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Genetics

मरीज के ऊतकों के लिए मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कब्जा

Published: October 31, 2016 doi: 10.3791/54131
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 2, 1, 1
1Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Greehey Children's Cancer Research Institute, University of Texas Health Science Center at San Antonio

Summary

यहाँ हम बड़े पैमाने पर नैदानिक ​​रोगी स्क्रीनिंग मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कैद (MBDCap-सेक या एमबीडी-सेक) प्रौद्योगिकी और बाद में जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग अध्ययन में जीनोम विस्तृत डीएनए मेथिलिकरण जांच के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

मेथिलिकरण डीएनए है, जो स्थिर विकास और विभिन्न प्रकार के ऊतकों के भेदभाव के लिए आवश्यक जीन की सटीक विनियमन के लिए जिम्मेदार है के लिए आवश्यक epigenetic संशोधनों में से एक है। इस प्रक्रिया के अनियंत्रण अक्सर कैंसर जैसी बीमारियों की पहचान है। यहाँ, हम हाल अनुक्रमण तकनीकों में से एक रूपरेखा, मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कैद (MBDCap-सेक), बड़े रोगी साथियों के लिए विभिन्न सामान्य और रोग के ऊतकों में मेथिलिकरण यों इस्तेमाल किया। हम एक जैव सूचना विज्ञान पाइपलाइन इष्टतम मात्रा का ठहराव को प्राप्त करने के साथ-साथ इस आत्मीयता के संवर्धन के दृष्टिकोण की एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस तकनीक को 1,000 methylome परियोजना (कैंसर Methylome सिस्टम) के एक भाग के रूप में विभिन्न प्रकार के कैंसर के रोगियों भर के सैकड़ों अनुक्रम करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

Introduction

डीएनए मेथिलिकरण के माध्यम से जीन की Epigenetic विनियमन शरीर 1 में विभिन्न प्रकार के ऊतकों के स्थिर भेदभाव से सेल भाग्य का निर्धारण करने के लिए आवश्यक आवश्यक तंत्र में से एक है। इस प्रक्रिया के अनियंत्रण कैंसर 2 सहित विभिन्न रोगों का कारण ज्ञात किया गया है।

इस प्रक्रिया में मुख्य रूप से डीएनए 3 की सीपीजी dinucleotides में साइटोसिन अवशेषों पर मिथाइल समूहों के अलावा शामिल है। वहाँ कुछ अलग तकनीक वर्तमान में इस तंत्र की जांच करने के लिए, प्रत्येक अपने स्वयं के फायदे होने के रूप में कई अध्ययनों 2-8 में उल्लिखित किया जाता है। यहाँ हम इन तकनीकों, मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कैद (MBDCap-सेक) कहा जाता है, जहां हम एक समानता संवर्धन तकनीक का उपयोग डीएनए के methylated क्षेत्रों की पहचान करने के लिए चर्चा करेंगे। इस तकनीक MBD2 प्रोटीन की मिथाइल-बाध्यकारी क्षमता methylated सीपीजी साइटों युक्त जीनोमिक डीएनए टुकड़े के लिए समृद्ध करने पर बनाता है। हम एक वाणिज्यिक डीएनए methylated संवर्धन किट का उपयोगइन methylated क्षेत्रों के अलगाव के लिए। हमारी प्रयोगशाला रोगी के नमूने के सैकड़ों इस तकनीक का उपयोग जांच की गई है और यहाँ हम एक व्यापक अनुकूलित प्रोटोकॉल है, जो बड़ी रोगी साथियों जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान करते हैं।

किसी भी अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकी के साथ स्पष्ट रूप में, MBDCap-सेक भी आदेश में सही नमूने भर में मेथिलिकरण के स्तर यों करने के लिए एक विशिष्ट जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण की आवश्यकता है। वहाँ अनुक्रमण डेटा 9, 10 को सामान्य बनाने और विश्लेषण की प्रक्रिया का अनुकूलन करने के प्रयास में हाल ही में कई अध्ययन किए गए हैं। Lonut - - क्रम में रोगी के नमूने की बड़ी संख्या में निष्पक्ष तुलना में सक्षम करने के लिए प्रत्येक नमूने की रेखीय सामान्य बनाने के द्वारा पीछा इस प्रोटोकॉल में, हम इन तरीकों का एक अनूठा पढ़ें वसूली दृष्टिकोण को लागू करने से एक प्रदर्शित करता है।

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Protocol

सभी ऊतकों संस्थागत समीक्षा बोर्ड समिति के अनुमोदन के बाद और प्राप्त कर रहे सभी प्रतिभागियों को दोनों आणविक विश्लेषण और अनुवर्ती अध्ययन के लिए सहमति दे दी है। प्रोटोकॉल टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय सैन एंटोनियो में कम से मानव अध्ययन समिति द्वारा अनुमोदित कर रहे हैं।

1. मिथाइल बाध्यकारी डीएनए कैद (MBDCap)

  1. नमूना संग्रह और डीएनए अलगाव
    1. रोगी आयल एम्बेडेड ऊतकों के नमूनों से थोक ट्यूमर या सामान्य ऊतक के नमूने ले लीजिए।
    2. आयल एम्बेडेड ऊतक निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार नमूने से जीनोमिक डीएनए को अलग-थलग करने के लिए एक वाणिज्यिक डीएनए मिनी किट का प्रयोग करें।
    3. प्रक्रिया निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार यहाँ वर्णित के साथ एक डीएनए methylated संवर्धन किट का प्रयोग करें।
  2. प्रारंभिक मनका धोने
    नोट: मोती एमबीडी बायोटिन प्रोटीन है, जो जीनोम पर डीएनए मेथिलिकरण का पता लगाता के साथ कुछ करने के लिए उपयोग किया जाता है। मोती आम तौर पर निलंबित कर दिया हैएक शेयर के समाधान में। इस तरल दूर धोने के लिए इन चरणों का प्रयोग करें।
    1. धीरे से ऊपर pipetting द्वारा streptavidin मोती (सामग्री तालिका देखें) के शेयर Resuspend और नीचे एक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए। vortexing द्वारा मोती मिश्रण नहीं है।
    2. इनपुट डीएनए के एक ग्राम के लिए, 1x बाँध / धो बफर के 90 μL के साथ एक ट्यूब के मोतियों की add10 μL। 1 मिनट के लिए घुमाएँ। vortexing द्वारा मिश्रण नहीं है।
    3. ट्यूब (एस) 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर रखें।
    4. एक विंदुक के साथ तरल निकालें और तरल त्यागें।
    5. 1x बाँध / धो बफर के 250 μL मोतियों में जोड़ें और 1 मिनट के लिए बारी बारी से।
    6. दो बार 1.2.5 - दोहराएँ 1.2.3 कदम।
  3. मोती को एमबीडी बायोटिन प्रोटीन युग्मन
    1. इनपुट डीएनए के 1.2 माइक्रोग्राम के लिए, प्रत्येक ट्यूब एमबीडी बायोटिन प्रोटीन के 7 μL (3.5 माइक्रोग्राम) जोड़ें।
    2. 1x बाँध / धो बफर के 93 μL प्रोटीन में जोड़े 100 μL के अंतिम मात्रा बनाने के लिए।
    3. मोती-प्रोटीन मिश्रण1 घंटे के लिए आरटी पर एक घूर्णन मिक्सर पर मिश्रण।
  4. खंडित डीएनए (इनपुट)
    1. ते बफर के 96 μL और 24 5x की μL बाँध / धो बफर में कुल जीनोमिक डीएनए के 1.2 माइक्रोग्राम जोड़कर Sonicate डीएनए एक 120 μL समाधान बनाने के लिए। 25 बार - 30 सत्ता पर और sonication के दौरान 30 एस बिजली बंद, 20 का प्रयोग करें।
    2. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार 350 बीपी - टुकड़े के आकार की जाँच करने के लिए 150 की रेंज में होने के लिए एक वाणिज्यिक उच्च संवेदनशीलता डीएनए किट के साथ एक bioanalyzer प्रणाली का उपयोग sonicated डीएनए समाधान के 1 μL चलाएँ।
  5. एमबीडी-मोती धो
    1. 1 मिनट के लिए एक चुंबकीय रैक पर युक्त एमबीडी-मोती ट्यूब रखें।
    2. निकालें और मोती को छूने के बिना एक विंदुक के साथ तरल त्यागें।
    3. 1x बाँध / धो बफर के 250 μL के साथ मोती Resuspend।
    4. 5 मिनट के लिए आरटी पर एक घूर्णन मिक्सर पर मोती मिलाएं।
    5. दो बार 1.5.4 - दोहराएँ 1.5.1 कदम।
    6. खंडित डीएनए कब्जा प्रतिक्रिया (1 माइक्रोग्राम इनपुट डीएनए)
      1. एमबीडी-मोती युक्त ट्यूब के लिए डीएनए / बफर मिश्रण स्थानांतरण।
      2. आरटी पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन मिक्सर पर मिक्स डीएनए के साथ एमबीडी-मोती। वैकल्पिक रूप से, 4 ओ सी पर हे / n मिक्स
    7. मोतियों से गैर कब्जा कर लिया डीएनए निकाल रहा है
      1. डीएनए और एमबीडी-मोती मिश्रण के बाद, चुंबकीय रैक पर ट्यूब जगह 1 मिनट ट्यूब के भीतरी दीवार पर मोती के सभी ध्यान केंद्रित करने के लिए।
      2. एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला तरल निकालें और nonmethylated डीएनए के रूप में एक साफ DNase मुक्त microcentrifuge ट्यूब में इसे बचाने के लिए। बर्फ पर इस नमूने संग्रहित करें।
      3. 1x बाँध / धो बफर के 200 μL मोतियों में जोड़े मोती धोने के लिए।
      4. 3 मिनट के लिए एक घूर्णन मिक्सर पर मोती मिलाएं।
      5. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखें।
      6. एक विंदुक के साथ तरल निकालें और एक microcentrifuge ट्यूब में इसे बचाने के लिए।
      7. टोपी के लिएइनपुट डीएनए की ≤1 माइक्रोग्राम की प्रतिक्रियाओं संरचना, दोहराने 1.7.3 कदम - 1.7.6 कुल में 2 अधिक धोने भागों के लिए।
    8. एकल अंश क्षालन
      1. उच्च नमक बफर के साथ कम नमक बफर मिक्स (1: 1) क्षालन बफर (1,000 मिमी NaCl) पाने के लिए।
      2. क्षालन बफर (1,000 मिमी NaCl) के 200 μL में मोती resuspend।
      3. 3 मिनट के लिए एक घूर्णन मिक्सर पर मोती सेते हैं।
      4. 1 मिनट के लिए चुंबकीय रैक पर ट्यूब रखें।
      5. चुंबकीय रैक पर जगह में ट्यूब के साथ, पिपेट टिप के साथ मोती को छूने के बिना एक विंदुक के साथ तरल निकालने, और एक स्वच्छ DNase मुक्त 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब में इसे बचाने के लिए। बर्फ पर इस नमूने संग्रहित करें।
      6. दोहराएँ 1.8.1 कदम - 1.8.4 एक बार, एक ही ट्यूब में दूसरा नमूना एकत्रित (कुल मात्रा 400 μL) हो जाएगा। बर्फ पर जमा नमूना स्टोर।
    9. इथेनॉल (डीएनए सफाई)
      1. प्रत्येक noncaptured धो लें और क्षालन अंश फादरओम पिछले चरणों, 1 μL ग्लाइकोजन जोड़ने (20 माइक्रोग्राम / μL, किट में शामिल है), 3 एम सोडियम एसीटेट के 1/10 नमूना मात्रा, पीएच 5.2 (जैसे, 400 प्रति 40 μL नमूना की μL) और 100% के 2 नमूना संस्करणों इथेनॉल (जैसे, 400 प्रति 800 μL नमूना की μL)। कुल मात्रा 1,241 μL है।
      2. अच्छी तरह मिक्स और कम से कम 2 घंटे के लिए ओ सी -80 पर सेते हैं।
      3. 4 ओ सी पर 11,363 XG पर 15 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र
      4. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      5. ठंड 70% इथेनॉल के 500 μL जोड़ें।
      6. 4 ओ सी पर 11,363 XG पर 5 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र
      7. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
      8. दोहराएँ 1.9.6 कदम - 1.9.7 एक बार और किसी भी शेष अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
      9. ~ 5 मिनट के लिए गोली हवा शुष्क। पूरी तरह से गोली सूखी नहीं है।
      10. DNase मुक्त पानी या अन्य की 37.5 μL में डीएनए गोली Resuspendबफर की उचित मात्रा।
      11. बर्फ पर डीएनए की जगह या -20 ओ सी में या नीचे आगे उपयोग करें जब तक डीएनए की दुकान।
      12. चेक 20 एनजी, खत्म हो गया है कि डीएनए की कुल राशि (जैसे, fluorometric quantitation प्रणाली का उपयोग करें, सामग्री तालिका देखें)।

    2. अनुक्रमण

    1. अनुक्रमण के लिए MBDCap प्रक्रिया से बरामद डीएनए टुकड़े का प्रयोग करें। प्रत्येक नमूना अनुक्रम किया जा करने के लिए, 20 की कुल राशि - 40 एनजी डीएनए पुस्तकालय तैयारी के लिए आवश्यक है।
    2. के लिए डीएनए-सेक पुस्तकालय तैयारी एक पूरी तरह से स्वचालित पुस्तकालय निर्माण प्रणाली का उपयोग (सामग्री तालिका देखें) और मानक प्रोटोकॉल निर्माता द्वारा आपूर्ति का पालन करें। पुस्तकालय तैयारी के लिए 400 बीपी - आकार 200 के डीएनए टुकड़े का चयन करें। स्वचालन पुस्तकालय तैयारी प्रणाली पुस्तकालय तैयार करने की प्रक्रिया का मानकीकरण और मैनुअल तैयार करने के कारण नमूने भर में भिन्नता को कम करने की अनुमति देता है।
    3. उपयोग एडाप्टर प्रधानमंत्रीरुपये और 100x एकाग्रता के लिए पतला। इसमें से प्रत्येक नमूना के लिए 10 μL का उपयोग करें।
    4. 2.2 कदम के बाद प्रतिक्रिया के लिए बाहर ले, और एक fluorometric quantitation प्रणाली (सामग्री तालिका देखें) का उपयोग करते हुए डीएनए seq पुस्तकालय यों।
      1. पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया निर्धारित करें। पीसीआर मास्टर मिश्रण के चुनाव के जीनोम के जीसी समृद्ध क्षेत्र के पीसीआर दक्षता में सुधार है। एक पीसीआर ट्यूब में 15 μL डीएनए seq पुस्तकालय जोड़ने के लिए, 25 μL पीसीआर मास्टर मिश्रण (सामग्री तालिका देखें), 2 μL पीसीआर प्राइमर मिश्रण (सामग्री तालिका देखें), और 8 μL एच 2 ओ
    5. पीसीआर मास्टर मिश्रण के निर्माता से पीसीआर सिफारिश का पालन, शुरुआती सामग्री भिन्न करने के लिए साइकिल चालन के समय और तापमान में फेरबदल: 98 ओ सी 45 एस के लिए, 15 एस के लिए 98 ओ सी, 30 एस के लिए 65 ओ सी, 30 के लिए 72 ओ सी के एक्स चक्र एस, और उसके बाद 1 मिनट के लिए 72 ओ सी। 4 ओ सी पर पकड़ो
      1. perfपर्याप्त चक्र ORM 2 के साथ खत्म करने के लिए - (- 10 चक्र 8) पुस्तकालय डीएनए के 10 एनएम।
    6. 1 के साथ पीसीआर प्रतिक्रिया साफ: निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार पीसीआर शुद्धि मोतियों की 1 के अनुपात (सामग्री तालिका देखें)।
    7. 30 μL क्षालन बफर - 20 के साथ Elute।
    8. प्रत्येक नमूना और पूल एक प्रवाह सेल के एक लेन में 4 नमूने को एक साथ बारकोड। अनुक्रमण के लिए मानक 50 बीपी एकल पढ़ें प्रोटोकॉल (सामग्री तालिका देखें) का प्रयोग करें।

    3. जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण

    नोट: आगे की प्रक्रिया कच्चे fastq अनुक्रमण से प्राप्त फाइलों गुणवत्ता नियंत्रण प्रदर्शन करने के लिए और कम डीएनए दृश्यों (पढ़ता है) जीनोम को मानचित्रण।

    1. उपयोग Bowtie कम पढ़ा aligner, प्रत्येक नमूने fastq फाइल पर जीनोम मानचित्रण उपकरण नक्शा करने के लिए संदर्भ जीनोम को पढ़ता है। कई पढ़ा मानचित्रण उपकरण इस कदम प्रदर्शन करने के लिए उपलब्ध हैं और अलग-अलग वरीयता के आधार पर किया जा सकता है।
      1. Whol में 2 बेमेल अप करने के लिए अनुमति देंई पढ़ता है, जबकि संदर्भ जीनोम को मानचित्रण। प्रत्येक पढ़ने के लिए 20 सर्वश्रेष्ठ संरेखण अप करने के लिए रिपोर्ट। उदाहरण के लिए, bowtie -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile> का उपयोग करें।
    2. ठीक करने के लिए गुणा मैप किया समृद्ध क्षेत्रों का पता लगाने में सुधार के लिए पढ़ता है Lonut 9 का प्रयोग करें। प्रत्येक पढ़ने के लिए, सबसे एक संरेखण पर जब यह ऊपर बुलाया चोटियों में से किसी के लिए काफी करीब है वसूल किया जाएगा। उदाहरण के लिए, का उपयोग करें: पर्ल lonut.pl जी hg19 डब्ल्यू 250 -p 99 <alignFile> <outputPath>। Lonut निम्न चरणों का पालन करेंगे।
      1. में विभाजित संरेखण अनोखे मैप किया पढ़ता है और गुणा मैप किया पढ़ता है। विशिष्ट रूप से मैप किया पर कॉल पीक चोटी फोन करने वाले बेल्ट का उपयोग कर 11 पढ़ता है। विकल्प के 250 और पी 99 उदाहरण आदेश में डब्ल्यू बेल्ट के लिए कर रहे हैं।
      2. विशिष्ट रूप से मैप किया गठबंधन बरामद Lonut से प्राप्त पढ़ता के साथ पढ़ता है, और संयुक्त पढ़ता है, बिस्तर प्रारूप में, आगे के विश्लेषण में इस्तेमाल किया जाएगा। जोड़ती की संख्या की गणनाएड भविष्य सामान्य बनाने के लिए पढ़ता है।
    3. बिन पढ़ता है। निकालें पर्ल स्क्रिप्ट का उपयोग कर ब्याज के क्षेत्र में पढ़ता है: पर्ल methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> मेकअप <नदी के ऊपर का विस्तार लंबाई> -dn <नीचे की ओर का विस्तार लंबाई>। प्रत्येक बिस्तर sampleInfoFile में सूचीबद्ध फ़ाइल के लिए, पर्ल स्क्रिप्ट नीचे कार्य करता है।
      नोट: पर्ल स्क्रिप्ट के लिए अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल देखें।
      1. बिन, जैसे, 100 बीपी तय बिन आकार में पढ़ता है, 24 गुणसूत्रों के लिए।
      2. प्रत्येक जीन refGeneFile में निर्दिष्ट के लिए, प्रतिलेखन शुरू स्थल के आसपास डिब्बे (टीएसएस) निकाल विकल्प मेकअप और -dn द्वारा निर्दिष्ट विस्तार देने की लंबाई पर निर्भर है। उदाहरण के लिए, इस क्षेत्र है कि ऊपर और नीचे की ओर टीएसएस की 4 केबी है में डेटा निकाल सकते हैं। बिन आकार 100 बीपी पर, इस निकाले गए डेटा 81 डिब्बे, और केंद्र बिन टीएसएस से मेल खाती है।
      3. antisense कतरा पर जीन के लिए निकाले क्षेत्र फ्लिप बाएं से दाएं अपस्ट्रीम डिब्बे हमेशा से रहे हैं कि इतने पीएलएपर्ल स्क्रिप्ट के साथ छोड़ दिया पर ced।
      4. 2 KB अपस्ट्रीम लिए छोड़ दिया, नदी के ऊपर 4 केबी;: इसके अलावा तीन उप क्षेत्रों में टीएसएस ± 4 केबी क्षेत्र को विभाजित मध्य, ऊपर और नीचे की ओर 2 KB; ठीक है, नीचे की ओर 4 केबी के लिए 2 KB।
      5. प्रत्येक नमूना के लिए, गिनती विभाजित के संयुक्त मैप किया 3.3.3 में गणना पढ़ता कुल संख्या से प्रत्येक बिन में पढ़ता है। सामान्य बनाने नमूना विशिष्ट मतभेद को समाप्त होगा और पढ़ने के लिए विभिन्न नमूने भर में पढ़ता तुलना करने के लिए अनुमति देता है।
    4. पार्श्व क्षेत्र में के रूप में वर्णित क्षेत्रों में सामान्य और मामला समूह के बीच अंतर मेथिलिकरण पता लगाने के लिए पार्टी की योजना बनाई स्क्रिप्ट चलाएँ (के रूप में स्क्रिप्ट फ़ाइल में संकेत दिया) सामान्यीकृत पर सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए छोड़ दिया क्षेत्र से प्राप्त पढ़ता है।
      नोट: पार्टी की योजना बनाई स्क्रिप्ट के लिए अनुपूरक कोडिंग फ़ाइल देखें। क्षेत्रों है कि विभिन्न methylated रहे हैं पर आधारित है, वहाँ सात संयोजन कर रहे हैं:
      पूरे क्षेत्र: टीएसएस ± 4 केबी पूरे क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण
      middleLeft: दोनों के बीच और बाएं क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण
      MiddleRight: दोनों के मध्य और सही क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण
      पार्श्व: दोनों को छोड़ दिया और सही क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण
      वाम: छोड़ दिया क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण केवल
      सही: सही क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण केवल
      मध्य: मध्य क्षेत्र में अंतर मेथिलिकरण केवल
    5. एक तूफान की साजिश में अंतर मेथिलिकरण कल्पना करने के लिए एक ही पार्टी की योजना बनाई स्क्रिप्ट का उपयोग करें। एक अलग पैनल पर हाइपर और hypo methylated जीन साजिश, और 3.4 में वर्णित है, क्रमशः के रूप में क्षेत्र के संयोजन के क्रम में सॉर्ट।

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Representative Results

हम स्तन 12, एंडोमेट्रियल 13, प्रोस्टेट 14, और जिगर के कैंसर दूसरों के बीच सहित विभिन्न प्रकार के कैंसर से मरीजों की एक बड़ी संख्या में डीएनए मेथिलिकरण परिवर्तन का अध्ययन करने के MBDCap-सेक का इस्तेमाल किया है। यहाँ हम स्तन कैंसर हाल ही में प्रकाशित एक अध्ययन में 12 से कुछ जानकारी प्रदर्शित करता है। इस उदाहरण में, हम सीपीजी द्वीप है कि विभिन्न विभिन्न जीनोमिक क्षेत्रों में सामान्य करने के लिए सम्मान के साथ ट्यूमर में methylated रहे हैं की पहचान करने के लिए पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया। जांच से पता चला है कि कुल से बाहर सीपीजी जीन प्रमोटरों (एन = 13081) में स्थित द्वीपों की जांच की, 19.5% सामान्य की तुलना में ट्यूमर में अंतर मेथिलिकरण दिखाया। इसी तरह, 6959 intragenic सीपीजी द्वीपों के बाहर, 55.2% अंतर मेथिलिकरण दिखाया। Intergenic प्रमोटरों 4847 की और सीपीजी द्वीपों के बिना जीन प्रमोटरों के लिए 28.1% से पता चला, 5,454 जांच क्षेत्रों में से 1.8% अंतर डीएनए मेथिलिकरण (चित्रा 1 ए) से पता चला। एक दृश्य प्रतिनिधित्व(चित्रा 1 बी) के क्षेत्रों के ऊपर चर्चा के प्रतिनिधि उदाहरण से पता चलता है। हीटमैप स्पष्ट रूप से 77 स्तन ट्यूमर, 10 स्तन सामान्य ऊतकों, और 38 स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के पार methylated क्षेत्रों दर्शाया गया है। मेथिलिकरण की मात्रा का ठहराव के रूप में इस पांडुलिपि में विस्तृत जैव सूचना विज्ञान प्रोटोकॉल में चर्चा की, पूरी आबादी या एक उप-जनसंख्या में महत्वपूर्ण मेथिलिकरण मतभेद की पहचान करने के लिए इन रोगी के नमूने भर में विभिन्न सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए सक्षम बनाता है। इस विश्लेषण दृष्टिकोण आगे इन रोगी के नमूने में epigenetic तंत्र की जांच करने के लिए परीक्षण योग्य लक्ष्य के साथ हमें प्रदान करता है। एक बार इन लक्ष्यों को पहचान कर रहे हैं, मेथिलिकरण के स्तर को आगे मात्रा निर्धारित और pyrosequencing का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है। लक्ष्य के लिए 200 बीपी - MBDCap-सेक के बारे में 100 का एक जीनोमिक संकल्प प्रदान करता है। आगे संकल्प को प्राप्त करने के लिए, इन क्षेत्रों के भीतर अलग-अलग स्थानों सीपीजी मात्रा का ठहराव pyrosequencing के लिए चुना जा सकता है। हम क्वान के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोगtify और मेथिलिकरण मतभेद एक बड़ा संकल्प पर और व्यक्तिगत रोगी समूहों के बीच तुलना के लिए MBDCap-सेक डेटा में मनाया मान्य। 2 2 एंडोमेट्रियल कैंसर में मेथिलिकरण की मात्रा का ठहराव चलता चित्रा उपसमूहों nonrecurrent (एनआर) आवर्तक (आर) की तुलना में। चित्रा पहचान लक्ष्य जीन SFRP1 के प्रमोटर सीपीजी द्वीप में विभिन्न स्थलों पर सीपीजी 2 समूहों में प्रत्येक रोगी के लिए डीएनए मेथिलिकरण के स्तर को दर्शाया गया है।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रमोटर और गैर-प्रवर्तक सीपीजी द्वीपों में सामान्य स्तन के ऊतकों के सापेक्ष स्तन कैंसर के नमूनों में डीएनए hypermethylation मिथाइल कब्जा अनुक्रमण (एमबीडी-सेक) स्तन ट्यूमर के जीनोम के डीएनए मेथिलिकरण प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए (एन = 77) और इस्तेमाल किया गया था सामान्य स्तन के ऊतकों (एन = 10)। (ए) गड़बड़ीई चार्ट प्रमोटर, intragenic में अंतर मेथिलिकरण, और intergenic CGIs साथ ही गैर-प्रमोटर सीजीआई क्षेत्रों प्रदर्शित करता है। (बी) उदाहरण प्रमोटर सीजीआई, intragenic, intergenic, और गैर सीजीआई प्रमोटर क्षेत्रों दिखा लोकी। धराशायी चौकों स्तन कैंसर hypermethylation करने के लिए इसी क्षेत्रों पर प्रकाश डाला। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आकृति 1
चित्रा 2:। एक की पहचान लक्ष्य जीन में सीपीजी साइटों की pyrosequencing का उपयोग डीएनए मेथिलिकरण आवर्ती और गैर आवर्ती एंडोमेट्रियल कार्सिनोमा pyrosequencing द्वारा पता लगाया रोगियों में SFRP 5 प्रमोटर क्षेत्र के डीएनए मेथिलिकरण की मात्रा। प्रत्येक साइट एक सीपीजी साइट का प्रतिनिधित्व करता है (आर: बारम्बार, एन = 21 और एन.आर.: गैर आवर्तक, एन = 71)। भूखंडों दिखानेमतलब है और त्रुटि सलाखों मतलब है या SEM की मानक त्रुटि दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

MBDCap-सेक तकनीक एक समानता संवर्धन दृष्टिकोण 3, जब मरीजों को 15 साल की एक बड़ी संख्या के साथ साथियों की जांच के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प के रूप में माना जाता है। यहाँ प्रस्तुत पाइप लाइन डेटा विश्लेषण और व्याख्या करने के लिए नमूना खरीद से एक व्यापक दृष्टिकोण का वर्णन है। सबसे महत्वपूर्ण कदमों में से एक एक पीसीआर प्रवर्धन प्रक्रिया स्थापित कर रहा है जीनोम में जीसी समृद्ध क्षेत्रों की पीसीआर दक्षता में सुधार के रूप में यह है, जहां डीएनए मेथिलिकरण होता है। इसके अलावा, यह अनुक्रमण के बाद, प्रत्येक नमूने में कम से कम 20 मिलियन से अधिक विशिष्ट रूप से मैप किया जीनोम को पढ़ता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। इस कवरेज के लिए पर्याप्त संवर्धन या अनुक्रम गहराई पूरे जीनोम 12 नक्शा करने के लिए उपलब्ध कराने की उम्मीद है। इस कवरेज हिस्से से एक विशेष नमूना के लिए अनुक्रमण के पहले दौर और उस नमूने के लिए अधिक डीएनए के दौरान मुलाकात नहीं है, तो एक ही उपलब्ध है, दो भाग में अनुक्रमण के दूसरे दौर चलाया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप आर के साथ विलय किया जा सकता पढ़तापहले दौर से EADS कवरेज प्राप्त करने के लिए। समग्र प्रयोगों कॉपी संख्या रूपों 15 जैसे कारकों के आधार पर पूर्वाग्रह के लिए खाते में कुछ जैविक नियंत्रण (जैसे, सामान्य ऊतक) शामिल करने के लिए तैयार किया जाना चाहिए।

हमारी जैव सूचना विज्ञान दृष्टिकोण रोगी के नमूने में मनाया डीएनए मेथिलिकरण की जांच करने के लिए संभव लक्ष्य जीन है कि दिखाने के कोर प्रमोटर में अंतर मेथिलिकरण संवर्धन, प्रमोटर किनारे क्षेत्रों और इनमें से भी विभिन्न संयोजन प्रदान करता है। तथ्य यह है कि MBDCap-सेक में सबसे केवल एक 100 बीपी अप करने के लिए नीचे संकल्प तक पहुँच सकते हैं के बावजूद, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में कोर और किनारे में इन क्षेत्रों का गौरव की नियामक की भूमिका निभाने की आगे की जांच के लिए संभावित लक्ष्य क्षेत्रों की पहचान करने के लिए सक्षम बनाता है मेथिलिकरण संवर्धन अंतर है और भविष्य यंत्रवत अध्ययन का संचालन। यहाँ हम भी भूखंडों बवंडर का उपयोग कर इन क्षेत्रों की पहचान की कल्पना करने के लिए एक तरीका है, जो अंतर है संवर्धन का अवलोकन प्रदान करता वर्णनपैटर्न।

वहाँ अन्य तकनीक है जो रासायनिक deamination के माध्यम से सोडियम bisulfide द्वारा uracil को unmethylated साइटोसिन के रूपांतरण के आधार पर कर रहे हैं, और एक एकल nucleotide संकल्प पर डीएनए मेथिलिकरण का एक और अधिक व्यापक कवरेज प्रदान करते हैं। आमतौर पर bisulfide रूपांतरण के बाद, डीएनए लक्ष्य आधारित प्रयोगों के लिए या अनुक्रमण bisulfide पूरे जीनोम बन्दूक (बी एस-सेक) द्वारा pyrosequencing का उपयोग कर अनुक्रम है। इन तकनीकों में तकनीक यहाँ MBDCap-सेक के रूप में वर्णित केवल सबसे 100 बीपी अप करने के एक प्रस्ताव पर प्राप्त कर सकते हैं की सीमा को संबोधित। हालांकि, के बावजूद इन तरीकों अधिक व्यापक किया जा रहा है, वे अपेक्षाकृत महंगे हैं और तेजी से वृद्धि कर सकते हैं अनुक्रमण की गहराई या रोगियों की संख्या के रूप में लागत बढ़ जाती है। दूसरी ओर, आमतौर पर इस्तेमाल bisulfide माइक्रोएरे प्लेटफार्मों लागत प्रभावी रहे हैं, लेकिन जांच के पूरे जीनोम जीन प्रमोटरों के बजाय करने के लिए करीब क्षेत्रों की जांच के साथ अपेक्षाकृत कम कवरेज प्रदान करते हैं। MBDCap-सेक हालांकि, प्रदान करता हैइन उच्च लागत अनुक्रमण तकनीक और कम लागत वाली मेथिलिकरण सरणियों 16 के बीच एक संतुलन। हम इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर रहे हैं रोगी साथियों की एक बड़ी संख्या में डीएनए मेथिलिकरण, कर्क Methylome प्रणाली परियोजना 10 के एक भाग के रूप में जांच करने के लिए और भविष्य के बड़े रोगी साथियों को शामिल अध्ययन में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

इस प्रोटोकॉल सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में डॉ टिम हुआंग और डॉ विक्टर जिन की प्रयोगशालाओं में विकसित की है।

Acknowledgments

काम CPRIT अनुसंधान प्रशिक्षण पुरस्कार RP140105 द्वारा समर्थित है, साथ ही आंशिक रूप के रूप में अमेरिका के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) अनुदान R01 GM114142 द्वारा और विलियम और एला ओवेन्स मेडिकल रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Methylminer DNA enrichment Kit Invitrogen ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen 112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device diagenode B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2 Sigma S7899 100 mL
SPRIworks Fragment Library System I Beckman Coulter A50100 Fully automated library construction system
Adapter Primers Bioo Scientific 514104 PCR primer mix
Qubit Invitrogen Q32854 Fluorometric Quantitation System
PCR master mix KAPA scientific KK2621 PCR master mix
AMPure XP Beckman Coulter A63881 PCR Purification beads
EB Buffer Qiagen 19086
HiSeq 2000 Sequencing System Illumina

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References

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आनुवंशिकी अंक 116 डीएनए मेथिलिकरण अनुक्रमण एमबीडी-सेक जैव सूचना विज्ञान अंतर मेथिलिकरण Epigenetics।
मरीज के ऊतकों के लिए मिथाइल बाध्यकारी डीएनए अनुक्रमण कब्जा
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Jadhav, R. R., Wang, Y. V., Hsu, Y.… More

Jadhav, R. R., Wang, Y. V., Hsu, Y. T., Liu, J., Garcia, D., Lai, Z., Huang, T. H. M., Jin, V. X. Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues. J. Vis. Exp. (116), e54131, doi:10.3791/54131 (2016).

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