Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att undersöka genomet bred DNA-metylering i storskaliga kliniska patientscreeningstudier med hjälp av metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter eller MBD-punkter) teknik och efterföljande bioinformatik analys pipeline.
Abstract
Metylering är en av de väsentliga epigenetiska modifieringar av DNA, som är ansvarig för den exakta regleringen av gener som krävs för stabil utveckling och differentiering av olika vävnadstyper. Dysreglering av denna process är ofta kännetecknande för olika sjukdomar som cancer. Här, vi beskriva en av de senaste sekvenseringstekniker, metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), som används för att kvantifiera metylering i olika normala och sjukdoms vävnader för stora patientgrupper. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för denna affinitetsanrikning tillvägagångssätt tillsammans med en bioinformatik pipeline för att uppnå optimal kvantifiering. Denna teknik har använts för att sekvensera hundratals patienter inom olika cancertyper som en del av den 1000 methylome projektet (Cancer Methylome System).
Introduction
Epigenetisk reglering av gener genom DNA-metylering är en av de väsentliga mekanismer som krävs för att bestämma cell öde genom stabil differentiering av olika vävnadstyper i kroppen 1. Dysreglering av denna process har varit kända för att orsaka olika sjukdomar inklusive cancer 2.
Denna process innebär främst tillsättning av metylgrupper på cytosin rester i CpG-dinukleotider i DNA 3. Det finns några olika tekniker som för närvarande används för att undersöka denna mekanism, var och en har sina egna fördelar som beskrivs i många studier 2-8. Här kommer vi att diskutera en av dessa tekniker kallas metyl-bindande DNA-Capture-sekvensering (MBDCap-punkter), där vi använder en affinitetsanrikning teknik för att identifiera denaturerad regioner av DNA. Denna teknik bygger på metyl-bindningsförmågan hos MBD2-proteinet för att anrika de genomiska DNA-fragment innehållande metylerade CpG platser. Vi använder en kommersiell metylerat DNA anrikning kitför isolering av dessa metylerade regioner. Vårt laboratorium har screening hundratals patientprover med denna teknik och här erbjuder vi en omfattande optimerat protokoll, som kan användas för att undersöka stora patientgrupper.
Som framgår med någon nästa generations sekvenseringsteknologi, MBDCap-punkter kräver också en specifika bioinformatik strategi för att exakt kvantifiera nivåerna av metylering över proven. Det har varit många nya studier i ett försök att optimera normalisering och analysprocessen av de sekvensdata 9, 10. I detta protokoll visar vi en av dessa metoder som genomför en unik läsning återhämtning strategi - LONUT - följt av linjär normalisering av varje prov för att möjliggöra objektiva jämförelser mellan stort antal patientprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla vävnader erhålls efter godkännande av Institutional Review Board kommitté och när alla deltagare samtyckt till både molekylära analyser och uppföljningsstudier. Protokollen är godkända av Human Studies kommittén vid University of Texas Health Science Center i San Antonio.
1. Metyl-bindande DNA Capture (MBDCap)
- Provsamling och DNA-isolering
- Samla bulk tumör eller normala vävnadsprover från patienter paraffininbäddade vävnadsprover.
- Använda ett kommersiellt DNA-mini-kit för att isolera genomiskt DNA från paraffininbäddade vävnadsprover enligt tillverkarens protokoll.
- Använd en metylerad DNA anrikning kit med det förfarande som beskrivs här enligt tillverkarens protokoll.
- Initial bead wash
Notera: Pärlorna används för att par med MBD-biotin-proteinet, som känner av DNA-metylering på genomet. Pärlor är vanligen upphängdai en stamlösning. Använd dessa steg för att tvätta bort denna vätska.- Resuspendera beståndet av streptavidin pärlor (se Material tabell) genom att försiktigt pipettera upp och ned för att erhålla en homogen suspension. Blanda inte pärlor genom att vortexa.
- För en jig för ingående DNA, add10 mikroliter av pärlor till ett rör med 90 mikroliter av 1x Bind / tvättbuffert. Rotera under 1 min. Blanda inte genom att vortexa.
- Placera röret (s) på en magnetställning under 1 min.
- Avlägsna vätskan med en pipett och kassera vätskan.
- Tillsätt 250 | il av 1x Bind / tvättbuffert till pärlorna och rotera under 1 min.
- Upprepa steg 1.2.3 - 1.2.5 två gånger.
- Koppling av MBD-Biotin protein till pärlorna
- För 1,2 mikrogram av ingångs DNA, tillsätt 7 mikroliter (3,5 mikrogram) av MBD-Biotin protein till varje rör.
- Lägga 93 mikroliter av 1x Bind / tvättbuffert till proteinet för att göra en slutlig volym av 100 mikroliter.
- Blanda pärlorna-proteinetblandningen på en roterande bländare vid RT under 1 h.
- Fragmenterat DNA (ingång)
- Sonikera DNA genom tillsats av 1,2 | j, g av totalt genomiskt DNA i 96 | il TE-buffert och 24 | il av 5x Bind / tvättbuffert för att göra en 120 mikroliter lösning. Använd 30 s strömmen och 30 s strömmen under ultraljudsbehandling, 20 - 25 gånger.
- Köra 1 mikroliter av sonikerad DNA-lösningen med användning av en Bioanalyzer system med en kommersiell hög känslighet DNA kit för att kontrollera storleken av fragmenten för att vara i intervallet från 150 till 350 bp enligt tillverkarens protokoll.
- Tvätta MBD-pärlor
- Placera röret innehållande MBD-pärlor på en magnetställning under 1 min.
- Ta bort och kasta vätskan med en pipett utan att röra kulorna.
- Resuspendera kulorna med 250 mikroliter av 1x Bind / tvättbuffert.
- Blanda pärlorna på en roterande bländare vid RT i 5 min.
- Upprepa steg 1.5.1 - 1.5.4 två gånger.
- Fragmenterat DNA infångnings reaktion (1 | j, g input DNA)
- Överför DNA / buffertblandning till röret med MBD-pärlor.
- Blanda MBD-pärlor med DNA på en roterande bländare under 1 h vid RT. Alternativt, blanda O / N vid 4 ° C
- Ta bort icke-fångade DNA från Pärlor
- Efter blandning av DNA och MBD-pärlor, placera röret på den magnetiska rack för 1 min för att koncentrera all av pärlorna på den inre väggen av röret.
- Avlägsna supernatanten med en pipett och spara den i en ren DNas-fritt mikrocentrifugrör som ometylerad DNA. Lagra detta prov på is.
- Tillsätt 200 | il av 1x Bind / tvättbuffert till pärlorna för att tvätta pärlorna.
- Blanda pärlorna på en roterande bländare under 3 min.
- Placera röret på den magnetiska rack för en min.
- Avlägsna vätskan med en pipett och spara den i ett mikrocentrifugrör.
- för capture reaktioner av ≤1 xg input DNA, upprepa steg 1.7.3 - 1.7.6 för ytterligare 2 tvättfraktionerna totalt.
- Enda fraktionen eluering
- Blanda svag saltbuffert med buffert med hög salthalt (1: 1) för att få elueringsbuffert (1000 mM NaCl).
- Resuspendera kulorna i 200 mikroliter av elueringsbuffert (1000 mM NaCl).
- Inkubera pärlor på en roterande bländare under 3 min.
- Placera röret på den magnetiska rack för en min.
- Med röret på plats på den magnetiska rack, ta bort vätskan med en pipett utan att röra kulorna med pipettspetsen, och spara den i en ren DNas-fri 1,5 ml mikrocentrifugrör. Lagra detta prov på is.
- Upprepa steg 1.8.1 - 1.8.4 gång, samla det andra provet i samma rör (total volym kommer att vara 400 | il). Förvara den poolade provet på is.
- Etanolutfällning (DNA cleanup)
- Till varje noncaptured, tvätt, och elueringsfraktionen frOm föregående steg, tillsätt 1 pl glykogen (20 mikrogram / mikroliter, som ingår i kit), 1/10 provvolym av 3M natriumacetat, pH 5,2 (t.ex. 40 mikroliter per 400 mikroliter prov) och 2 provvolymer av 100% etanol (t.ex., 800 mikroliter per 400 mikroliter av provet). Den totala volymen är 1,241 mikroliter.
- Blanda väl och inkubera vid -80 ° C under minst 2 h.
- Centrifugera röret i 15 min vid 11363 xg vid 4 ° C.
- Noggrant kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Tillsätt 500 | il kall 70% etanol.
- Centrifugera röret under 5 minuter vid 11.363 xg vid 4 ° C.
- Noggrant kassera supernatanten utan att störa pelleten.
- Upprepa steg 1.9.6 - 1.9.7 gång och ta bort eventuella kvarvarande supernatanten.
- Lufttorka pelleten för ~ 5 min. Har inte helt torka pelleten.
- Resuspendera DNA-pelleten i 37,5 mikroliter av DNas-fritt vatten eller annanlämplig volym buffert.
- Placera DNA på is eller förvara DNA vid -20 ° C eller lägre tills vidare användning.
- Kontrollera att den totala mängden DNA är över 20 ng (t ex använda fluorometrisk kvantifiering systemet, se Material tabell).
2. Sekvensering
- Använda DNA-fragmenten som återvunnits från MBDCap förfarande för sekvensering. För varje prov som skall sekvenseras, en total mängd av 20 - krävs 40 ng DNA för biblioteket förberedelse.
- För DNA-SEKV bibliotek beredning använder ett helt automatiserat bibliotekskonstruktionssystem (se Material tabell) och följer standardprotokollet som tillhandahålls av tillverkaren. Välj DNA-fragment av storleken 200-400 bp för biblioteks beredning. Automations bibliotek förberedelse systemet tillåter att standardisera framställningsförfarandet bibliotek och minimera variationen mellan proverna på grund av manuell beredning.
- Använd adapter primers och späd till 100x koncentration. Av detta använder 10 mikroliter för varje prov.
- Efter steg 2,2, ta ut reaktionen, och kvantifiera DNA-punkter bibliotek med användning av en fluorometrisk kvantifiering systemet (se Material tabell).
- Inrättat PCR-amplifiering förfarande. Valet av PCR-huvudblandning är att förbättra PCR-effektiviteten i GC berikad regionen av genomet. I en PCR-rör, tillsätt 15 mikroliter DNA-punkter bibliotek, 25 mikroliter PCR Master Mix (se Material tabell), 2 mikroliter PCR-primer mix (se Material tabell), och 8 mikroliter H2O
- Följ PCR rekommendation från tillverkaren av PCR Master Mix, ändra cykeltider och temperaturer för olika utgångsmaterial: 98 ° C under 45 s, X cykler av 98 ° C under 15 s, 65 ° C under 30 s, 72 ° C i 30 s, och sedan 72 ° C under 1 min. Håll vid 4 ° C
- PerfektOrm tillräckligt cykler att sluta med 2-10 nM av biblioteks-DNA (8 - 10 cykler).
- Städa upp PCR-reaktion med förhållandet 1: 1 av PCR-renings pärlor enligt tillverkarens protokoll (se Material tabell).
- Eluera med 20 - 30 mikroliter elueringsbuffert.
- Barcode varje prov och pool 4 prov ihop till ett körfält av en flödescell. Använd standard 50 bp enda läsning protokoll för sekvensering (se Material tabell).
3. Bioinformatics Analys
Obs: Ytterligare processrå fastq filer som erhållits från sekvensering för att utföra kvalitetskontroll och kartlägga de korta DNA-sekvenser (läser) till genomet.
- Använd Bowtie kort läsning Aligner, genomet kartverktyg på varje prov fastq fil för att kartlägga läser referens genomet. Många läs kartläggning verktyg finns tillgängliga för att utföra detta steg och kan användas baserat på individuella önskemål.
- Tillåt upp till 2 felpassningar i groe läser samtidigt kartlägga referens genomet. Rapportera upp till 20 bästa anpassningar för varje läsning. Använd till exempel bowtie -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 <ebwt> <fastqFile> <alignFile>.
- Använd LONUT 9 för att återvinna den flerfaldigt mappade läser att förbättra upptäckten av de anrikade områdena. För varje läsning, högst en anpassning skulle täckas när det är tillräckligt nära någon av de ovan kallas toppar. Använd till exempel: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 p 99 <alignFile> <outputPath>. LONUT kommer att utföra följande steg.
- Split anpassningar till unikt mappas läser och multiplicera mappas läser. Samtals topp på unikt mappade läser använder topp ringer bandet 11. Alternativet -w 250 och p 99 i exemplet kommandot är för bälte.
- Kombinera unikt mappad läser med den återvunna läsningar erhölls från LONUT, och den kombinerade läser, i BED format, kommer att användas i ytterligare analys. Beräkna antalet CombinEd läser för framtida normalisering.
- Bin den läser. Extrakt läser i regionen av intresse med hjälp av Perl-skript: perl methyPipeline.pl <sampleInfoFile> <refGeneFile> -up <uppströms sträcker längd> -dn <nedströms sträcker längd>. För varje säng fil som anges i sampleInfoFile utför Perl-skript nedan uppgifter.
Obs: Se kompletterande kodning fil för Perl-skript.- Bin den läser in fast bin storlek, till exempel, 100 bp, 24 kromosomer.
- För varje gen som anges i refGeneFile, extrahera lagerplatser runt transkriptionsstartstället (TSS), upp till den utsträckta längden som anges av alternativet -up och -dn. Till exempel, extrahera data i regionen som är uppströms och nedströms 4 kb av TSS. Vid bin storlek 100 bp, extraherades dessa uppgifter har 81 fack, och mitt bin motsvarar TSS.
- För genen på antisenssträngen, vända den extraherade regionen från vänster till höger så att uppströms fack är alltid placed till vänster med perl-skript.
- Vidare dela TSS ± 4 kb regionen i tre underregioner: Vänster, uppströms 4 kb uppströms 2 kb; USA, upp och nedströms 2 kb; Höger, nedströms 2 kb till 4 kb.
- För varje prov, dela räkningen av läser i varje fack med det totala antalet kombinerade avbildas läser beräknas i 3.3.3. Normaliseringen kommer att eliminera provspecifika läsa skillnader och gör det möjligt att jämföra läser mellan olika prover.
- Kör bash script (som anges i skriptfilen) för att utföra statistiska test på den normaliserade läser erhållits från vänster regionen, för att upptäcka differential metylering mellan normal och individgrupp i de regioner som beskrivs som i flanken regionen.
Obs: Se kompletterande kodning filen för bash-manus. Baserat på de regioner som är differentiellt metylerade, finns det sju kombinationer:
Hela regionen: differential metylering hela TSS ± 4 kb region
middleLeft: differential metylering i både mitten och vänster region
MiddleRight: differential metylering i både mitten och höger region
Flank: differential metylering i både vänster och höger region
Vänster: differential metylering i vänster region endast
Höger: differential metylering i rätt region endast
USA: differential metylering i mittområde endast - Använd samma bash skript för att visualisera differential metylering i en tornado tomt. Rita de hyper och hypo metylerade gener på en separat panel, och sortera i storleksordningen regionen kombination som beskrivs i 3.4, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har använt MBDCap-seq för att studera DNA-metylering förändringar i ett stort antal patienter från olika cancertyper inklusive bröst 12, endometrial 13, prostata 14, och levercancer bland andra. Här visar vi lite information från bröstcancer studie som publicerades nyligen 12. I detta fall har vi använt hela genomet sekvense metod för att identifiera CpG-öar som differentiellt metylerade i tumörer med avseende på normal mellan olika genomiska regioner. Undersökningen visade att av totalt undersökta CpG-öar som ligger i genpromotorer (n = 13,081), 19,5% visade differential metylering i tumörer jämfört med normal. På samma sätt, av 6,959 intragenic CpG-öar, 55,2% visade differential metylering. Intergena promotorer visade 28,1% av 4847 och för genpromotorer utan CpG-öar, 1,8% av 5,454 undersökta regioner visade differential DNA-metylering (Figur 1A). En visuell representation(Figur 1B) visar representativa exempel på de regioner som diskuteras ovan. Den heatmap visar tydligt metylerade regioner över 77 brösttumörer, 10 bröst normala vävnader och 38 bröstcancercellinjer. Kvantifieringen av metylering som diskuterats i bioinformatik protokoll beskrivs i detta manuskript, gör det möjligt för oss att utföra olika statistiska test över dessa patientprover för att identifiera betydande metylering skillnader i hela befolkningen eller en subpopulation. Denna analys metod ger oss med testbara mål för att ytterligare undersöka epigenetiska mekanismer i dessa patientprover. När dessa mål identifieras, kan nivåerna av metylering ytterligare kvantifieras och validerats med pyrosekvensering. Den MBDCap-punkter ger en genomisk upplösning på ca 100-200 bp för målen. För att erhålla ytterligare upplösning, kan enskilda CpG platser inom dessa områden väljas för Pyrosequencing kvantifiering. Vi använder denna metod för att Quantifiera och validera metylering skillnader som observerats i de MBDCap-seq data vid en högre upplösning och för jämförelse mellan individuella patientgrupper. Figur 2 visar kvantifiering av metylering i två endometriecancer undergrupper som nonrecurrent (NR) jämfört med återkommande (R). Figuren visar graden av DNA-metylering för varje patient i 2 grupper på olika CpG platser i promotor CpG ön den identifierade målgenen SFRP1.
Figur 1:. DNA hypermetylering i bröstcancerprover i förhållande till normal bröstvävnad i promotor- och icke-promotor CpG-öar Metyl capture sekvensering (MBD-seq) användes för att generera DNA-metylering profiler av genomen för brösttumörer (n = 77) och normal bröstvävnad (n = 10). (A) Pie diagram visar differentiell metylering i promotorn, intragenic, och intergena CGI såväl som icke-CGI promotorregioner. (B) Exempel loci visar promotor CGI, intragenic, intergena och icke-CGI promotorregioner. Streckade rutor markera regioner som motsvarar bröstcancer hypermethylation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kvantifiering av DNA-metylering med hjälp av pyrosekvensering av CpG platser i en identifierad målgen DNA-metylering av SFRP 5 promotorregionen i återkommande och icke-återkommande endometrial karcinom patienter upptäcks av Pyrosequencing.. Varje plats representerar en CpG plats (R: Återkommande, n = 21 och NR: engångs, n = 71). Diagrammen visarmedelvärdet och felstaplar visar standardfelet av medelvärdet eller SEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den MBDCap-punkter teknik är en affinitetsanrikning metod 3, betraktas som ett kostnadseffektivt alternativ vid utredning kohorter med ett stort antal patienter 15. Rörledningen som presenteras här beskriver en övergripande strategi från prov upphandling dataanalys och tolkning. En av de viktigaste stegen är att inrätta en PCR-förstärkning förfarande för att främja PCR effektivitet GC berikade områdena i genomet eftersom det är där DNA-metylering förekommer. Dessutom är det viktigt att se till att efter sekvensering, har varje prov åtminstone mer än 20 miljoner unika mappas läser till genomet. Denna täckning förväntas ge tillräcklig berikning eller sekvens djup att kartlägga hela genomet 12. Om täckningen inte är uppfyllt under den första omgången av sekvensering för ett särskilt prov och mer DNA för det provet från del ett är tillgänglig, kan ytterligare en runda av sekvensering i del två köras. Den resulterande läser kan slås samman med reads från den första omgången för att uppnå täckning. De övergripande experiment bör utformas för att inkludera några biologiska kontroller (t.ex. normal vävnad) för att redogöra för partiskhet baserat på faktorer som kopietal variationer 15.
Vår bioinformatik metod för att undersöka DNA-metylering observerades i patientprover ger möjliga målgener som visar differentiell metylering anrikning i kärnpromotor, promotor kustområden och även olika kombinationer av dessa. Trots att MBDCap-punkter på sin höjd kan nå upplösning ner bara upp till 100 bp, skillnaden av dessa regioner i kärnan och stranden som beskrivs i protokollet gör det möjligt att identifiera potentiella målregioner för vidare utredning av de reglerande roller differential metylering anrikningsgrad och genomföra framtida mekanistiska studier. Här också beskriver vi ett sätt att visualisera dessa identifierade områden med hjälp av tromb tomter, som ger en översikt av differential anrikningmönster.
Det finns andra tekniker som är baserade på kemisk omvandling av ometylerade cytosin till uracil genom natriumbisulfid genom deaminering, och ge en mer omfattande täckning av DNA-metylering vid en enda nukleotid upplösning. Vanligtvis efter bisulfid omvandling är DNA sekvenserades med användning pyrosekvensering för målrelaterade experiment eller genom hela genomet hagelgevär bisulfid sekvensering (BS-punkter). Dessa tekniker itu med begränsning av den teknik som beskrivs här som MBDCap-seq kan endast uppnå på sin höjd en upplösning på upp till 100 bp. Men trots dessa tillvägagångssätt är mer omfattande, de är relativt dyra och kan exponentiellt öka kostnaden som djupet av sekvensering eller antalet patienter ökar. Å andra sidan, som vanligen används bisulfid microarray plattformar är kostnadseffektiva, men ger relativt låg täckning med prober undersöker områden nära genpromotorer snarare än hela genomet. MBDCap-seq ger emellertiden balans mellan dessa höga kostnader sekvenseringstekniker och låga metylering arrayer 16. Vi använder detta protokoll för att undersöka DNA-metylering i ett stort antal patientgrupper, som en del av cancer Methylome System projektet 10 och kan användas i framtida studier med stora patientgrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta protokoll har utvecklats i laboratorier Dr. Tim Huang och Dr. Victor Jin vid University of Texas Health Science Center i San Antonio.
Acknowledgments
Arbetet stöds av CPRIT Research Training Award RP140105, liksom delvis stöd av amerikanska National Institutes of Health (NIH) ger R01 GM114142 och William & Ella Owens Medical Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3 M sodium acetate, pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100 mL |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
References
- Trimarchi, M. P., Mouangsavanh, M., Huang, T. H. Cancer epigenetics: a perspective on the role of DNA methylation in acquired endocrine. Chin. J. Cancer. 30, 749-756 (2011).
- Nair, S. S., et al. Comparison of methyl-DNA immunoprecipitation (MeDIP) and methyl-CpG binding domain (MBD) protein capture for genome-wide DNA methylation analysis reveal CpG sequence coverage bias. Epigenetics. 6, 34-44 (2011).
- Zuo, T., Tycko, B., Liu, T. M., Lin, J. J., Huang, T. H. Methods in DNA methylation profiling. Epigenomics. 1, 331-345 (2009).
- Clark, C., et al. A comparison of the whole genome approach of MeDIP-seq to the targeted approach of the Infinium HumanMethylation450 BeadChip((R)) for methylome profiling. PLoS One. 7, e50233 (2012).
- Walker, D. L., et al. DNA methylation profiling: comparison of genome-wide sequencing methods and the Infinium Human Methylation 450 Bead Chip. Epigenomics. , 1-16 (2015).
- Huang, Y. W., Huang, T. H., Wang, L. S. Profiling DNA methylomes from microarray to genome-scale sequencing. Technol. Cancer Res. Treat. 9, 139-147 (2010).
- Serre, D., Lee, B. H., Ting, A. H. MBD-isolated Genome Sequencing provides a high-throughput and comprehensive survey of DNA methylation in the human genome. Nucleic Acids Res. 38, 391-399 (2010).
- Brinkman, A. B., et al. Whole-genome DNA methylation profiling using MethylCap-seq. Methods. 52, 232-236 (2010).
- Wang, R., et al. LOcating non-unique matched tags (LONUT) to improve the detection of the enriched regions for ChIP-seq data. PLoS One. 8, e67788 (2013).
- Gu, F., et al. CMS: a web-based system for visualization and analysis of genome-wide methylation data of human cancers. PLoS One. 8, e60980 (2013).
- Lan, X., Bonneville, R., Apostolos, J., Wu, W., Jin, V. X. W-ChIPeaks: a comprehensive web application tool for processing ChIP-chip and ChIP-seq data. Bioinformatics. 27, 428-430 (2011).
- Jadhav, R. R., et al. Genome-wide DNA methylation analysis reveals estrogen-mediated epigenetic repression of metallothionein-1 gene cluster in breast cancer. Clin. Epigenetics. 7, 13 (2015).
- Hsu, Y. T., et al. Promoter hypomethylation of EpCAM-regulated bone morphogenetic protein gene family in recurrent endometrial cancer. Clin. Cancer Res. 19, 6272-6285 (2013).
- Wang, Y. V., et al. Roles of Distal and Genic Methylation in the Development of Prostate Tumorigenesis Revealed by Genome-wide DNA Methylation Analysis. Sci. Rep. , (2015).
- Plongthongkum, N., Diep, D. H., Zhang, K. Advances in the profiling of DNA modifications: cytosine methylation and beyond. Nat Rev Gen. 15, 647-661 (2014).
- Riebler, A., et al. BayMeth: improved DNA methylation quantification for affinity capture sequencing data using a flexible Bayesian approach. Genome Biol. 15, R35 (2014).
