogram visas i figur 2) i 1 min intervaller med hjälp av en automatisk fraktionsuppsamlare. Samla fraktioner i lämplig storlek rör för att innehålla hela volymen.
    9. Torka ned fraktione prover i ett vakuum anrikningsverk.
      Obs: interimsstoppställe: Torkade histon fraktioner kan förvaras i rumstemperatur under korta perioder (1 - 2 dagar) eller i -80 ° C frys för långsiktiga perioder.

    6. Kemisk Derivatisering av Histoner Använda propionsyraanhydrid för Bottom-up Analys

    1. Lös histon prover i 40 pl 50 mM NH 4 HCO 3, pH 8,0 (rekommenderade mängden: 50 - 100 pg). Om prover var i ren DDH 2 O, tillsätt koncentrerad NH 4 HCO 3 för att kompensera 50 mM, pH 8.0.
    2. Blöt en P10 pipettspetsen i provet för att kontrollera pH med hjälp av pH-indikatorremsor utan provförluster. NH4OH och myrsyra kan användas för att justera pH till 8,0.
      Obs: Följande del av protokollet (steg från 6,3 till 6,7) bör göras i omgångar på högst tre till fyra prover, för att hålla propionsyraanhydrid reaktiv.
    3. Använd dragskåp för efterföljande steg där propionsyraanhydrid används. Framställ färsk propionylation reagens genom att blanda propionsyraanhydrid med acetonitril i förhållandet 1: 3 (volym / volym). Lägg propionylation reagens till provet i 1: 4 (v / v). För 40 pl histoner, tillsätt 10 l propionylation reagens.
      Obs: Det är möjligt att observera vitt skräp i detta steg. Men i detta mestadels salter och propionsyra, och därmed ingen särskild åtgärd behöver vidtas.
    4. Snabbt lägga NH4OH för att återupprätta pH 8,0 till lösningen. Obs: Propionsyraanhydrid reagerar med de fria aminerna av peptiderna ger propjonisk syra som minskar pH. Vanligtvis, tillsätta NH4OH till provet med ett förhållande av 1: 5 (v / v) är det lämpligt att återupprätta pH 8,0; t.ex., 8 | il NH4OH till 40 pl prov.
    5. Blanda omedelbart genom att vortexa.
    6. Kontrollera pH med samma förfarande som i steg 6,2.
      Varning: När pH är högre än 10,0, är ​​möjlig märkning av andra aminosyrarester med högre pKa.
    7. Inkubera proverna vid rumstemperatur i 15 minuter.
    8. Upprepa steg från 6,3 till 6,7, strikt genomföra reaktionen för högst 3 eller 4 prover per parti propionylation reagens.
    9. Torra prover ner till 10 - 20 ^ i en vakuumanrikningsverk. Detta avdunstar oreagerad propionsyraanhydrid, acetonitril, ättiksyra och ammoniakgas frigörs från NH4OH. Om proverna torka ut helt, inga signifikanta provförluster.
      Notera: Isopropanol kan användas i stället för acetonitril. Emellertid har acetonitril lägre ytspänning och därmed mersnabb avdunstning.
    10. Resuspendera eller utspädda prover med DDH 2 O tills 40 pl slutlig volym uppnås.
    11. Upprepa steg från 6,2 till 6,9. En dubbel omgången av histon propionylation säkerställer> 95% av reaktionens fullbordan.
    12. Fyll propionsyraanhydrid flaska med argongas för att förhindra bildningen av ättiksyra i kontakt med fukt i flaskan.
      Obs: interimsstoppställe: Prov kan förvaras vid -80 ° C rekonstituerades i DDH 2 O eller torkade.

    7. Proteolytisk Klyvning med trypsin

    1. Resuspendera histoner i 50 mM NH4 HCO3 att uppnå en optimal koncentration av 1 mikrogram / ​​l eller högre. Mer utspädda prover leder till lägre trypsin effektivitet.
      Obs: Histonerna på detta steg måste vara vid pH 8,0 Om det fortfarande sur, tillsätt sedan NH 4 HCO 3 salt till provet med hjälp av pipettspetsen.
    2. Lägg trypsin till histon prover vid ett 1:10 förhållande (vikt / vikt).
    3. Incubate vid 37 ° C under 6-8 h.
    4. Stoppa digerering genom frysning i -80 ° C.
    5. Torka ner provet till 10 - 20 ^ i en vakuumanrikningsverk.
      Obs: interimsstoppställe: Prov kan förvaras vid -80 ° C.

    8. Propionylation histon peptider vid N-terminalen

    Obs: Detta avsnitt beskriver derivatisering av peptiden N-terminaler som genereras från trypsin Digest. Sådant förfarande förbättrar HPLC-retentionstid av de kortaste peptider (t.ex., aminosyra 3-8 av histon H3), som den propionylgrupp ökar peptid hydrofobicitet.

    1. Resuspendera prover i 30 pl 100 mM NH 4 HCO 3.
    2. Upprepa steg från 6,1 till 6,9.
      Obs: Det är normalt att torkning av prover i vakuum tar längre tid på det här steget.
    3. Resuspendera eller utspädda prover med 50-100 pl DDH 2 O + antingen 0,1% TFA eller 0,5% ättiksyra. Obs: Ättiksyra rekommenderas för långa lager, som TFA facilitates metionin oxidation på lång sikt. Å andra sidan, är TFA rekommenderas om scen tippning (avsnitt 9) utförs samma dag, som TFA hjälper en bättre kromatografisk retention.
      Obs: interimsstoppställe: Prov kan förvaras vid -80 ° C.

    9. Prov Avsaltning med Stage-tips

    Obs: I det här skedet är det salt som finns i provet. Salter hindra HPLC-MS-analys eftersom de joniserar under elektro, undertrycka signalen från peptider. Salter kan också bilda joniska addukter på peptider, vilket minskar signal intensiteten för det icke-adderad peptiden. Som adduktbildad peptiden kommer att ha en annan massa, peptiden inte kommer att identifieras eller kvantifieras.

    1. Genom att använda en P1000 pipettspets, punsch en skiva av C 18 material från en fast fas extraktion disk. Driva minidisk ut ur P1000 spetsen genom användning av en smält kiseldioxid kapillär och deponera det minidisk till botten av en P100 / 200 pipettspetsen. Se till att disk är ordentligt fastkilade vid botten av spetsen (figur 3).
      Anmärkning: P1000 spetsen har en ganska litet hål för att stansa den C 18 disken. Det är lämpligt att skära den sista centimetern av spetsen, för att ha ett hål med större diameter.
    2. Använd två C 18 slag i samma P100 / P200 tips om avsaltning över 25 mikrogram av provet.
    3. Använd en centrifug-adapter för att hålla scen tips på plats i 1,5 ml eller 2 ml mikrocentrifugrör. Använd långsam (300-400 rcf) rotation; lösningsmedlen passerar normalt genom hartset i mindre än en minut.
    4. Spola hartset genom att snurra med 50 pl 100% acetonitril för att aktivera C 18 material och ta bort eventuella föroreningar.
    5. Jämvikt disk genom att spola 80 pl 0,1% TFA genom långsam centrifugering.
    6. Surgöra provet till pH 4,0 eller lägre med ättiksyra. Kontrollera pH med pH-remsor för att minimera provförlust. Belastningsprov på skivan genom långsam centrifugering.
    7. Tvättaprov genom att spola 70 - 80 | il av 0,1% TFA genom långsam centrifugering.
    8. Eluera provet genom att spola 70 | il 75% acetonitril och 0,5% ättiksyra genom långsam centrifugering. Samla upp provet i ett 1,5 ml rör.
    9. Torrt prov i en vakuumanrikningsverk.
      Obs: interimsstoppställe: Prov kan förvaras vid -80 ° C.

    10. Analys av Histon peptider

    Obs! NLC-MS plattform bör inrättas som görs i traditionell peptidanalys. Användningen av 200-300 nl flödeskolonn (75 pm ID analyskolonn, C 18 partiklar) rekommenderas, eftersom de är en utmärkt kompromiss mellan känslighet och stabilitet. MS förvärvsmetoden kan vara antingen en kombination av databeroende förvärv (DDA) med riktade skannar 19 eller en dataoberoende förvärv (DIA) 20,21, båda beskrivna i Representativa resultat och Figur 4.

    1. Förbereda HPLC buffertar - A: 0,1% myrsyra iHPLC-kvalitet vatten; B: 0,1% myrsyra i HPLC-kvalitet acetonitril.
    2. Programmera HPLC-metoden enligt följande: från 0 till 30% buffert B i 30 min, från 30 till 100% B för nästa 5 min och vid isokratisk 100% B under 8 min. Om HPLC inte är programmerad för automatiserad kolonn jämvikt före anbringandet av provet, då innefattar följande: gradient från 100 0% B i 1 min och isokratisk flöde vid 0% B i 10 min. Ställa in flödeshastigheten för analys till 250-300 Nl / min.
    3. Programmera MS förvärvsmetoden för att utföra antingen DDA kombinerat med riktade skannar 19 eller DIA 20,21 (Figur 4). Se till att MS duty cycle tillåter en fullständig MS skanna varje ~ 2 sek, för att få tillräckligt med datapunkter för hela kromatografiska toppen, vilket möjliggör mer exakt kvantifiering. Obs: Med C 18 kromatografi är cirka 30 sekunder för gradienten beskrivits ovan genomsnittliga baslinje toppbredden.
    4. Ladda cirka 1 pg av provet på HPLC column.
    5. Kör HPLC-MS / MS-metod enligt programmering.
      Obs! I protokollet rekommenderar vi inte detaljerna i kolumner, MS instrument eller MS parameterinformation, som alla optimala inställningar som en enskild proteomik lab utvecklas kommer att vara lämpliga för metoden. Proteomik laboratorier bör använda sin optimerade inställningar, eftersom histon peptider separat som traditionella peptider.

    11. Dataanalys

    1. Importera MS råfiler till programvaran för att utföra toppintegrationsområdet. Obs: EpiProfile 22 rekommenderas, eftersom den är optimerad för histon peptider; genom att använda uppehållstid kunskap om kromatografiska elueringen den utför pålitlig topparea utvinning av kända histon peptider. Alternativt, Skyline 23 är en annan idealisk programvara för ändamålet.
      1. Beräkna den relativa förekomsten av en viss peptid genom att dividera dess område av den totala arealen av denna peptid i alla dess modifierade former. Obs: Vid upptäckten analysis Mascot rekommenderas att identifiera spektra av modifierade histon peptider. Prestandan hos detta verktyg har beskrivits nyligen 24. Alla andra databas sökmotorer för proteomik är också användbara, men på våra tester de tillhanda lägre prestanda.

    Representative Results

    Som ett exempel, analyserade vi histoner extraherade från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) med och utan retinoinsyra (RA) stimulering, börjar med 200 pl cellpellets. Förekomst av RA i cellkultur leder till ESC differentiering. Från cellpelleten, ca 50-100 | j, g av histoner extraherades, vilket är mer än tillräckligt för att utföra flera LC-MS-injektioner av histon peptider. Efter derivatisering, matsmältning, och avsaltning, proverna laddades på en 75 | im x 15 cm C 18-kolonn (partikeldiameter 3 | im, porstorlek 300 Å) i serieläge med en högpresterande vätskekromatografi nano kromatografisystem med mikroflödessystem chips är kopplade till en hybrid linjär fälla kvadrupol - Orbitrap masspektrometer. MS förvärv genomfördes med hjälp av DIA. Parallellt togs prover analyseras också med en DDA-metoden med användning av en nanoflöde UHPLC kopplad till en hybrid jonfälla-Orbitrap masspektrometer (data ej visade). Ivarje cykel, var en fullständig MS Orbitrap detektion utförs med scan intervallet 290 till 1400 m / z, en upplösning på 60.000 (vid 200 m / z) och AGC 10 6. Därefter databeroende förvärvsläge appliceras med en dynamisk uteslutning av 30 sek. MS / MS skannar följdes på moderjoner från de mest intensiva sådana. Joner med en laddningstillstånd en exkluderades från MS / MS. En isoleringsfönster av 2 m / z användes. Joner fragmenterades med användning av kollision inducerad dissociation (CID) med stötenergi på 35%. Jonfälla detektion användes med normalsökning mätområde och normal svephastighet med AGC 10 4.

    Raw MS-data analyserades anta programvara för utvinning av utgångs och fragment jonkromatogram, nämligen Skyline 23 och EpiProfile 22. EpiProfile har optimerats för histon peptider, som integrerar intelligent topparea utvinning på grund av tidigare kunskap om peptidvattnet retentionstid. Å andra sidan, är Skyline optimerad för DIA analyser, och därmed DIA siffror visas (Figurerna 4 och 5A) är skärm från detta program. Från den extraherade jonkromatogram är området under kurvan hämtas, och detta används för att uppskatta överflödet av varje peptid. Området för den kromatografiska toppen beräknades för den [M + H] +, [M + 2H] 2+, och [M + 3H] 3+ joner av samma peptid, även om i de flesta fall den [M + 2H] 2+ var förhärskande formen. Detta ger den råa överflöd av en given modifierad form av en peptid. För att uppnå den relativa förekomsten av PTMs ades summan av alla olika modifierade former av en histon peptid betraktas som 100%, och området för den särskilda peptiden divideras med den totala arean för det histon-peptid i alla dess modifierade former .

    Histon peptider är närvarande i en variety av isobariska former (Figur 5). Isobariska peptider, t.ex., K18ac och K23ac, kan endast kvantifieras på den MS / MS-nivå, där deras unika fragmentjoner används för att bestämma förhållandet mellan de isobariska arter (figur 5a och 5b). Detta förhållande används för att dela området för den kromatografiska topp mellan de två arterna. Vid användning av DDA, var dessa isobariska former som ingår i en lista över riktade massorna, eftersom dessa peptider måste väljas för fragmentering genom hela deras eluering, vilket inte skulle ske i en vanlig DDA experiment. Diskrimineringen av den relativa förekomsten av de isobariska arter utförs sedan genom övervakning av elueringsprofilen för de fragmentjoner. Å andra sidan, inte DIA typ av förvärv kräver inte någon lista integration. Emellertid är denna typ av förvärvsmetoden inte är kompatibla med traditionell sökning i databaser, och således kan förhindra upptäckten av okända modifierade peptider.

    hESCs uppvisade en tydlig minskning av acetylerade peptider när de stimuleras till differentiering (figur 6A och 6B). Detta var inte överraskande, eftersom tidigare resultat rapporterade högre acetylering i ekonomiska och sociala råd jämfört med differentierande de 25,återspeglar i allmänhet tillåtande karaktär pluripotenta kromatin. Genom att fokusera på histon H3, var 35 olika modifierade former kvantifieras (Figur 6C). Men alla histon proteoforms som kan undersökas med detta tillvägagångssätt är mer än 200, inklusive alla histon varianter och låg förekomst ändringar (data visas ej). Dessutom vår analys visade att hög reproducerbarhet kan erhållas mellan tekniska replikat, vilket framgår av den lilla storleken på de felstaplar (som representerar ± standardavvikelse). Sammantaget beskriver det här avsnittet hur man extraherar den relativa förekomsten av histon modifierade peptider med användning av NLC-MS-data.

    Figur 1
    Figur 1:. Workflow för Bottom-up MS / MS Histon Analys De tio stegen för histon analys visas, inklusive en uppskattning av den tid som krävs för varje steg. Avsnittet numret ges inom parentes som närvarande i manuskriptet. Avsnitt 5, som beskriver provfraktione att isolera de olika histon varianter kan uteslutas om det inte finns ett behov av mycket känslig analys av en viss variant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 2
    Figur 2: omvänd fas Flow LC för Histon Variant Fraktionering och Coomassie Gel (A) LC-UV-kromatogram som representerar intakt histon separation.. Histon H3 varianter kan särskiljas från varandra beroende på deras elueringstid. Fraktioner kan hämtas antingen manuellt eller med hjälp av en automatiserad fraktionssamlare. (B) Coomassie-gel av tre replikat av histon rening.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54112/54112fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    Figur 3
    Figur 3:. Making of Stage-tippning stiftet med en P1000 pipettspets, stansa en skiva gjord av C 18 material från en fast fas extraktion disk (andra panel). Den minidisk kommer att fastna i spetsen (mellersta fältet), så att den kan skjutas ut till en mindre P100 / 200 pipettspetsen med användning av någon typ av små kapillär. I det här exemplet har vi använt en 700 pm ytterdiameter kvarts slang. Den minidisk bör skjutas till botten av P100 / 200 pipettspets tills det inte kan gå längre (sista panelen). Scenen tips är redo för histon avsaltning, eftersom det har tillräcklig kapacitet för att behålla tillräckligt med provmaterial för många upprepningar. Specifikt är tillräckligt för 15 en minidisk - 20 mikrogram av sample. Om mer prov behövs, kan flera diskar packas på varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 4
    Figur 4:. Schematisk representation DDA och DIA metoder Vid användning av DDA, är MS scan cykeln karakteriseras av sekventiell val av utgångsjoner för MS / MS fragmentering i enlighet med deras intensitet och laddningstillstånd. När en föregångare jon har fragmenterad den är placerad i en undantagslista för att undvika upprepad val av samma peptid, så att MS kan "gräva" i mindre rikligt förekommande signaler. Förvärvet metod är den teknik val i proteomik för identifieringsläge. Kvantifiering uppnås genom att integrera hela avsökningssignalen för en given jon bredvid de identifierade MS /MS-spektrum. I DIA, är hela m / z range fragment vid varje avsökningscykel. Detta tillvägagångssätt är mindre lämplig för upptäckt läge, men det ger en kromatografisk profil av alla joner, prekursorer och produkter. Detta leder till säkrare kvantifiering och diskriminering av isobariska former. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 5
    Figur 5: Kvantifiering av isobar peptider (A) Exempel på två isobariska peptider vanligtvis rikligt i histon analys.. Den extraherade jonkromatogram (XIC) av sin föregångare massa och relativa isotoper (ovan) är identiska. Emellertid XIC av produktjoner (nedan) gör det möjligt för diskriminering av de två isobariska former. Särskilt bör endast unika fragmentjoner vara ossed att uppskatta den relativa förekomsten av de två arterna. (B) Representation av de unika fragmentjoner för de två beskrivna peptiderna (markerade i rött). (C) Förteckning över de vanligaste analyserade peptiderna i Homo sapiens har åtminstone en isobar motsvarande. Sekvensvarianter mellan de uppräknade histon peptiderna anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    figur 6
    Figur 6: representativa resultat av mänskliga embryonala stamceller med och utan retinsyra behandling (A) Relativ kvantifiering av histon H3 peptiden KQLATKAAR (aa 18-26) i alla dess modifierade proteoforms.. Den relativa överflöd uppskattades med hjälp av alla proteoforms som 100% (reltivt procentandel av den omodifierade peptiden inte visade) (B) Relativ kvantifiering av histon H3 peptiden KSTGGKAPR (aa 9 -.. 17) (C) Relativ förekomst av detekterade peptider för kanoniska histon H3 med och utan cell behandling med retinsyra. Figuren anger i vilket av de två behandlingarna de givna modifieringar är mer riklig (> 50%). Sammantaget visar vi att histon H3 acetylering minskar i de flesta av de lysinrester vid induktion av celldifferentiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

    lösning # Sammansättning
    1 Kärnisoleringsbuffert (NIB) lager görs på följande sätt och lagras fryst som 100 ml alikvoter vid -20 ° C; tinadeNIB kan lagras vid 4 ° C under några veckor: 15 mM Tris, 60 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM CaCl2 och 250 mM sackaros. PH hos bufferten justeras till 7,5 med HCl.
    2 Proteashämmare (lägg färska till buffertar före användning): 1 M ditiotreitol (DTT) i DDH 2 O (1,000x); 200 mM AEBSF i DDH 2 O (400x)
    3 fosfatasinhibitor (lägg färska till buffertar före användning): 2,5 iM microcystin i 100% etanol (500x)
    4 HDAC-hämmare (lägg färska till buffertar före användning): 5 M Natriumbutyrat, tillverkade genom titrering av 5 M smörsyra användning av NaOH till pH 7,0 (500x)
    5 NP-40 Alternativ: 10% vol / vol i DDH 2 O
    6 0,2 MH 2 SO 4 i DDH 2 O
    7 Triklorättiksyra (TCA): 100% vikt / volym i DDH 2 O
    8 Aceton + 0,1% Saltsyra (HCl): 0,1% vol / vol HCl i aceton

    Tabell 1. Solutions.

    Discussion

    Protokollet som beskrivs här är optimerad med tanke på kostnader, tid och prestanda. Andra beredningar är möjliga, men de har begränsningar, speciellt i fallet med koppling med MS-analys. Till exempel, kan det med hög salthalt extraktion protokoll användas för att rena histoner 26 i stället för TCA-utfällning (avsnitt 3). Hög salthalt protokollet i sig är mildare, eftersom den inte använder stark syra. Detta bevarar syralabila PTMs och ökar utbytet av extraherade histoner, som TCA-utfällning co-fällningar många andra kromatin proteiner. Leder emellertid hög salthalt utvinning till prover innehållande alltför koncentrerad salt för HPLC-MS / MS. I en alternativ framställning, kan utföras histon digestion utan propionylation (avsnitt 6-8), till exempel genom att minska trypsin inkubationstid och enzymet / substrat-förhållande 27 eller med hjälp av ArgC som matsmältningen enzym 28-30. Dock derivatisering med propionsyraanhydrid rekommenderas, eftersom jagt leder till genereringen av flera hydrofoba peptider, som har bättre behålls under vätskekromatografi.

    För kemisk derivatisering, har en mängd olika organiska syraanhydrider utvärderats och deras meriter omfattande diskuterade 18. Trots propionsyraanhydrid visade sig den bästa kompromissen mellan effektivitet, minimerade biprodukter och förbättrad peptid hydrofobicitet. Potentiellt kan propionsyraanhydrid köpas i isotopiskt märkt form; Detta gör det möjligt för multiplexering analys på grund av möjligheten att blanda flera prover och diskriminera dem på medlemsstatsnivå på grundval av de olika massorna som överförs från den tunga etikett. Leder emellertid denna analys till en ökad komplexitet LC-MS-kromatogram och minskar mängden prov som kan injiceras för varje enda villkor.

    I detta hänseende bör vissa kritiska aspekterna av protokollet markeras. Följande bör användas som checklist för att hitta fel i att utföra proceduren i fall negativa resultat erhålls. Först efter kärnor nederbörd pelleten bör tvättas noggrant med NIB utan NP-40 Alternativ (avsnitt 2.10) tills fullständigt avlägsnande av rengöringsmedel (märk av bristen av bubblor under blandning). Om du inte gör det skulle äventyra histon extraktion med syror. För det andra, efter histon utfällning med TCA (avsnitt 3.9) tvättar av pelleten med aceton är avgörande. Närvaro av koncentrerad syra skulle skada följande steg om propionylation och matsmältning (avsnitt 6.1) är direkt utförs. Det skulle inte vara problematiskt i fallet histon fraktionering utförs (avsnitt 5). För det tredje är det viktigt att propionylation reaktionen utföres snabbt (avsnitt 6,3-6,7). För att göra detta, undvika att använda samma propionylation blandning (propionsyraanhydrid + acetonitril) för mer än 3 - 4 på varandra följande prover. Dessutom är pH den viktigaste aspekten av trypsin matsmältning (avsnitt 7). Om intecirka 8,0 (7,5-8,5) matsmältningen blir ineffektiv. Detta kan inträffa, eftersom provet kommer att vara rik på propionsyra i detta steg. NH4OH kan tillsättas förrän det är nödvändigt. Även för forskare bekanta med proteomik arbetsflöden det kommer att kännas normalt att surgöra provet för att avsluta trypsin matsmältningen. Detta bör inte göras, eftersom det kommer att äventyra följande reaktion, dvs., propionylation av peptid N-terminaler (avsnitt 8.1). Slutligen, i samma fråga, är det viktigt att komma ihåg för dataanalys som omodifierade peptider är faktiskt inte omodifierad; alla fria lysinrester och N-terminaler kommer att upptas av propionylation (56,026 Da). Således skulle utföra utvinna jonkromatografi av den massa som motsvarar unikt till peptidsekvensen leda till några resultat.

    Begränsningarna med metoden är främst relaterade till oförmåga att detektera kombi PTMs, på grund av de korta peptidsekvenser, och fördomar för att uppnå den sanna Abundans av en modifiering, på grund av det faktum att peptider i olika modifierade former kan jonisera med olika verkningsgrader. Den första frågan kan lösas genom att kombinera denna teknik med en medel ner eller top-down-metod (översikt i 16). Denna typ av analys, även om det är tekniskt mer utmanande, är idealisk för att studera samexistens frekvenser av ändringar. Dessutom tillåter det bättre diskriminering av histon varianter, som inte alltid kan uppnås med bottom-up eftersom vissa peptider har samma sekvens i olika histon varianter. Den andra frågan, i samband med jonisering effektivitet, kan lösas med ett bibliotek av syntetiska peptider 31. Denna metod ger en mer noggrann uppskattning av den relativa förekomsten av histon PTMs. Men i de flesta experiment, är det önskade resultatet de relativa förändringarna av givna modifieringar mellan analyserade betingelser. I detta fall är det inte nödvändigt sådan korrigering, på grund av det faktum att samtliga prover har samma bias.

    Sammanfattningsvis ger detta protokoll för att analysera histon PTMs som kan fyllas i 3 dagar med NLC kopplad till tandem MS. Jämförelser med andra än MS-tekniker, dvs. genom att använda strategier antikroppsbaserade som diskuteras i inledningen, är inte lämpliga, eftersom de inte kan uppnå ännu nästan denna nivå av genomströmning. Dessutom har antikroppsbaserade tekniker inte tillåter för upptäckten av nya ändringar, men de är uteslutande bygger på att bekräfta och kvantifiera förväntade märken. Vi spekulerar därför att bottom-up proteomik på histon peptider vinna popularitet i proteomik laboratorier på grund av de intuitiva fördelar i att veta regleringen av histon varumärken, som är huvudpersoner i tuning genuttryck och därmed påverka regleringen av proteomet. Dessutom beskrev Protokollet innehåller de senaste förbättringarna i provpreparering och mjukvara för dataanalys, som gör histon analys mer trivial även för laboratorier som aldrig upplevt karakterisering av denna typ av hypermodified peptider.

    Disclosures

    Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

    Acknowledgments

    Detta arbete stöddes av medel från NIH bidrag (DP2OD007447, R01GM110174 och R01AI118891).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Trypsin 0.25% EDTA Invitrogen 25200056 For harvesting cells
    PBS Invitrogen 14200075
    Tris Roche 77-86-1
    Potassium Chloride Fisher Scientific BP366-500
    Sodium Chloride Sigma S9888
    Magnesium Chloride hexahydrate Sigma M9272
    Calcium Chloride, anhydrous Sigma C1016
    Sucrose Fisher Scientific BP220-1
    DTT Invitrogen 15508-013
    AEBSF EMD Millipore Corp 101500
    Microcystin Sigma M4194
    Sodium Butyrate Sigma B5887
    Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)  Fisher Scientific 78445
    NP- 40 Alternative CALBIOCHEM 492016
    Sulfuric Acid, ACS grade Fisher Chemical 7664-93-9
    Trichloroacetic acid Sigma T6399
    Acetone Sigma 179124
    HCl Fisher Chemical A144-500
    Bradford reagent Biorad 500-0006
    30% acrylamide/bis 29:1 — 500 ml Biorad 1610156
    Coomassie Fisher Scientific 20278
    C18 Column (5 µm) 2.1 mm x 250 mm Grace 218TP52
    C18 Column (5 µm) 4.6 mm x 250 mm Grace 218TP54
    HPLC grade acetonitrile Fisher Chemical A955-4
    HPLC grade water Fisher Scientific W6 4
    TFA Fisher Scientific A11650
    Ammonium Bicarbonate Sigma A6141
    ammonium hydroxide Sigma 338818
    propionic anhydride Sigma 240311
    Sequencing grade modified trypsin Promega PRV5113 For digesting histones for MS
    Acetic Acid Sigma 49199
    C18 extraction disk Empore 2215
    Formic Acid Sigma F0507

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Waddington, C. H. Canalization of development and the inheritance of acquired characters. Nature. 150, 563-565 (1942).
    2. Sharma, S., Kelly, T. K., Jones, P. A. Epigenetics in cancer. Carcinogenesis. 31, (1), 27-36 (2010).
    3. Reik, W., Dean, W., Walter, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science. 293, (5532), 1089-1093 (2001).
    4. Kouzarides, T. Chromatin modifications and their function. Cell. 128, (4), 693-705 (2007).
    5. Tessarz, P., Kouzarides, T. Histone core modifications regulating nucleosome structure and dynamics. Nat Rev Mol Cell Bio. 15, (11), 703-708 (2014).
    6. Fischle, W., Wang, Y. M., Allis, C. D. Histone and chromatin cross-talk. Curr Opin Cell Biol. 15, (2), 172-183 (2003).
    7. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The language of histone crosstalk. Cell. 142, (5), 682-685 (2010).
    8. Simboeck, E., et al. A Phosphorylation Switch Regulates the Transcriptional Activation of Cell Cycle Regulator p21 by Histone Deacetylase Inhibitors. J Biol Chem. 285, (52), 41062-41073 (2010).
    9. Hirota, T., Lipp, J. J., Toh, B. H., Peters, J. M. Histone H3 serine 10 phosphorylation by Aurora B causes HP1 dissociation from heterochromatin. Nature. 438, (7071), 1176-1180 (2005).
    10. Xhemalce, B., Kouzarides, T. A chromodomain switch mediated by histone H3 Lys 4 acetylation regulates heterochromatin assembly. Genes Dev. 24, (7), 647-652 (2010).
    11. Vermeulen, M., et al. Quantitative interaction proteomics and genome-wide profiling of epigenetic histone marks and their readers. Cell. 142, (6), 967-980 (2010).
    12. van Attikum, H., Gasser, S. M. Crosstalk between histone modifications during the DNA damage response. Trends Cell Biol. 19, (5), 207-217 (2009).
    13. Fernandez-Capetillo, O., et al. H2AX is required for chromatin remodeling and inactivation of sex chromosomes in male mouse meiosis. Dev Cell. 4, (4), 497-508 (2003).
    14. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. Embo J. 28, (17), 2511-2531 (2009).
    15. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat Struct Mol Biol. 18, (1), 91-93 (2011).
    16. Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. J Proteomics. 75, (12), 3419-3433 (2012).
    17. Plazas-Mayorca, M. D., et al. One-Pot Shotgun Quantitative Mass Spectrometry Characterization of Histones. J Proteome Res. 8, (11), 5367-5374 (2009).
    18. Sidoli, S., et al. Drawbacks in the use of unconventional hydrophobic anhydrides for histone derivatization in bottom-up proteomics PTM analysis. Proteomics. 15, (9), 1459-1469 (2015).
    19. Lin, S., Garcia, B. A. Examining histone posttranslational modification patterns by high-resolution mass spectrometry. Methods Enzymol. 512, 3-28 (2012).
    20. Sidoli, S., et al. SWATH Analysis for Characterization and Quantification of Histone Post-translational Modifications. Mol Cell Proteomics. (2015).
    21. Krautkramer, K. A., Reiter, L., Denu, J. M., Dowell, J. A. Quantification of SAHA-Dependent Changes in Histone Modifications Using Data-Independent Acquisition Mass Spectrometry. J Proteome Res. (2015).
    22. Yuan, Z. F., et al. EpiProfile Quantifies Histone Peptides With Modifications by Extracting Retention Time and Intensity in High-resolution Mass Spectra. Mol Cell Proteomics. 14, (6), 1696-1707 (2015).
    23. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, (7), 966-968 (2010).
    24. Yuan, Z. F., Lin, S., Molden, R. C., Garcia, B. A. Evaluation of proteomic search engines for the analysis of histone modifications. J Proteome Res. 13, (10), 4470-4478 (2014).
    25. Tan, Y., Xue, Y., Song, C., Grunstein, M. Acetylated histone H3K56 interacts with Oct4 to promote mouse embryonic stem cell pluripotency. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (28), 11493-11498 (2013).
    26. Vonholt, C., et al. Isolation and Characterization of Histones. Methods Enzymol. 170, 431-523 (1989).
    27. Zhang, K. L., et al. Identification of acetylation and methylation sites of histone H3 from chicken erythrocytes by high-accuracy matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight, matrix-assisted laser desorption ionization-postsource decay, and nanoelectrospray ionization tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 306, (2), 259-269 (2002).
    28. Jufvas, A., Stralfors, P., Vener, A. V. Histone Variants and Their Post-Translational Modifications in Primary Human Fat Cells. Plos One. 6, (1), e15960 (2011).
    29. Bonaldi, T., Imhof, A., Regula, J. T. A combination of different mass spectroscopic techniques for the analysis of dynamic changes of histone modifications. Proteomics. 4, (5), 1382-1396 (2004).
    30. Zhao, X. L., et al. Comparative Proteomic Analysis of Histone Post-translational Modifications upon Ischemia/Reperfusion-Induced Retinal Injury. J Proteome Res. 13, (4), 2175-2186 (2014).
    31. Lin, S., et al. Stable-isotope-labeled histone peptide library for histone post-translational modification and variant quantification by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 13, (9), 2450-2466 (2014).
    Komplett arbetsflöde för analys av Histon posttranslationella modifieringar med botten upp masspektrometri: Från Histon Extraction till dataanalys
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).More

    Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete Workflow for Analysis of Histone Post-translational Modifications Using Bottom-up Mass Spectrometry: From Histone Extraction to Data Analysis. J. Vis. Exp. (111), e54112, doi:10.3791/54112 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter