Summary
ここでは、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-seqのかMBD-seqの）技術とその後のバイオインフォマティクス解析パイプラインを使用して大規模な臨床患者スクリーニング研究におけるゲノムワイドDNAメチル化を調査するためのプロトコルを提示します。
Abstract
メチル化は、異なる組織型の安定的発展と分化に必要な遺伝子の正確な制御を担当してDNAに不可欠なエピジェネティック修飾の一つです。このプロセスの調節不全は、多くの場合、癌のような種々の疾患の特徴です。ここでは、最近の配列決定技術、メチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）のいずれかを概説し、大規模患者コホートのための種々の正常および疾患組織中のメチル化を定量化するために使用されます。私たちは、最適な定量化を達成するために、バイオインフォマティクスパイプラインに沿って、この親和性富化アプローチの詳細なプロトコルを記述します。この技術は千methylomeプロジェクト（がんMethylomeシステム）の一環として、様々な癌タイプにわたって数百人の患者を配列決定するために使用されてきました。
Introduction
DNAメチル化を介して、遺伝子のエピジェネティックな調節は、本体1内の異なる組織型の安定した分化によって細胞運命を決定するために必要不可欠な機構の1つです。このプロセスの調節不全は、癌2を含む様々な疾患を引き起こすことが知られています。
このプロセスは、主にDNA 3のCpGジヌクレオチド中のシトシン残基のメチル基の付加を含みます。現在、多くの研究2-8に概説したように、それぞれが独自の利点を有し、このメカニズムを調査するために使用されるいくつかの異なる技術があります。ここでは、我々は、DNAのメチル化領域を同定するために、親和性濃縮技術を使用してメチルDNA結合キャプチャシーケンシング（MBDCap-SEQ）と呼ばれるこれらの技術のいずれかを説明します。この技術は、メチル化CpG部位を含むゲノムDNA断片を濃縮するMBD2タンパク質のメチル結合能力の上に構築します。私たちは、商業メチル化DNA濃縮キットを利用しますこれらのメチル化領域を単離するため。私たちの研究室では、この技術を用いて患者サンプルの数百人をスクリーニングしており、ここでは大規模な患者コホートを調査するために使用することができる総合的な最適化されたプロトコルを、提供します。
任意の次世代シーケンシング技術で明らかなように、MBDCap-seqのも、正確にサンプル全体にメチル化のレベルを定量するために、特定のバイオインフォマティクスのアプローチが必要です。配列決定データ9、10の正規化と分析プロセスを最適化するために多くの最近の研究がなされています。 LONUT - - 患者多数のサンプルを横切って、公正な比較を可能にするために、各サンプルの線形正規化に続いて、このプロトコルでは、我々は、一意のリードリカバリ手法を実装するこれらの方法のいずれかを示します。
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Protocol
全ての組織は、治験審査委員会の委員会の承認後に得られ、すべての参加者は、分子分析やフォローアップ調査の両方に同意したとき。プロトコルは、サンアントニオにあるテキサス大学健康科学センターで人間学委員会によって承認されています。
1.メチルDNA結合キャプチャ（MBDCap）
- サンプル採取およびDNA単離
- 患者のパラフィン包埋組織試料からバルク腫瘍または正常組織サンプルを収集します。
- 製造業者のプロトコルに従って、パラフィン包埋組織サンプルからゲノムDNAを単離するための市販のDNAミニキットを使用します。
- 製造業者のプロトコルに従って、ここで説明する手順でメチル化DNA濃縮キットを使用してください。
- 最初のビーズ洗浄
注：ビーズは、ゲノムにDNAのメチル化を検出MBDビオチンタンパク質と結合するために使用されます。ビーズは、通常は中断されます原液インチこの液体を洗い流すためにこれらのステップを使用してください。- 優しく均一な懸濁液を得るために、ピペッティングにより（ 材料表を参照してください）ストレプトアビジンビーズのストックを再懸濁します。ボルテックスによってビーズを混在させないでください。
- 入力DNAの1μgのために、1×バインド/洗浄緩衝液の90μLとチューブにビーズのADD10μL。 1分間回転させます。ボルテックスで混合しないでください。
- 1分間磁気ラック上にチューブ（複数可）を配置します。
- ピペットを用いて液体を除去し、液体を捨てます。
- ビーズに1×バインド/洗浄緩衝液250μLを加え、1分間回転させます。
- 二回1.2.5 - を繰り返して、1.2.3を繰り返します。
- ビーズにMBDビオチンタンパク質を結合します
- 入力DNAの1.2μgのために、各チューブにMBDビオチンタンパク質の7μL（3.5μgの）を追加します。
- 100μLの最終容量を作るためにタンパク質に1×バインド/洗浄緩衝液93μLを追加します。
- ビーズタンパク質を混ぜます1時間室温で回転ミキサーで混合。
- 断片化したDNA（入力）
- TE緩衝液96μL、24μL5倍のバインド/洗浄緩衝液中で全ゲノムDNAの1.2μgのを追加することにより、超音波処理したDNAを120μL溶液を作製します。 25回 - 30の電源のONと超音波処理の間に30の電源OFF、20を使用してください。
- 製造業者のプロトコルに従って350 BP - 150の範囲にあることが断片の大きさを確認するために市販の高感度DNAキットバイオアナライザーシステムを用いて超音波処理したDNA溶液1μlを実行します。
- MBD-ビーズを洗浄
- 1分間磁気ラック上MBD-ビーズを含むチューブを置きます。
- ビーズに触れずにピペットで液体を除去し、廃棄します。
- 1×バインド/洗浄緩衝液250μLでビーズを再懸濁します。
- 5分間室温で回転ミキサー上でビーズを混ぜます。
- 二回1.5.4 - を繰り返して、1.5.1を繰り返します。
- 断片化DNA捕捉反応（1μgのインプットDNA）
- MBD-ビーズを含むチューブにDNA /バッファー混合物を転送します。
- 室温で1時間、回転ミキサー上でDNAとMBD-ビーズを混ぜます。また、4 O℃でO / Nを混ぜます
- ビーズからの非捕捉されたDNAを削除します
- DNAとMBD-ビーズを混合した後、管の内壁にビーズのすべてを集中するために1分間磁気ラック上にチューブを置きます。
- ピペットを用いて上澄み液を取り出して、非メチル化DNAのようなきれいなDNアーゼフリーのマイクロ遠心チューブに保存します。氷の上でこのサンプルを保管してください。
- ビーズを洗浄したビーズに1×バインド/洗浄緩衝液の200μLを追加します。
- 3分間回転ミキサー上でビーズを混ぜます。
- 1分間磁気ラック上にチューブを置きます。
- ピペットを用いて液体を除去し、マイクロチューブに保存します。
- キャップのための合計で2以上の洗浄画分のために1.7.6 - インプットDNAの≤1μgののチャ反応、リピートは1.7.3を繰り返します。
- 単一の画分の溶出
- 高塩緩衝液の低塩緩衝液ミックス（1：1）を溶出バッファー（千のNaCl）を取得します。
- 溶出バッファー（千のNaCl）の200μLでビーズを再懸濁します。
- 3分間回転ミキサー上でビーズをインキュベートします。
- 1分間磁気ラック上にチューブを置きます。
- 磁気ラック上の所定の位置にチューブを、ピペットチップでビーズに触れることなくピペットで液体を除去し、清潔なDNアーゼフリーの1.5 mLのマイクロ遠心チューブに保存します。氷の上でこのサンプルを保管してください。
- （総容量は400μLになります）、同じチューブ内で第二のサンプルを収集し、一度1.8.4 - を繰り返して、1.8.1を繰り返します。氷上でプールされたサンプルを保管してください。
- エタノール沈殿（DNAのクリーンアップ）
- 各noncaptured、洗浄、および溶出画分FRに前のステップオム、1μLのグリコーゲンを追加（20μgの/μL、キットに含まれる）、3M酢酸ナトリウムの1/10サンプル量、pHが5.2（サンプルの400μLあたり例えば 、40μL）と100％の2試料体積エタノール（ 例えば 、400あたり800μLのサンプルμL）。総容量は1241μLです。
- 十分に混合し、少なくとも2時間、-80 O Cでインキュベートします。
- 4 O℃で11363×gで15分間チューブを遠心
- ペレットを乱さないように注意し、上清を捨てます。
- 冷70％エタノール500μLを追加します。
- 4 O℃で11363×gで5分間遠心操作を
- ペレットを乱さないように注意し、上清を捨てます。
- 一度1.9.7および任意の残留する上清を除去 - 、手順1.9.6を繰り返します。
- 約5分間のペレットを空気が乾燥します。完全にペレットを乾燥させないでください。
- DNアーゼを含まない水または他の37.5μLでDNAペレットを再懸濁バッファの適切な量。
- 氷の上にDNAを配置したり、さらに使用するまで-20 O Cで以下のDNAを保存します。
- （ 例えば 、蛍光定量システムを使用し、 材料表を参照）、DNAの合計量が20 ngの上にあることを確認してください。
2.シーケンシング
- 配列決定のためにMBDCap手順から回収したDNA断片を使用してください。各サンプルは、配列決定されるためには、20の合計 - 40 ngのDNAは、ライブラリの準備のために必要とされます。
- DNA-seqのライブラリーの調製のために完全に自動化されたライブラリー構築システムを使用（ 材料表を参照）、製造業者によって供給される標準的なプロトコルに従ってください。ライブラリーを調製するための400bp - サイズ200のDNA断片を選択します。自動化ライブラリ作成システムは、ライブラリーの調製手順を標準化し、マニュアル作成のために、サンプル全体の変動を最小限に抑えることができます。
- アダプターの素数を使用しますRSとは、100倍の濃度に希釈します。このうち、各サンプルについて10μLを使用します。
- ステップ2.2に続いて、反応を取り出し、および蛍光定量システムを（ 材料表を参照）を使用して、DNA-seqのライブラリーを定量化します。
- PCR増幅手順を設定します。 PCRマスターミックスの選択は、ゲノムのGC富化領域のPCR効率を改善することです。 PCRチューブでは、15μLのDNA-seqのライブラリを追加し、25μLのPCRマスターミックス（ 材料表を参照）、2μLのPCRプライマーミックス（ 材料表を参照）、および8μLH 2 O
- 出発物質が異なるためにサイクリング時間および温度を変化させること、PCRマスターミックスの製造業者からのPCR勧告に従ってください：15秒98°Cのの98°Cの 45秒間、Xサイクル、65°Cの 30秒間、72°Cの 30のためにS、および1分間、次いで72 入出力 C。 4 O℃でホールド
- PERF（ - 10サイクル8）ライブラリーDNAの10 nMの - 2で終わるために十分なサイクルをORM。
- 製造業者のプロトコルに従ってPCR精製ビーズの1の比率（ 材料表を参照してください）：1を用いたPCR反応をクリーンアップします。
- 30μLの溶出緩衝液 - 20で溶出します。
- バーコード各サンプルとプール4サンプル一緒にフローセルの1レーンへ。 （ 材料表を参照してください）配列決定のための標準的な50塩基対の単一の読み取りプロトコルを使用してください。
3.バイオインフォマティクス解析
注：配列決定から得られたさらなるプロセス生FASTQファイルは、品質管理を実行し、ゲノムへの短いDNA配列（読み取り）マッピングします。
- 使用ボウタイショートリード・アライナ、各サンプルFASTQファイルにゲノムマッピングツールは、参照ゲノムに読み込むマップします。多くのリードマッピングツールは、このステップを実行するために利用可能であり、個人の好みに基づいて使用することができます。
- whol 2のミスマッチまで許可参照ゲノムにマッピングしながら電子を読み込みます。各読み取りのための20の最良のアラインメントまで報告してください。例えば、ボウタイ-v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>を使用します。
- 多重マッピングされた濃縮された領域の検出を改善するために読み取る回復するLONUT 9を使用してください。それは上記と呼ばれるピークのいずれかに十分接近しているときに、各読み取りの場合は、最大1つのアライメントが回収されることになります。たとえば、次のコマンドを使用します。perlのlonut.pl -g hg19 250 -p 99 -w <alignFile> <outputPath>。 LONUTは、次の手順を実行します。
- 分割アラインメントは、一意に読み込んでマッピングされ、多重読み込みマッピングされました。一意にマッピングされた上でコールピークがピーク呼び出し側ベルト11を使用して読み込みます。例コマンドで250と-p 99 -wオプションは、ベルトのためのものです。
- 結合一意回収LONUTから得られ、合わせた読み取り読み取りで読み取りマッピングされ、床形式で、さらなる分析に使用されます。 COMBINの数を計算しますedは、将来の標準化のために読み込みます。
- ビン読み込みます。抽出物は、perlのスクリプトを使用して、関心領域に読み込みます。perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <上流延びる長さ> -dn <下流延びる長さ>。 sampleInfoFileに記載されている各ベッドのファイルについては、perlスクリプトは、以下のタスクを実行します。
注：perlスクリプトのための補助的な符号化ファイルを参照してください。- ビンは、24染色体のために、固定されたビンサイズ、 例えば 、100bpの中に読み取ります。
- refGeneFileで指定された各遺伝子について、オプション-upと-dnによって指定延びる長さまで、転写開始部位（TSS）の周りのビンを抽出します。例えば、アップとダウンストリームTSSの4キロバイトである領域のデータを抽出します。ビンのサイズは100bpで、このデータは81ビンを有する抽出し、中央ビンがTSSに対応します。
- アンチセンス鎖上の遺伝子については、上流のビンは常にナンプラーであるように、左から右に抽出された領域を反転perlスクリプトを使用して左側のをced。
- 2キロバイトの上流には、左、上流の4キロバイト;：さらに三つのサブ領域にTSS±4キロバイトの領域を分割中東、アップとダウンストリーム2キロバイト。 4キロバイトの権利、下流2キロバイト
- 各サンプルについて、のカウントは3.3.3で計算された読み取りマッピングされた組み合わせの総数で各ビンに読み込む分けます。正規化は、サンプルの特定の読み取り違いを解消し、異なる試料全体に読み込みを比較することができます。
- 左領域から得られた読み取り正規化された上で統計的検定を行うために（スクリプトファイルに示されているように）腹部のように説明した地域では、通常とケース群との間の差動メチル化を検出するために、bashスクリプトを実行します。
注：bashスクリプトのための補助的な符号化ファイルを参照してください。差別的メチル化されている領域に基づいて、7の組み合わせがあります。
全領域：TSS±4キロバイトの地域全体の差動メチル化
MiddleLeft：真ん中と左の両方の領域における差動メチル化
MiddleRight：ミドルと右の両方の領域での差動メチル化
フランク：左右の領域の両方の差動メチル化
左：左領域における差動メチル化のみ
右：右側領域における差動メチル化のみ
ミドル：中間領域における差動メチル化のみ - 竜巻プロットの差動メチル化を可視化するために、同じbashスクリプトを使用してください。別々のパネルにハイパーとハイポメチル化遺伝子をプロットし、それぞれ、3.4で説明したように、領域の組み合わせの順番に並べ替えます。
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Representative Results
私たちは、とりわけ、乳房12、子宮内膜13、前立腺14、および肝臓癌を含む多様な癌の型から多数の患者におけるDNAメチル化の変化を研究するためにMBDCap-seqのを使用しました。ここでは、最近12公開された乳癌の研究からいくつかの情報を示しています。この例では、示差異なるゲノム領域にわたって法線に対して腫瘍においてメチル化されたCpGアイランドを同定するための全ゲノム配列決定アプローチを用いました。調査は、合計のうち、遺伝子プロモーター（N = 13081）に位置するCpGアイランドを調査19.5％が通常に比べて腫瘍で差動メチル化を示したことを明らかにしました。同様に、6959遺伝子内のCpGアイランドのうち55.2％が、差動メチル化を示しました。遺伝子間のプロモーターは5454調査した領域の1.8％は、差動DNAメチル化（ 図1A）を示し、CpGアイランドずに4847の28.1％を示し、遺伝子プロモーターのため。視覚表示（ 図1B）は 、上述の領域の代表的な例を示しています。ヒートマップは、明らかに77乳房腫瘍、10乳房の正常組織、および38の乳癌細胞株を横切っメチル化領域を示しています。この原稿で詳述バイオインフォマティクスプロトコルで説明したようにメチル化の定量化は、全体の集団または亜集団における有意なメチル化の差異を識別するために、これらの患者の試料の様々な統計的検定を実行することを可能にしています。この分析手法は、さらに、これらの患者のサンプル中のエピジェネティックなメカニズムを調査するためにテスト可能なターゲットを提供してくれます。これらのターゲットが識別されると、メチル化のレベルをさらに定量化し、パイロシーケンシングを使用して検証することができます。ターゲットのための200 bpの - MBDCap-seqのは、約100のゲノム解像度を提供します。さらに解像度を得るために、これらの領域内の個々のCpG位置は、定量化をパイロシーケンシングのために選択することができます。私たちは、泉にこのアプローチを使用しますtifyは、より高い分解能で、個々の患者群間の比較のためにMBDCap-seqのデータで観察されたメチル化の違いを検証します。サブグループ2は 2子宮体癌におけるメチル化の定量化を示す図非反復（NR）再発（R）と比較します。図は、同定された標的遺伝子SFRP1のプロモーターCpGアイランド内の異なるCpG部位での2グループ内の各患者のDNAメチル化のレベルを示しています。
図1： プロモーターと非プロモーター CpG アイランド における正常な乳房組織に対する乳癌試料における DNA メチル化は、メチル捕獲配列（MBD-SEQ）は、乳房腫瘍のゲノムのDNAメチル化プロファイルを生成するために用いた（n = 77）としました。正常乳房組織（N = 10）（A）パイ電子チャートは、差動プロモーター、遺伝子内でのメチル化、および遺伝子間のCGIならびに非CGIのプロモーター領域を示しています。（B）の例は、プロモーターCGI、遺伝子内、遺伝子間、および非CGIのプロモーター領域を示す遺伝子座。破線の四角は、乳癌の高メチル化に対応する領域を強調表示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2： 同定された標的遺伝子中の CpG 部位 のピロシーケンスを使用して、DNAメチルピロシーケンスによって検出され、再発および非再発性の子宮内膜癌患者におけるSFRP 5プロモーター領域のDNAメチル化の定量化 。各サイトは1 CpG部位を表す（R：再発を、N = 21、NR：非再発、N = 71）。プロットは表示します平均値とエラーバーは、平均やSEMの標準誤差を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
MBDCap-seqの技術は、患者15に多数のコホートを調査する際に、コスト効果の高い代替として考え親和性富化アプローチ3、です。ここで紹介するパイプラインは、データ分析と解釈にサンプル調達から包括的アプローチを説明します。最も重要なステップの一つは、DNAのメチル化が起こる場合、これはそのままゲノム中のGC富化領域のPCR効率を改善するために、PCR増幅手順を設定します。また、配列決定した後、各サンプルを一意にマッピングされ、少なくとも2000万人以上がゲノムに読み込みがあることを確認することが不可欠です。このカバレッジは、全ゲノム12をマッピングするのに十分な濃縮または配列深さを提供することが期待されます。この報道が一部からそのサンプルの特定のサンプルのための配列決定の最初のラウンドと複数のDNA中に満たされていない場合は1が利用可能である、第二部におけるシーケンシングの別のラウンドを実行することができます。その結果得られは、rとマージすることができます読み取りますカバレッジを達成するための最初のラウンドからEADS。全体的な実験は、コピー数の変化15のような要因に基づいてバイアスを説明するためにいくつかの生物学的なコントロール（ 例えば、正常組織）を含むように設計されるべきです。
患者の試料で観察されたDNAメチル化を調査する当社のバイオインフォマティクスのアプローチは、コアプロモーターの差動メチル化濃縮、プロモーターの海岸領域およびこれらのも様々な組み合わせを表示可能なターゲット遺伝子を提供します。 MBDCap-seqが最大でダウンのみの100bpまでの解像度に到達することができ、プロトコールに記載されているように、コアと海岸へのこれらの領域の区別がの調節的役割のさらなる調査のための潜在的な標的領域を同定することを可能にするという事実にもかかわらず、メチル化濃縮度を差分し、今後のメカニズムの研究を行います。ここで我々はまた、差動濃縮の概要を提供する、竜巻プロットを使用して、これらの識別された領域を可視化する方法について説明しますパターン。
そこ脱アミノ化を介して重亜硫酸ナトリウムによってウラシルへの非メチル化シトシンの化学変換に基づいている他の技術があり、単一ヌクレオチド解像度でDNAメチル化のより包括的なカバレッジを提供します。通常、二硫化変換後、DNAをターゲットベースの実験のためまたは配列決定硫化全ゲノムショットガン（BS-SEQ）によって、パイロシーケンシングを用いて配列決定されます。これらの技術は、わずか100塩基対までのほとんどの解像度で達成することができますMBDCap-seqのようにここに記載されている技術の制限に対処します。しかしながら、これらのアプローチは、より包括的であるにもかかわらず、それらは比較的高価であり、配列決定の深さや患者の数が増加するにつれて指数関数的にコストを増加させることができます。一方、一般的に使用される硫化マイクロアレイプラットフォームは、コスト効果的であるが、プローブは、遺伝子のプロモーターではなく、ゲノム全体に近い領域を調査すると、比較的低いカバレッジを提供します。 MBDCap-seqのが、提供これらの高コストの配列決定技術と低コストのメチル化アレイ16との間のバランス。我々は、癌Methylome Systemプロジェクト10の一部として、患者集団の大多数におけるDNAメチル化を調査するために、このプロトコルを使用して、大規模な患者集団を含む将来の研究に使用することができます。
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Disclosures
このプロトコルは、サンアントニオのテキサス健康科学センターの大学の博士ティム・黄博士ビクタージンの研究室で開発されています。
Acknowledgments
作業はCPRIT研究研修賞RP140105でサポートされているだけでなく、部分的にR01 GM114142を許可し、ウィリアム＆エラ・オーエンス医学研究財団（NIH）米国国立衛生研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
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