Summary
Her præsenterer vi en protokol til at undersøge genomet bred DNA methylering i stor skala kliniske patient screening undersøgelser med anvendelse af methyl-Bindende DNA Capture sekventering (MBDCap-seq eller MBD-seq) teknologi og efterfølgende bioinformatik analyse pipeline.
Abstract
Methylering er en af de væsentlige epigenetiske ændringer af DNA, som er ansvarlig for den præcise regulering af gener, der er nødvendige for stabil udvikling og differentiering af forskellige vævstyper. Dysregulering af denne proces er ofte kendetegnende for forskellige sygdomme som kræft. Her vil vi skitsere en af de seneste sekventering teknikker, Methyl-bindende DNA Capture sekventering (MBDCap-seq), anvendes til at kvantificere methylering i forskellige normale og sygdom væv til store patientkohorter. Vi beskriver en detaljeret protokol af denne affinitetsberigelse tilgang sammen med en bioinformatik rørledning for at opnå optimal kvantificering. Denne teknik er blevet anvendt til at sekventere flere hundrede patienter på tværs af forskellige cancertyper som en del af det 1.000 methylome projektet (Cancer Methylome System).
Introduction
Epigenetisk regulering af gener gennem DNA-methylering er en af de væsentlige mekanismer, der kræves til bestemmelse af celle skæbne ved stabil differentiering af forskellige vævstyper i legemet 1. Dysregulering af denne proces er blevet kendt for at forårsage forskellige sygdomme, herunder cancer 2.
Denne fremgangsmåde involverer hovedsagelig tilsætning af methylgrupper på cytosinrest i CpG-dinukleotider i DNA 3. Der er et par forskellige teknikker i øjeblikket anvendes til at undersøge denne mekanisme, der hver har deres egne fordele som skitseret i mange undersøgelser 2-8. Her vil vi diskutere en af disse teknikker kaldes Methyl-bindende DNA Capture sekventering (MBDCap-seq), hvor vi bruger en affinitet berigelse teknik til at identificere methylerede regioner af DNA. Denne teknik bygger på den methyl-bindende evne MBD2 proteinet til berige for de genomiske DNA-fragmenter indeholdende methylerede CpG sites. Vi benytter en kommerciel methyleret DNA berigelse kittil isoleringen af disse methylerede regioner. Vores laboratorium har screenet hundredvis af patientprøver ved hjælp af denne teknik, og her giver vi et omfattende optimeret protokol, som kan bruges til at undersøge store patientkohorter.
Som det ses med enhver næste generation sekventering teknologi, MBDCap-seq kræver også en specifikke bioinformatik tilgang for nøjagtigt at kvantificere niveauet af methylering tværs prøverne. Der har været mange nylige undersøgelser i et forsøg på at optimere normalisering og analyseprocessen af sekventering data 9, 10. I denne protokol, vi demonstrerer en af disse metoder til gennemførelse af en unik læse opsving tilgang - LONUT - efterfulgt af lineær normalisering af hver prøve for at muliggøre upartiske sammenligninger på tværs stort antal patientprøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle væv opnås efter godkendelse af Institutional Review Board udvalg og når alle deltagere samtykke til både molekylære analyser og opfølgende undersøgelser. Protokollerne er godkendt af udvalget Menneskelige Studies ved University of Texas Health Science Center på San Antonio.
1. Methyl-bindende DNA Capture (MBDCap)
- Indsamling prøve og DNA-isolering
- Indsamle bulk-tumor eller normale vævsprøver fra patientens paraffinindlejrede vævsprøver.
- Brug en kommerciel DNA mini kit til isolering af genomisk DNA fra paraffinindlejrede vævsprøver ifølge fabrikantens protokol.
- Brug en methyleret DNA berigelse kit med den her beskrevne ifølge producentens protokol procedure.
- Indledende perle vask
Bemærk: Perlerne anvendes til kobling med MBD-Biotin-protein, som detekterer DNA-methylering på genomet. Perler sædvanligvis ophængti en stamopløsning. Brug disse trin til at vaske denne væske.- Resuspender bestanden af streptavidinkugler (se Materialer Table) ved forsigtigt at pipettere op og ned for at opnå en homogen suspension. Bland ikke perlerne ved hvirvelblanding.
- For én ug indført DNA, ADD10 pi perler til et rør med 90 pi af 1x Bind / vaskebuffer. Rotere i 1 minut. Må ikke vortexes.
- Placer røret (rørene) på et magnetisk stativ i 1 min.
- Fjern væsken med en pipette og kassér væsken.
- Tilføj 250 pi 1x Bind / vaskebuffer til perlerne og rotere i 1 min.
- Gentag trin 1.2.3 - 1.2.5 to gange.
- Kobling af MBD-Biotin-protein til perlerne
- For 1,2 ug indført DNA, tilsættes 7 pi (3,5 ug) af MBD-Biotin-protein til hvert rør.
- Tilføj 93 pi 1x Bind / vaskebuffer til proteinet at foretage en endelig volumen på 100 pi.
- Bland perlerne-proteinblanding på en roterende blander ved stuetemperatur i 1 time.
- Fragmenteret DNA (input)
- Soniker DNA ved tilsætning 1,2 ug totalt genomisk DNA i 96 pi TE-buffer og 24 pi 5x Bind / vaskebuffer for at lave en 120 pi opløsning. Brug 30 s power ON og 30 s magt OFF under lydbehandling 20 - 25 gange.
- Kør 1 pi sonikeret DNA-opløsning ved anvendelse af et Bioanalyzer system med en kommerciel høj følsomhed DNA kit til at kontrollere størrelsen af fragmenterne til at være i størrelsesordenen 150 - 350 bp ifølge producentens protokol.
- Vask MBD-beads
- Glasset anbringes indeholdende MBD-perler på en magnetisk stativ i 1 min.
- Fjern og kassér væske med en pipette uden at røre perlerne.
- Resuspender perlerne med 250 pi 1x Bind / vaskebuffer.
- Bland perlerne på en roterende blander ved stuetemperatur i 5 min.
- Gentag trin 1.5.1 - 1.5.4 to gange.
- Fragmenteret DNA capture reaktion (1 ug input DNA)
- Overfør DNA / Buffer blandingen til røret indeholdende MBD-beads.
- Bland MBD-perler med DNA'et på en roterende blander i 1 time ved stuetemperatur. Alternativt, bland O / N ved 4 ° C.
- Fjerne ikke-indfanget DNA fra perlerne
- Efter blanding af DNA og MBD-beads, anbringes glasset på den magnetiske stativ i 1 min for at koncentrere alle perlerne på indervæggen af røret.
- Fjern supernatanten væske med en pipette og gemme den i en ren DNase-fri mikrocentrifugerør som ikke-methyleret DNA. Opbevar denne prøve på is.
- Tilsæt 200 pi af 1x Bind / vaskebuffer til perlerne at vaske perlerne.
- Bland perlerne på en roterende mixer i 3 minutter.
- Glasset anbringes på den magnetiske stativ i 1 min.
- Fjern væsken med en pipette og gemme det i et mikrocentrifugerør.
- Til capTure reaktioner af ≤1 ug input DNA Gentag trin 1.7.3 - 1.7.6 til 2 flere vaske fraktioner i alt.
- Enkelt fraktion eluering
- Bland buffer med lavt saltindhold med høj salt buffer (1: 1) for at få elueringspuffer (1,000 mM NaCl).
- Resuspendere perlerne i 200 pi elueringspuffer (1,000 mM NaCl).
- Inkuber de perler på en roterende mixer i 3 minutter.
- Glasset anbringes på den magnetiske stativ i 1 min.
- Med røret på plads på den magnetiske rack, fjerne væske med en pipette uden at røre perlerne med pipettespidsen, og gemme det i en ren DNase-fri 1,5 ml mikrocentrifugerør. Opbevar denne prøve på is.
- Gentag trin 1.8.1 - 1.8.4 gang, indsamle den anden prøve i det samme rør (samlet volumen vil være 400 uL). Opbevar samleprøve på is.
- Ethanolpræcipitation (DNA oprydning)
- Til hver noncaptured, vask, og elueringsfraktion frabout de foregående trin, tilsættes 1 pi glycogen (20 ug / pi, inkluderet i sættet), 1/10 prøvevolumen på 3 M natriumacetat, pH 5,2 (f.eks, 40 pi pr 400 pi prøve) og 2 prøvevolumener på 100% ethanol (f.eks 800 pi pr 400 pi prøve). Det samlede volumen er 1.241 uL.
- Bland godt og inkuber ved -80 ° C i mindst 2 timer.
- Centrifugeres i 15 minutter ved 11,363 xg ved 4 ° C.
- kassere forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet.
- Der tilsættes 500 pi kold 70% ethanol.
- Centrifugeres i 5 minutter ved 11,363 xg ved 4 ° C.
- kassere forsigtigt supernatanten uden at forstyrre bundfaldet.
- Gentag trin 1.9.6 - 1.9.7 én gang og fjerne eventuelle resterende resterende supernatant.
- Air-tørre pillen for ~ 5 min. Må ikke helt tørre pillen.
- Resuspender DNA pellet i 37,5 pi af DNase-frit vand eller andetpassende volumen puffer.
- Placer DNA på is eller opbevar DNA ved -20 ° C eller under indtil videre brug.
- Kontroller, at den samlede mængde DNA er over 20 ng, (f.eks bruge fluorometrisk kvantificering, se Materialer tabel).
2. Sekventering
- Brug DNA-fragmenter udvundet fra MBDCap procedure til sekventering. For hver prøve, der skal sekventeret, et samlet beløb på 20 - er 40 ng DNA kræves for biblioteket forberedelse.
- For DNA-seq forberedelse bibliotek bruge en fuldautomatisk bibliotek byggesystem (se Materialer Table) og følg standardprotokol leveret af producenten. Vælg DNA-fragmenter med en størrelse fra 200 til 400 bp for bibliotek forberedelse. Den automation bibliotek indsugning-system gør det muligt at standardisere bibliotek forberedelse proceduren og minimere variation på tværs af prøverne på grund af manuel forberedelse.
- Brug adapter primers og fortyndes til 100x koncentration. Heraf bruge 10 uL for hver prøve.
- Efter trin 2.2, tegne reaktionen, og kvantificere DNA-seq bibliotek under anvendelse af et fluorometrisk kvantificering-system (se Materialer tabel).
- Opsæt PCR-amplifikation procedure. Valget af PCR Master Mix er at forbedre PCR effektiviteten af GC beriget region genom. I en PCR-rør tilsættes 15 pi DNA-seq bibliotek, 25 pi PCR Master Mix (se Materialer tabel), 2 pi PCR-primer mix (se Materialer tabel), og 8 pi H 2 O.
- Følg PCR anbefaling fra producenten af PCR-blandingen, ændring cyklustider og temperaturer for forskellige udgangsmaterialer: 98 ° C i 45 s, X cyklusser af 98 ° C i 15 s, 65 ° C i 30 s, 72 ° C i 30 s, og derefter 72 ° C i 1 min. Hold ved 4 ° C.
- PerfOrm nok cykler til at ende med 2 - 10 nM bibliotek DNA (8 - 10 cyklusser).
- Rense PCR-reaktion med 1: 1-forhold mellem PCR Purification perler ifølge producentens protokol (se Materialer tabel).
- Eluer med 20 - 30 pi elueringspuffer.
- Stregkode hver prøve og pool 4 prøver sammen til en bane i en gennemstrømningscelle. Brug standard 50 bp enkelt læser protokol for sekventering (se Materialer tabel).
3. Bioinformatik Analyse
Bemærk: Yderligere proces de rå fastq filer opnået fra sekventering til at udføre kvalitetskontrol og kortlægge de korte DNA-sekvenser (læser) til genomet.
- Brug Bowtie kort læse aligner, genom kortlægning værktøj på hver prøve fastq fil for at kortlægge læser til referencen genomet. Mange læse kortlægning værktøjer til rådighed til at udføre dette trin, og kan bruges på grundlag af individuelle præferencer.
- Tillad op til 2 uoverensstemmelser i engroe læser mens kortlægning til referencen genomet. Rapporter op til 20 bedste linjeføringer for hver læsning. For eksempel bruger bowtie -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- Brug LONUT 9 at inddrive formere kortlagt læser at forbedre påvisningen af de berigede regioner. For hver læsning, ville i tilpasningen højst en udvindes når det er tæt nok til nogen af de ovenfor kaldes toppe. Brug f.eks: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 <alignFile> <outputPath>. LONUT vil udføre følgende trin.
- Split alignments til entydigt kortlagt læser og formere kortlagt læser. Ring højdepunkt på entydigt kortlagt læser bruger peak opkalds BELT 11. Muligheden -w 250 og -p 99 i eksemplet kommando er for BELT.
- Mejetærsker entydigt kortlagt læser med det udvundne læser opnået fra LONUT, og den kombinerede lyder i BED format, vil blive anvendt i yderligere analyser. Beregne antallet af COMBINed læser til fremtidig normalisering.
- Bin den læser. Extract læser i region af interesse ved hjælp af Perl-script: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile>-up <opstrøms strækker længde> -dn <nedstrøms strækker længde>. For hver seng fil angivet i sampleInfoFile, den Perl-script udfører nedenstående opgaver.
Bemærk: Se supplerende kodning fil til Perl-script.- Bin den læser ind i faste bin størrelse, fx 100 bp, 24 kromosomer.
- For hvert gen er specificeret i refGeneFile, udpakke skraldespande rundt transkriptionsstartsitet (TSS), op til at udvide længden specificeret af option-up og -dn. For eksempel, udtrække data i regionen, der er op og nedstrøms 4 kb af TSS. Ved bin størrelse 100 bp, dette udtrukne data har 81 kasser, og centret bin svarer til TSS.
- For genet på antisense-strengen, flip den ekstraherede region fra venstre mod højre, så opstrøms placeringer er altid placed til venstre med Perl-script.
- Yderligere opdele TSS ± 4 kb region i tre underområder: Venstre, opstrøms 4 kb til opstrøms 2 kb; Mellemøsten, op og nedstrøms 2 kb; Højre, nedstrøms 2 kb til 4 kb.
- For hver prøve opdele optælling af læser i hver bin med det samlede antal af kombineret kortlagt læser beregnet i 3.3.3. Normaliseringen vil fjerne prøven specifikke læser forskelle og tillader at sammenligne læser på tværs af forskellige prøver.
- Kør bash script (som angivet i scriptet fil) til statistisk test på den normaliserede læser fås fra venstre område, for at opdage forskellen methylering mellem normal og case gruppe i regionerne, der er beskrevet som i flanken region.
Bemærk: Se den supplerende kodning filen til bash script. Baseret på de regioner, der differentielt methylerede, der er syv kombinationer:
Hele regionen: differential methylering hele TSS ± 4 kb region
MiddleLeft: differential methylering i både midt og venstre region
MiddleRight: differential methylering i både midt og højre region
Flanker: differential methylering i både venstre og højre region
Venstre: differential methylering i venstre område kun
Til højre: differential methylering i højre region kun
I midten: differential methylering midt region kun - Brug den samme bash script til at visualisere forskellen methylering i en tornado plot. Plot hyper og hypo denatureret gener på en separat panel, og sortere i den rækkefølge af kombinationen regionen som beskrevet i 3.4, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har anvendt MBDCap-seq at studere DNA methylering ændringer i et stort antal patienter fra forskellige cancertyper, herunder bryst- 12, endometrial 13, prostata 14 og leverkræft blandt andre. Her demonstrerer vi nogle oplysninger fra undersøgelsen brystkræft offentliggjort for nylig 12. I dette tilfælde benyttede vi hele genomet sekventering tilgang til at identificere CpG øer, der er differentielt methylerede i tumor i forhold til normalt tværs af forskellige genomiske regioner. Undersøgelsen viste, at ud af den samlede undersøgte CpG øer beliggende i genpromotorer (n = 13.081), 19,5% viste forskellen methylering i tumorer i forhold til det normale. Ligeledes ud af 6,959 intrageniske CpG øer, 55,2% viste forskellen methylering. Intergeniske initiativtagere viste 28,1% af 4847, og for genpromotorer uden CpG øer, 1,8% af 5.454 undersøgte regioner viste forskellen DNA methylering (figur 1A). En visuel repræsentation(Figur 1B) viser repræsentative eksempler på de regioner beskrevet ovenfor. Den Heatmap tydeligt viser de methylerede regioner tværs 77 brysttumorer, 10 bryst normale væv, og 38 brystcancercellelinier. Den kvantificering af methylering som diskuteret i bioinformatik-protokollen beskrevet i dette manuskript, gør os i stand til at udføre forskellige statistiske tests på tværs af disse patientprøver at identificere væsentlige methylering forskelle i hele befolkningen eller en subpopulation. Denne analyse tilgang giver os testbare mål for yderligere at undersøge de epigenetiske mekanismer i disse patientprøver. Når disse mål er identificeret, kan niveauerne af methylering yderligere kvantificeres og valideres ved hjælp pyrosekventering. Den MBDCap-seq tilvejebringer et genomisk opløsning på ca. 100 - 200 bp til målene. For at opnå yderligere opløsning, kan vælges individuelle CpG steder i disse regioner for pyrosekventering kvantificering. Vi bruger denne metode til Quancere og validere methyleringsforskelle observeret i de MBDCap-seq data på et større opløsning og til sammenligning mellem individuelle patientgrupper. Figur 2 viser kvantificering af methylering i 2 endometriecancer undergrupper nonrecurrent (NR) sammenlignet med tilbagevendende (R). Figuren afbilder niveauet af methylering af DNA for hver patient i de 2 grupper på forskellige bindingssteder for CpG i promotoren CpG ø af det identificerede målgenet SFRP1.
Figur 1:. DNA hypermethylering i brystkræft prøver i forhold til normalt brystvæv i promotor- og ikke-promotor- CpG-øer Methyl capture sekventering (MBD-seq) blev anvendt til at generere DNA methylering profiler af genomerne af brysttumorer (n = 77) og normalt brystvæv (n = 10). (A) Pie diagrammer demonstrerer forskellen methylering i promotor, intragenisk, og intergeniske CGI'er såvel som ikke-CGI promotorregioner. (B) Eksempel loci viser promotor CGI, intragenisk, intergeniske og ikke-CGI promotorregioner. Stiplede firkanter fremhæve regioner svarende til brystkræft hypermethylering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Kvantificering af DNA methylering hjælp pyrosekventering af CpG sites i en identificeret target gen DNA methylering af SFRP 5 promoter region i tilbagevendende og ikke-tilbagevendende endometrie karcinom patienter opdaget af pyrosekventering.. Hvert websted repræsenterer en CpG websted (R: Tilbagevendende, n = 21 og NR: Non-Tilbagevendende, n = 71). Graferne viserde gennemsnitlige og fejl søjler viser standardafvigelse af middelværdien eller SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MBDCap-seq teknik er en affinitet berigelse tilgang 3, betragtes som et omkostningseffektivt alternativ når han undersøger kohorter med et stort antal patienter 15. Rørledningen præsenteres her beskriver en samlet tilgang fra prøve indkøb til analyse og fortolkning af data. Et af de vigtigste skridt er at oprette en PCR-amplifikation for at sikre bedre PCR effektivitet GC beriget regioner i genomet som dette er hvor DNA-methylering forekommer. Det er også vigtigt at sikre, at efter sekventering, hver prøve har mindst mere end 20 millioner entydigt mappes læser til genomet. Denne dækning forventes at give tilstrækkelig berigelse eller sekvens dybde at kortlægge hele genomet 12. Hvis denne dækning ikke er opfyldt i den første runde af sekventering for en bestemt prøve og mere DNA for at prøve fra en del man er til rådighed, kan en anden runde af sekventering i del to køres. Den resulterende læser kan sammenlægges med rEADS fra den første runde med henblik dækningen. De overordnede eksperimenter skal designet til at omfatte nogle biologiske kontroller (f.eks normal væv) til at redegøre for partiskhed baseret på faktorer som kopi-nummer variationer 15.
Vores bioinformatik tilgang til at undersøge DNA-methylering observeret i patientprøver giver mulige målgener, der viser forskellen methylering berigelse i kernepromotor, promotor shore regioner og også forskellige kombination af disse. På trods af at MBDCap-seq højst kan nå opløsning ned kun op til et 100 bp, sondringen af disse regioner i kernen og kysten som beskrevet i protokollen gør det muligt for os at identificere potentielle målregioner for yderligere undersøgelser af de regulatoriske roller differential methylering berigelser og gennemføre fremtidige mekanistiske undersøgelser. Her har vi også beskrive en måde at visualisere disse identificerede områder ved hjælp tornado parceller, der giver et overblik over den differentierede berigelsemønstre.
Der er andre teknikker, som er baseret på kemisk omdannelse af umethyleret cytosin til uracil ved natriumbisulfid gennem deaminering, og give en mere omfattende dækning af DNA methylering ved et enkelt nukleotid opløsning. Normalt efter bisulfide konvertering, er det DNA sekventeret ved pyrosekventering for målrettede eksperimenter eller ved hele genomet haglgevær bisulfide sekventering (BS-seq). Disse teknikker fat begrænsning af teknikken beskrevet her som MBDCap-seq kan kun opnå på det mest en opløsning på op til 100 bp. Trods disse metoder er mere omfattende, er de relativt dyre og kan eksponentielt øge omkostningerne som dybden af sekventering eller antallet af patienter øges. På den anden side, der almindeligvis anvendes bisulfide microarray platforme er omkostningseffektive, men giver relativt lave dækning med prober undersøge områder tæt på genpromotorer snarere end hele genomet. MBDCap-seq dog giveren balance mellem disse høje omkostninger sekventering teknikker og billige methylering arrays 16. Vi bruger denne protokol til at undersøge DNA methylering i et stort antal patientkohorter, som en del af Cancer Methylome System projekt 10 og kan bruges i fremtidige undersøgelser med store patientkohorter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Denne protokol er udviklet i laboratorier Dr. Tim Huang og Dr. Victor Jin på University of Texas Health Science Center på San Antonio.
Acknowledgments
Arbejdet er støttet af CPRIT Research Training Award RP140105, samt delvist støttet af amerikanske National Institutes of Health (NIH) giver R01 GM114142 og af William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H.
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
