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Behavior

수컷 마우스 초음파 발성 (USV) 노래 추출 및 분석

doi: 10.3791/54137 Published: May 9, 2017

Summary

쥐는 초음파 발성 (USVs)의 복잡한 다중 음절 레퍼토리를 생성합니다. 이러한 USV는 신경 정신병 장애의 판독 값으로 널리 사용됩니다. 이 프로토콜은 마우스 노래의 어쿠스틱 기능과 구문을 지속적으로 유도, 수집 및 분석하기 위해 우리가 배웠고 개발 한 몇 가지 사례를 설명합니다.

Abstract

생쥐는 개발과 성인기에 걸쳐 다양한 사회적 맥락에서 초음파 발성 (USV)을 생산합니다. 이러한 USV는 어머니 - 강아지 검색 1 , 청소년 상호 작용 2 , 반대의 동성 상호 작용 3 , 4 , 5 및 영토 상호 작용 6에 사용 됩니다. 수십 년 동안, USV는 신경 정신병과 발달 또는 행동 장애 7 , 8 , 9 를 연구하기 위해 프록시로 사용되었고 최근 척추 동물들 사이에서 음성 통신의 메커니즘과 진화를 이해하기 위해 연구자가 사용 해왔다. 성적 상호 작용 내에서 성숙한 수컷 쥐는 노래 조류 11 의 구애 노래와 유사한 몇 가지 특징을 가진 USV 노래를 만듭니다. 그런 multlyllabic reper의 사용toires는 요소가 조직되고 재결합되는 방식, 즉 구문에서 다양 할 수 있기 때문에 잠재 된 유연성과 정보를 증가시킬 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 신선한 여성의 소변, 마취 된 동물 및 발정 암컷에 대한 노출과 같은 다양한 사회적 맥락에서 수컷 쥐로부터 USV 노래를 유도하는 신뢰할 수있는 방법이 설명됩니다. 여기에는 마우스에서 많은 양의 음절을 유도하는 조건이 포함됩니다. 저렴한 소음기로 주변 소음 기록을 줄이고 USV를 자동으로 탐지, 분류 및 분석 할 수있는 정량화 방법을 제시합니다. 후자에는 콜 레이트, 보컬 레퍼토리, 음향 파라미터 및 구문 평가가 포함됩니다. 특정 노래 유형에 대한 동물의 선호도를 조사하기 위해 재생을 사용하는 다양한 접근법과 통찰력이 설명됩니다. 이 방법은 수컷 쥐의 다른 상황과 암컷 쥐의 노래 선호도에 대한 음향 및 구문 변화를 설명하는 데 사용되었습니다.

Introduction

인간과 관련하여 마우스는 저주파와 고주파 발성을 생성하며, 나중에는 청각 범위 이상의 초음파 발성 (USV)으로 알려져 있습니다. USV는 어머니 - 강아지 검색, 청소년 상호 작용, 반대 또는 동일한 성행위 성인 상호 작용 4 , 12 와 같은 다양한 상황에서 생산됩니다. 이 USV는 수동으로 9 또는 자동으로 10 , 11 로 분류 할 수있는 다양한 다중 음절 레퍼토리로 구성됩니다. 최근 몇 년 동안 통신에서 이러한 USV의 역할이 점차 증가하고 있습니다. 여기에는 신경 정신병, 발달 또는 행동 장애 7 , 8 및 내부 동기 / 감정적 상태 13 의 마우스 모델의 판독 값으로 USV를 사용하는 것이 포함됩니다. USV는 전자 장치에 대한 신뢰할 수있는 정보를 전달할 것으로 생각됩니다.수신기 14 , 15 에 유용한 mitter 상태.

2005 년 Holy and Guo 11 은 성숙한 수컷 쥐 USV가 송 버드와 유사한 다중 음절 콜 요소 또는 음절의 연속으로 구성되었다는 아이디어를 발전 시켰습니다. 많은 종에서, 다중 음절 레퍼토리는 에미 터가 음절을 결합하고 음절을 다른 방식으로 정렬하여 곡에 포함 된 잠재적 인 정보를 증가시킵니다. 이 문법의 변형은 성행위와 배우자 선호에 대한 윤리적 인 관련성이 있다고 믿어지고 있습니다 16 , 17 . 후속 연구에 따르면 수컷 쥐가 암컷 5 , 18 의 존재, 중, 후에 생산하는 음절 유형의 상대적 구성을 바꿀 수 있었다. 즉, 성숙한 수컷 쥐는 USV를 사용하여 구애 행동을 유도합니다.또는 여성과의 긴밀한 접촉을 유지하거나, 교미를 원활하게하기 위해 19 , 20 , 21 . 그들은 또한 남성 - 남성 상호 작용에서 배출되어 상호 작용 중 사회 정보를 전하는 것으로 보인다 4 . 레퍼토리에서 이러한 변화를 포착하기 위해 과학자들은 일반적으로 스펙트럼 특성 (진폭, 주파수 등의 음향 매개 변수), USV 음절 또는 전화 수 및 첫 번째 USV 대기 시간을 측정합니다. 그러나 실제로이 USV들의 시퀀스 다이나믹스를 자세히 보는 사람은 거의 없습니다 22 . 최근 우리 그룹은 USV 음절 시퀀스의 동적 변화를 측정하는 새로운 방법을 개발했습니다 23 . 우리는 노래 내에서 음절의 순서가 무작위 적이 지 않으며, 사회적 맥락에 따라 변하고, 듣는 동물이 이러한 변화를 인종적으로 관련이 있다고 감지한다는 것을 보여주었습니다.

우리는 th를 주목한다.동물의 의사 소통을 연구하는 많은 연구자들은 인간의 말하기에서 사용 된 구문과 정확히 같은 의미 인 '구문'이라는 용어를 사용하지 않습니다. 동물 의사 소통 연구를 위해, 우리는 규칙을 따르는 순서가 정해진, 무작위적인 소리의 순서를 의미합니다. 인간에게는 특정 서열이 특정한 의미를 갖는 것으로 알려져있다. 이것이 쥐에 대한 경우인지 우리는 모른다.

이 문서와 관련 비디오에서 우리는 수컷 쥐가 다양한 환경에서 USV를 기록하고 재생을 수행 할 수 있도록 신뢰할 수있는 프로토콜을 제공하는 것을 목표로합니다. 순차적으로 사용되는 세 가지 소프트웨어의 사용 : 1) 자동화 된 녹음; 2) 음절 탐지 및 코딩; 3) 음절 특징 및 구문에 대한 심층 분석이 입증되었습니다 ( 그림 1 ). 이것은 수컷 마우스 USV 구조와 기능에 대해 더 많이 배울 수있게 해줍니다. 우리는 그러한 방법이 데이터 분석을 용이하게하고 mou의 정상 및 비정상적인 음성 커뮤니케이션을 특성화하는 데 새로운 지평을 열 것이라고 믿습니다의사 소통 및 신경 정신 장애의 모델

Protocol

윤리 진술 : 모든 실험 프로토콜은 Duke University 기관 동물 사용 및 관리위원회 (IACUC)에서 프로토콜 # A095-14-04로 승인되었습니다. 참고 : 사용 된 소프트웨어에 대한 자세한 내용은 " 재료 및 장비 "의 표 1 을 참조하십시오.

1. 마우스 USV 자극 및 기록

  1. 녹음 세션 전에 남성 준비
    참고 : 대표 결과는 B6D2F1 / J 젊은 성인 수컷 마우스 (7-8 주령)를 사용하여 얻었습니다. 이 프로토콜은 모든 변형에 적용 할 수 있습니다.
    1. 달리 요구되지 않는 한, 12 시간의 암흑주기에서 동물 방의 조명주기를 설정하십시오. 달리 요구되거나 필요하지 않는 한 케이지 당 4-5 명의 남성에 대한 표준 주택 규칙을 따르십시오. 기록하기 3 일 전에 수컷을 성숙한 성숙하고 수용성 인 여성 (케이지 당 암컷 한 마리 당 최대 3 마리의 수컷)에게 밤새 노출시킨다.
    2. 다음날 제거첫 번째 녹음 세션이 시작되기 적어도 이틀 동안 암컷의 새장에서 암컷이 암컷이없는 암컷을 수거하여 (우리의 시행 착오적 인 일화 분석에 근거하여) 노래하는 사회적 동기를 증가시킨다.
  2. 녹음 상자의 준비
    1. 소음 감쇠 상자 스튜디오 ( 그림 2A )로 작동하려면 비치 쿨러 (내부 치수는 L 27 x W 23 x H 47cm)를 사용하십시오. 상자 위에 작은 구멍을 뚫어 마이크로폰의 와이어가 들어가도록하십시오.
      참고 : 소리가 약하고 시각적으로 고립 된 환경에서 동물을 기록하는 것이 바람직합니다. 수십 마리의 마우스를 청취하거나 서로 보지 않고 주변의 장비 장비의 소음 및 실내의 사람들의 오염을 예방하고 청결을 얻으려면 좋습니다. 생쥐의 소리 녹음 ( 그림 2B ). 우리는 동일한 마우스의 발성을 내부와 외부에서 비교할 때 소리에 대한 반향 음이나 왜곡을 언급하지 않았습니다.그는 감쇠 챔버를 소음 ( 그림 2C ); 오히려 소리가 커지고 챔버 내부의 고조파가 줄어들 수 있습니다.
    2. 사운드 레코딩 소프트웨어 ( 예 : 그림 1표 1의 소프트웨어 A)로 작업하려면 마이크에 유선, 사운드 카드에 대한 와이어 및 사운드 카드를 컴퓨터에 연결하십시오. .wav 사운드 파일을 생성하는 소프트웨어 A와 같이 적절한 사운드 녹음 소프트웨어가 필요합니다.
    3. 방음 상자 안에 빈 케이지 (58 x 33 x 40cm)를 놓고 마이크로폰의 막이 케이지 하단에서 35 - 40cm 높이가되도록 마이크로폰 높이를 조절하고 마이크가 케이지 중앙에 오도록하십시오 ( 도 2A 참조 ).
  3. 연속 기록을위한 기록 소프트웨어 A ( 표 1 )의 구성
    1. 더블 클릭하여 소프트웨어 열기 A. "구성"메뉴를 클릭하고 열거 나 이름이 지정된 장치를 선택하십시오., 샘플링 속도 (250,000 Hz), 형식 (16 비트).
    2. 키 "Trigger"옵션을 선택하고 "Toggle"을 선택하십시오.
      참고 :이 설정을 사용하면 마우스의 케이지에 자극을 배치하는 동안 키 (F1, F2 )를 눌러 녹음을 시작할 수 있습니다.
    3. "Name"매개 변수 아래에 마우스의 ID를 입력하십시오.
    4. 최대 파일 크기를 원하는 녹음 분 (일반적으로 5 분으로 설정)로 설정하십시오.
      참고 : 분이 길수록 컴퓨터 저장 장치 메모리가 더 많이 필요합니다. 연속 모드가 설정되어 있지 않으면 소프트웨어는 설정된 매개 변수를 기반으로 시퀀스의 시작 또는 끝 부분에서 송 복싱을 차단하므로 안정적으로 시퀀스를 계량 할 수 없습니다.
  4. 다른 자극을 사용하여 USV를 기록하십시오. 참고 : 각 자극은 사용자의 실험 요구에 따라 독립적으로 사용할 수 있습니다.
    1. 꼬리에 의해 기록 될 동물을 부드럽게 들어 올리고 침구없이 새장에 넣으십시오 (mov를 막기 위해).방음 상자 안쪽에 침구에 단단한 소리가 들리지 않도록) 뚜껑을 위로 향하게하여 케이지의 열린 유선 금속 뚜껑을 덮으십시오.
    2. 소리가 약화 된 상자를 닫고 15 분 동안 동물이 익숙해 지도록하십시오. 이 순간에 자극 준비 (1.4)를 수행하십시오.
  5. 자극제 준비
    1. 자극으로 신선한 소변 (UR) 샘플 준비
      1. 수컷이 노래를 불러 일으키는 효과를 극대화하기 위해 녹음 세션 전에 최대 5 분의 소변 샘플을 확보하십시오. 참고 : 오랜 기간 동안, 특히 몇 시간 또는 밤새 앉아있는 소변은 효과적이지 못합니다 24 , 25 , 우리는 경험적으로 확인했습니다 23 .
      2. 한 케이지에서 여성 또는 남성 (자극의 성별에 따라 다름)을 선택하고 목 뒤에있는 피부를 잡아 당기고 동물을 한 손으로 잡아 당겨서 배가 노출 된 상태에서 약물 주입 절차를 수행하십시오.
      3. 그런 다음 다른 케이지를 선택하십시오. 그리고 이전에 사용 된 것과 동일한 면봉을 사용하여 다른 여성 또는 남성과 동일한 절차를 반복하십시오.
        주 :이 과정은 발정주기가 노래 행위에 영향을 미칠 수 있으므로 발정이나 다른 개별 효과를 막기 위해 동일한 면봉 끝에 2 마리의 독립적 인 우리의 소변을 최소 두 명의 여성 또는 남성에게 섞어줍니다.
      4. 면봉을 깨끗한 유리 또는 플라스틱 배양 접시에 사용하십시오.
        참고 : 소변이 들어있는 면봉은 다음 5 분 이내에 사용해야하므로 증발을 막기 위해 소변을 덮을 필요가 없습니다.
    2. 준비자극으로 살아있는 여성 (FE) 자극의
      1. 성적으로 성숙한 암컷 새장 하나 또는 두 개를 선택하십시오. 육안 검사 ( 27 , 28 에서와 같이 넓은 질 입구 및 분홍색 서라운드)를 통해 발정기 또는 발정 단계의 여성을 확인하십시오. 사용하기 전까지 다른 케이지에서 그들을 분리하십시오.
    3. 마취 된 동물 암컷 (AF) 또는 수컷 암컷 (AM)의 자극제로서의 준비
      1. AF의 경우, 위의 수영장에서 여성을 선택하십시오 (발정기 또는 발정기 중 하나). AM의 경우 성인 남성 생쥐의 케이지에서 남성을 선택하십시오.
      2. Ketamine / Xylazine (각각 100 및 10 MG / kg)의 솔루션 intraperitoneal 주사와 여성 또는 남성을 마취.
      3. 동물이 마취되는 동안 눈의 탈수를 방지하기 위해 안 연고를 사용하십시오. 꼬집었을 때 발치 수축 반사를 테스트하여 적절한 마취를 확인하십시오. 마취 된 동물을 깨끗한 케이지에 담아 종이 수건에 놓고 위트h 열 패드의 케이지는 체온 조절을 위해 "최소 열"로 설정하십시오.
      4. 그들이 일어나기 전에 필요한 경우 다른 기록 세션을 위해 같은 동물을 2 ~ 3 회까지 재사용하십시오 (대개 약 45 분 정도). 각 녹음 세션 후에 열 패드 위에 다시 올려 놓습니다.
      5. 5 분마다 동물을 만져 육안 검사 (분당 60 ~ 80 회 호흡)와 체온에 따라 호흡 수를 조절하십시오 (만지면 따뜻해야 함).
    4. 녹음 준비가되면, 소프트웨어 A의 "녹음"버튼을 클릭하십시오.
      참고 : 사용자가 각 채널과 연관된 키 버튼을 클릭하지 않으면 녹음이 시작되지 않습니다. 컴퓨터 화면의 케이지에서 라이브 오디오 피드를 모니터링하여 동물들이 노래하고 녹음 내용이 제대로 얻어 졌는지 확인하십시오.
    5. 동시에 기록 할 원하는 상자 (들)의 관련 키 버튼을 누르십시오 ( , 상자 1의 경우 F1). 원하는 자극을 입력하십시오.
      1. 다음과 같이 자극 중 하나를 제시하십시오. 케이지 안에 새로운 소변 샘플이 들어있는 면봉을 넣거나 케이지 안에 살아있는 여성을 넣거나 케이지의 금속 뚜껑 위에 마취 동물 중 하나 (AF 또는 AM)를 놓습니다.
    6. 녹음 상자를 조용히 닫고 미리 설정 한 시간 ( 예 : 1.3 절에서 설명한대로 5 분) 동안 녹음을 진행합니다.
    7. 녹음이 끝나면 정지 정사각형 빨간색 버튼을 클릭하여 녹음을 중지하십시오.
    8. 마취 된 동물을 자극으로 사용하는 경우 방음 상자를 열고 케이지의 금속 뚜껑에서 마취 된 동물을 꺼내 다음 가열 세션 전에 다시 가열 패드에 올려 놓거나 동물을 자극 검사로 더 이상 사용하지 않는 경우 그것은 15 분마다 흉골 굴림을 유지하기에 충분한 의식을 회복 할 때까지 매 15 분마다.
    9. 새장을 열고 의식이있는 시험 동물을 제거하고 그것을 홈 케이지에 다시 놓습니다. 70 % 알콜로 테스트 케이지를 청소하십시오.증류수.

2. 마우스 노래 분석기 v1.3을 사용하여 .wav 파일과 음절 코딩 처리하기

  1. 코딩 소프트웨어 B ( 그림 1 , 표 1 )를 열고 "경로 설정"을 클릭하여 소프트웨어 "B"경로에 "마우스 노래 분석기"( 그림 1 , 표 1 )의 소프트웨어 스크립트 C 가 들어있는 폴더를 넣고 소프트웨어에 폴더를 추가하십시오 B. 그런 다음 소프트웨어 B를 닫아 저장하십시오.
  2. 결합 된 소프트웨어 B + C의 음절 식별 설정을 구성하십시오. 참고 : 소프트웨어 스크립트 C 코드는 .wav 파일이있는 동일한 폴더에 .sng 형식의 파일이있는 "sonograms"라는 새 폴더를 자동으로 만듭니다. 일반적으로 동일한 폴더에 소프트웨어 A를 사용하여 생성 된 동일한 녹음 세션의 모든 .wav 파일을 저장하는 것이 좋습니다.
    1. C.로 구성된 열린 소프트웨어 B
      참고 : 소프트웨어 B의이 버전은 완전히 c입니다.소프트웨어 스크립트 C와 호환되지 않습니다. 이후 버전이 현재 코드에 포함 된 모든 기능을 수락 할 것이라는 보장은 없습니다.
    2. "현재 폴더"창을 사용하여 분석 할 녹음 .wav 파일이 들어있는 관심 폴더로 이동하십시오.
    3. "명령 창"에 "whis_gui"명령을 입력하십시오.
    4. 새로운 whis-gui 창에서 "Sonogram Parameters", "Whistle Options"및 기타 모든 매개 변수가있는 여러 개의 하위 창 섹션을 관찰하십시오 ( 그림 3 ). USV를 탐지하기위한 매개 변수를 조정하십시오. 실험용 마우스 ( 예 : 본 연구에 사용 된 B6D2F1 / J 및 C57BL / 6J 마우스 계통)에서 USVs 음절을 탐지하기 위해 다음 매개 변수 설정을 사용하십시오.
    5. 소노 그램 파라미터 섹션에서 최소 주파수 를 15,000 Hz로, 최대 주파수 를 125,000 Hz로, 샘플링 주파수 ( 주파수의 수 ) to 256kHz , 임계 값 은 0.3입니다.
    6. Whistle Options 섹션에서 Purity Threshold 를 0.075, 음절의 Min Duration 을 3ms, Min Frequency sweep을 20,000Hz, Filter Duration 을 3ms로 조정합니다.
    7. 다른 섹션에서는 Min Note Duration 을 3ms로, Min Note Count 를 1로 조정하십시오.
    8. 음절 분류 프로토콜 의 경우 whis_gui 창의 가운데 부분에있는 상자를 선택하십시오.
      기본 분류는 Holy 및 Guo 11 및 Arriaga 을 기준으로 합니다. 10 , 피치 점프의 수와 점프의 방향으로 음절 코드 : 단순 연속 음절의 경우 S ; 1 회의 다운 피치 점프를위한 D ; 1 개의 피치 점프를위한 U; 두 번의 순차적 다운 점프를위한 DD ; 1 다우에 대한 DUn과 하나의 위 점프; 사용자가 아무것도 선택하지 않으면 기본값입니다. 사용자는 각각의 대표 상자를 선택하여 특정 음절 유형에 대한 분석을 실행할 수 있습니다.
      Scattoni, et al.의 설명에 따라 음절 분류를 선택하십시오 . 9 ,이 유형을 음절 모양을 기반으로 한 더 많은 하위 범주로 구분하는 분할 범주를 추가로 선택하십시오.
      사용자가 고조파 유무에 관계없이 음절을 더 정렬하려면 고조파를 선택하십시오.
  3. 관심있는 .wav 파일의 음절 분류
    1. whis_gui 창의 왼쪽 상단 섹션에있는 하나의 녹음 세션에서 모든 .wav 파일을 선택하십시오.
    2. whis_gui 창의 중간에있는 "Get sonograms"를 클릭하십시오 ( 그림 3 ). sonograms를 포함하는 새로운 폴더는 .sng 파일 형식으로 생성됩니다. 상단의 모든 초음파 영상 (.sng 파일)을 선택하십시오sonogram 파일 창의 아래 상자에 "Animal ID"와 "Session ID"를 입력하십시오. 그런 다음 프로세스 초음파를 클릭하십시오.
      1. sonogram 폴더에있는 세 가지 파일 유형 인 "Animal ID-Session ID -Notes.csv"(음절에서 추출한 음표에 대한 정보 포함), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv"(모든 분류 된 음절 (음절 특징 및 음절에서 발견 된 총 음절 수 포함), "Animal ID-Session ID -Traces.mat"(모든 음절의 그래픽 표현 포함).
        참고 : "동물 ID- 세션 ID - 음절"파일에는 때로는 선택된 것보다 더 복잡한 분류되지 않은 USV 음절 또는 2 개의 동물 음절이 서로 겹치는 작은 퍼센트 (2 - 16 %)의 분류되지 않은 USV 음절이 포함될 수 있습니다 23 . 필요할 경우 추적 파일과 별도로 검사 할 수 있습니다.

3. 음절의 음향 구조 및 구문의 정량화

참고 : 초기 구문 분석을 위해 수행 할 단계에 대한 지침은 "READ ME!" "Song Analysis Guide v1.1.xlsx"파일의 스프레드 시트, 맞춤 설계된 스프레드 시트 계산기 E ( 그림 1 , 표 1 ).

  1. 스프레드 시트 소프트웨어 D ( 그림 1 , 표 1 )를 사용하여 위 섹션에서 얻은 소프트웨어 스크립트 C 파일 출력 "Animal ID-Session ID -Syllables.csv"를 엽니 다. 여기에는 모든 초음파 영상에서 발견 된 총 음절 수와 모든 스펙트럼 특징이 포함됩니다.
  2. 아직 변환되지 않은 경우 스프레드 시트 소프트웨어 D에서이 .csv 파일을 소프트웨어 D의 열 분리로 변환하여 각 값을 개별 열에 넣습니다.
  3. "Song Analysis Guide v1.1.xlsx"파일을 소프트웨어 D에서 엽니 다. 그런 다음 th를 클릭하십시오.e 템플릿 스프레드 시트를 만들고 템플릿 시트 지침에서 권장하는대로이 시트에 "Animal ID-Session ID -Syllables.csv"파일 데이터를 복사하여 붙여 넣으십시오. '분류되지 않은'음절 범주로 행을 제거하십시오.
  4. '분류되지 않은'행을 제거한 후, 먼저 열 O의 열의 ISI (음절 간격) 데이터를 복사하여 E 열로 다시 계산하십시오. 둘째, A 열에서 N 열의 모든 데이터를 '데이터'스프레드 시트로 복사하십시오.
  5. 데이터 스프레드 시트에서 동물 ID (열 AF) 및 녹음 길이 (분, AC 열)를 입력하십시오.
    참고 : 동물 ID는 녹음 설정에서 입력 한 것과 일치해야합니다. 파일은 입력 된 문자를 감지하여 .wav 파일의 이름과 비교합니다.
  6. "밀도 ISI"라고 표시된 스프레드 시트, 즉 ISI 플롯 결과를 사용하여 시퀀스를 정의하는 ISI 컷오프를 결정합니다.
    참고 : 우리의 지난 연구 23 에서, 우리는 cutoff를 두 standa마지막 피크의 중심에서 rd 편차. 그것은 노래의 세션 내에서 다른 노래의 발성을 구분하는 250ms 이상의 긴 간격 (LI)으로 구성됩니다.
  7. 주요 결과를 '기능'스프레드 시트 (각 동물에서 측정 한 모든 스펙트럼 기능을 그룹화)에서 확인하십시오.
    참고 : 사용자가 2.8.9 절에 설명 된 소프트웨어 스크립트 C에서 기본 음절 범주 설정을 사용한 경우, 음절은 위에서 설명한 Chabout 외에도 4 가지 범주로 더 분류됩니다 . 23 : 1) 어떤 음조 점프도없는 단순 음절,«s»; 2) 하나의 상향 점프 («u») 점프로 분리 된 두 음절 음절; 3) 하나의 하향 점프로 분리 된 두 음절 음절 («d»); 4) 노트 사이에 두 개 이상의 피치 점프가있는보다 복잡한 음절 («m»).
  8. 구문 값을 보려면 각 쌍의 확률을 계산하는 "글로벌 확률"스프레드 시트를 클릭하십시오.다음 식 23을 사용하여 시작 음절에 관계없이 모든 변환 유형을 사용할 수 있습니다.
    P (전환 유형의 발생) = 전환 유형의 총 발생 횟수 / 모든 유형의 총 전환 횟수
  9. '조건부 확률'스프레드 시트를 클릭하여 다음과 같은 방정식을 사용하는 시작 음절과 관련된 각 전환 유형의 조건부 확률을 계산하십시오.
    P (시작 음절이 주어진 전환 유형의 발생) = 전환 유형의 총 발생 횟수 / 동일한 시작 음절을 갖는 모든 전환 유형의 총 발생 횟수
  10. 위의 전이 확률이 비 무작위와 다른지 여부와 23 단계의 접근법에 따라 1 차 마르코프 모델을 사용하여 맞춤 소프트웨어 F ( 예 : R 스튜디오의 구문 디코더, 그림 1 ,strong> 표 1)에 다음과 같은 R 스크립트가 있습니다. Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R 다른 조건의 그룹 내에서; 동일한 조건의 그룹 간에는 Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R을 사용하십시오.
  11. 카이 제곱 검정 또는 다른 선호도 검정을 수행하여 같은 동물의 전이 확률의 통계적 차이를 다른 맥락에서 (쌍으로) 비교하여 테스트합니다 (23 항의 접근법을 따르십시오 ) .
    참고 : 그룹간에 구문을 비교하는 데 사용되는 통계 모델에 대한 자세한 내용은 23 페이지 에 나와 있습니다. 연구원은 다른 방법을 사용하여 자신이나 다른 사람들이 개발 한 전 세계 또는 조건부 전환 확률을 분석 할 수 있습니다.
  12. 구문 도표로 시퀀스를 그래픽으로 표시하려면 값을 네트워크 그래프 소프트웨어 G ( 그림 1 , 표 1 참조)에 입력하고 노드는 다른 음절 표식을 지정합니다gories 및 화살표 색상 및 / 또는 두께 픽셀로 음절 사이의 확률 값 범위를 나타냅니다.
    참고 : 명확성을 위해 글로벌 확률 그래프의 경우 0.005 이상의 전환 (기회 발생의 0.5 % 이상) 만 표시합니다. 조건부 확률의 경우, 우리는 하나의 특정 음절 유형뿐만 아니라 전체 음절 수로 나눈 것을 고려하면 "글로벌 모델"의 각 확률이 더 낮기 때문에 임계 값을 0.05로 사용합니다.

4. 노래 유형에 대한 노래 편집 및 테스트 환경 설정

참고 : USV의 재생은 특정 노래 유형에 대한 선호도를 포함하여 동물의 행동 반응을 실험적으로 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여성 선호도는 발정기 상태에 따라 달라질 수 있기 때문에 여성은 다음과 같이 시험하기 전에 동일한 발정기 상태에 있는지 확인하십시오.

  1. 재생 실험 며칠 전에 성적 경험을 가진 여성을 준비하십시오. 발정 (Whitten 28 effect)을 일으키는 실험 전에 3 일 동안 성적으로 성숙한 암컷 (7 주 이상)을 분리 케이지 (구멍이 뚫린 투명한 플라스틱)에 놓아두고 암컷이 볼 수있게하고 남성의 냄새를 맡지 만 성행위를 예방합니다.
  2. 발정주기를 모니터하고, 출산 전 발정이나 발정이 분명 해지면 ( 27 절에서와 같이 질 입구와 분홍색 서라운드) 암컷을 자신의 새장에 다시 모으십시오. 그들은 다음날 시험받을 준비가되어 있습니다.
  • 재생을위한 노래 파일 준비
    1. 사운드 프로세싱 소프트웨어 H ( 예 : SASLap Pro, 그림 1 , 표 1 )에서 복사 및 붙여 넣기 기능을 사용하여 자극에 사용할 원하는 조건을 가진 두 개의 편집 된 .wav 파일을 만듭니다. 변수로 발성 량을 막으려면 두 사운드 파일에 동일한 수의 s가 포함되어 있는지 확인하십시오( 예 : UR)의 동일 또는 다른 수컷 / 암컷으로부터의 순서 (송 발성)의 길이와 길이
    2. 소프트웨어 H에서 조건 1의 노래가 포함 된 첫 번째 파일을 엽니 다. 그런 다음 파일> 특별 설정> 파일에서 채널 추가로 이동 한 다음 조건 2에서 테스트 할 두 번째 사운드 파일을 선택합니다. 각 조건에 대해 하나씩 2 개의 채널이 만들어집니다.
    3. 편집> 볼륨으로 이동하여 필요한 경우 시각적으로 볼륨을 조정하여 두 파일의 볼륨이 서로 일치하는지 확인하십시오.
    4. 그런 다음 편집> 형식> 샘플링 주파수 변환으로 이동 한 다음 250,000Hz에서 1,000,000Hz로 변환을 선택하여 .wav 파일을 256kHz의 샘플링 주파수에서 1MHz로 변환합니다. 이 단계는 재생 장치에서 .wav 파일을 읽는 데 필요합니다.
    5. 이 새 파일을 재생할 테스트 파일로 저장하십시오. 어떤 노래가 어느 채널에 있는지 확인하십시오 (1 또는 2). 명확하게하기 위해 이름을 "file name.wav"로 지정하십시오.
    6. E로 이동xit> 형식> 채널 바꾸기 및 두 채널 바꾸기. 다른 이름을 사용하여 스왑 된 버전을 저장하십시오. 참고 :이 채널은 반대로 채널 이름이 뒤 바뀌며 나중에 'file name_swapped.wav'라는 이름으로 지정됩니다.
  • 재생 장치 준비
    1. 재생 장치 "Y-maze"를 70 % 알코올과 증류수로 세척합니다. 종이 타월로 말립니다. 우리의 Y-maze는 30cm 길이의 팔과 미로의 극단에 두 개의 구멍이 뚫린 수제 불투명 한 검정색 플라스틱 장치로, 초음파 스피커가 팔의 바닥 수준에 맞도록합니다 ( 그림 4A ).
    2. 스피커가 올바른 위치에 있고 사운드 카드에 연결되어 있고 카드가 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인하십시오.
    3. 소프트웨어 A를 열고 재생> 장치를 선택하고 재생 사운드 카드 장치를 선택하십시오. "파일 헤더 비율 사용"을 선택하십시오. 재생> 재생 목록으로 이동하여 두 개의 cha가 포함 된 관심 파일을로드하십시오.nnels ( 즉, "file.wav"). "루프 모드"를 선택하십시오. 미로 전체 위에 비디오 레코더를 설치하여 전체 미로를 커버하십시오.
  • 재생 실험 수행
    1. 시험 여성을 미로에 놓고 10 분 동안 요법을합니다. 10 분 후, 암이 시작 암에없는 경우 부드럽게 암을 다시 시작 암에 밀어 넣고 플라스틱 분리 창을 닫습니다.
    2. 준비된 파일 ( "file.wav")을 선택하여 재생하고 재생하십시오. 비디오 녹화를 시작하고 비디오 기록 필드에 종이 메모가있는 Y-maze 팔 ( , 왼쪽 UR 또는 오른쪽 팔의 FE)에 어떤 채널이 위치해 있는지 확인하십시오.
    3. 여성이 루프 모드에서 노래를 듣고 원하는 분 ( 예 : 5 분) 동안 미로를 탐험 할 수있게하십시오. 이것은 하나의 세션입니다. 다시 암컷을 시작 팔로 되돌립니다. 다음 세션을 준비하면서 1 분 동안 휴식을 취하십시오. 렘오줌 흔적과 증류수로 배설물을 비우십시오.
    4. "file_swapped.wav"파일을로드합니다. 비디오 레코딩을 위해 종이 노트의 위치를 ​​바꿉니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 또는 그 반대로 이동합니다 .1 분 후 파일을 재생합니다. 두 번째 세션에서 female을 해제하십시오. .
    5. 4.4.3에서 4.4.4까지의 단계를 반복하여 총 4 세션 x 5 분 동안 테스트하는 동안 잠재적 인 측면 바이어스를 탐지합니다. 빨간색 중지 버튼을 클릭하여 모든 세션이 끝날 때 비디오 녹화를 중지하십시오. 여성 사이에 70 % 알코올과 증류수로 미로를 청소하십시오.
    6. 같은 여성과 일주일 후 다른 노래 표본으로 모든 단계를 반복하여 결과의 ​​신뢰성을 테스트하기에 충분한 결과를 얻습니다.
    7. 나중에 비디오를 관찰하고 비디오의 타이머와 초시계를 사용하여 각 세션마다 여성의 여성 각자가 소비 한 시간을 측정하십시오. 가능한 노래 선호도에 대한 결과 데이터를 통계적으로 분석하십시오.
  • Representative Results

    현재의 프로토콜에서, 수컷 B6D2F1 / J 생쥐의 음성 행동 및 구문의 변화가 특징 화되었다. 일반적으로이 프로토콜을 사용하여 5 분 세션 당 평균 남성 수에 대해 여성 UR, FE 615.6 ± 72, AF 450 ± 134, AM 75.6 ± 38.9 및 0.2의 여성 응답에 대해 675 ± 98.5 분류 음절을 기록 할 수있었습니다 남자 UR에서 ± 0.1 (n = 12 남자). 여성 UR은 ~ 130 음절 / FE, FE는 ~ 120 음절 / 분, AF 문맥은 ~ 100 음절 / 분 ( 그림 5A )이었다. 남성은 밤새 수집 한 소변과 관련하여 새로 수집 한 소변에 대한 반응으로 훨씬 많은 양의 음절을 생산합니다 10 , 23 . 남성은 또한 마취 된 남성 또는 신선한 남성 소변 ( 그림 5A )이있을 때 상당히 적게 노래합니다. 남성은 또한 컨텍스트 23에서 레퍼토리를 변경합니다. 예를 들어, B6D2F1 / J 수컷은 유의하게 증가한다 여성의 소변 상태에서 다중 피치 점프 "m"범주 음절을 생성합니다 ( 그림 5B ). 또한 각 음절의 음향 특성을 상황에 따라 바꿉니다. 예를 들어, B6D2F1 / J 수컷은 여성의 소변 상황에서 더 높은 진폭과 대역폭에서 음절을 시현하고, 다른 여성의 경우와 비교하여 깨어있는 여성 컨텍스트에서 높은 스펙트럼 순도를 나타냅니다 ( 그림 6 ).

    이 프로토콜은 또한 시퀀스의 동적 특징을 측정하고 따라서 구문 변화를 측정하는 수단을 제공합니다. Ey, et al. 22 에서는 ISI를 사용하여 시퀀스 간의 틈을 정의한 다음 ( 그림 7A ) 23 틈을 사용하여 음절 시퀀스의 시간 패턴을 구별하고 분석합니다. 우리는 깨어있는 여성 문맥에서 더 긴 서열 길이가 생성된다는 것을 보여 주었다 ( 그림 7B )f "> 23이 기법을 사용하면 복잡한 시퀀스 ("m "음절 유형의 2 번 이상으로 구성된)와 단순한 시퀀스 (하나 또는"m "유형으로 구성되어 있으므로 대부분" B6D2F1 / J 남성의 경우 여성 소변 상황이 다른 소아에 비해 더 높게 나타 났으며 ( 그림 7C ) 23 , 이는 여성 소변 상태에서 더 복잡한 음절을 생산함을 의미하지만, 그러한 음절이 배포 됨 더 많은 시퀀스.

    또한 한 음절 유형에서 다른 음절 유형으로의 조건 전이 확률을 계산할 수 있습니다 ( "침묵"상태로의 전환을 포함하여 총 24 개의 전이 유형). 우리는 다른 상황에서 주어진 시작 음절에 대한 마우스의 전환 유형 선택이 다르다는 것을 알았고 더 많은 구문 div여성 소변 상태에서의 ersity ( 그림 8 ) 23 . 이러한 관찰은 남성이 다양한 자극과 경험 4 , 5 , 24 에 대한 응답으로 자신의 발성의 음향 특징이나 레퍼토리 구성을 변경할 수 있다는 것을 보여주는 이전 보고서와 일치합니다.

    마지막으로, 현재의 프로토콜은 여성 선호도를 재생으로 테스트하기위한 지침을 제공합니다. 우리는 B6D2F1 / J 여성이 간단한 노래에 비해 더 복잡한 노래 (2 개 이상의 "m"음절 포함)를 선호한다는 것을 발견했습니다 23 . 대부분의 여성들은 복잡한 노래를 연주 한 Y-maze의 측면에 더 자주 머물기로했습니다 ( 그림 4B ).

    그림 1
    그림 1 : Sof의 흐름도tware 사용 및 분석. 각 프로그램 및 관련 코드에는 본문에서 ID 및 사용법을 설명하는 데 도움이되는 문자 이름이 제공됩니다. () 안은 프로토콜에서 사용하는 특정 프로그램입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 2
    그림 2 : Male Mice Song 녹음을위한 설정. (A) 소음 감쇄 기록 상자의 그림. USV 발성을 기록하도록 설정. (B) "마우스 노래 분석기 v1.3"에 의해 계산 된 상세한 스펙트럼 특징을 포함하여 소프트웨어 A ( 표 1 )로 작성된 녹음의 예제 음모 : 기간, 음절 간격 (ISI), 최대 빈도 분 (Pf 분) 피크 주파수 최대 (Pf max), 피크 주파수 시작 (Pf start), 피크 주파수 엔드 (Pf 끝) 및 대역폭이 포함됩니다. (C) 소리 감쇠 상자 내부와 같은 방에있는 실험실 벤치의 상자 바깥에서 살아있는 여성에게 노래하는 다른 남성의 뇌파. 우리의 일화적인 관찰은 동일한 동물의 상자에 녹음 된 소리가 더 큰 음량 (강한 강도)과 고조파가 적은 것을 나타내지 만 사운드 거품이없는 상자에는 울림의 흔적이 없음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 3
    그림 3 : "Mouse Song Analyzer v1.3"의 스크린 샷 분석에 사용할 수있는 다양한 옵션을 보여주는 whis_gui 창. 표시된 매개 변수는 남성 USV를 그림과 데이터 분석에 기록하는 데 사용되는 매개 변수입니다 (최소 음표 길이는 3ms를 제외하고). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 4
    그림 4 : 복잡한 노래와 단순한 노래를 재생할 때의 여성 선택 (A) 사용 된 Y- 미로 장치의 그림과 치수 측정. (B) 각 암에서 여성이 소비 한 시간. 복잡한 (여성 소변이 추출 된) 여성 또는 더 단순한 (깨어있는 여성이 이끌어 낸) 남성의 노래. 데이터는 평균 ± SE로서 n = 10 B6D2F1J 암컷 마우스에 대해 제시되고, 또한 개별 값이 도시되어있다; 10 명의 여성 중 9 명은보다 복잡한 음절 / 시퀀스 송에 대한 선호도를 보였다. * p <0.05 paired student t-test. Chabout, et al. 23 허가.blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    그림 5
    그림 5 : 음절의 수와 조건을 가로 지르는 레퍼토리 . (A) 다른 맥락에서 남성의 음절 생산율. (B) 여성의 소변 (UR), 마취 된 여성 (AF), 깨어있는 여성 (FE) 및 마취 된 남성 (AM) 상황 하에서 남성의 레퍼토리 구성. 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. * p <0.03; ** p <0.005; Benjamini와 Hochberg 교정 (n = 12 남자) 후에 post-hoc paired student t-test에 대한 *** p <0.0001. Chabout, 그 외 여러분. 23 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    together.within-page = "1"> 그림 6
    그림 6 : 다른 컨텍스트의 스펙트럼 기능 예 (A) 진폭. * 수정 후 post-hoc paired student t-test의 경우 p <0.025. (B) 주파수 범위 또는 대역폭. * : p <0.041; ** : p <0.005; *** : 수정 후 p <0.0001. (C) 음절의 스펙트럼 순도. * p : <0.025; ** : p <0.005; *** : 수정 후 p <0.0001. 약어 : 여성 소변 (UR), 마취 된 여성 (AF), 깨어있는 여성 (FE) 및 마취 된 남성 (AM). Chabout, et al. 23 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    37fig7.jpg "/>
    그림 7 : 시퀀스 측정. (A) 시퀀스 분리를위한 ISI 사용. 짧은 ISI (SI)와 중간 ISI (MI)는 시퀀스 내에서 음절을 분리하는 데 사용되며, 250 ms (LI) 이상의 긴 ISI는 두 개의 시퀀스를 구분합니다. (B) 시퀀스의 길이 (시퀀스 당 음절의 수로 측정 됨, 다른 상황에서 남성이 생성 함). * : p <0.025; ** p <0.005; 수정 후 *** p <0.0001. (C) 다른 맥락에서 남성이 만든 단순한 노래에 비해 복잡한 노래의 비율. * p <0.041; ** p <0.005; 수정 후 *** p <0.0001. 자료는 평균 ± SEM (n = 12 남자)으로 제시되었다. Chabout, 그 외 여러분. 23 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


    그림 8 : 각 컨텍스트에 대한 조건부 확률에 기초한 시퀀스의 음절 구문 다이어그램. 화살표 두께는 n = 12 남성 : P (시작 음절이 주어지면 전환 발생)에서 평균화 된 각 컨텍스트에서 전환 유형의 조건부 확률 발생에 비례합니다. 명확성을 위해, 확률 0.05 미만의 드문 전환은 표시되지 않습니다. Chabout, 그 외 여러분. 23 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

    Discussion

    이 프로토콜은 주로 여성 관련 자극의 다양한 실험실에서 남성 생쥐 구애 vocalizations 수집, 계량 및 연구 방법을 제공합니다. 이전에 Chabout, et al. 23 그리고 대표적인 결과에서,이 방법의 사용은 우리가받는 여성에게 중요한 문맥 의존적 발성과 구문을 발견 할 수있게 해주었습니다. 이러한 자극의 표준화는 믿을만한 수의 USV를 수집하고 남성의 구애 노래 및 레퍼토리에 대한 상세한 분석을 허용합니다.

    라이브 여성이 남성과 함께있을 때, 프로토콜은 우리가 발성의 에미 터를 명확하게 식별하는 것을 허용하지 않습니다. 그러나 이전의 연구에 따르면 이러한 상황에서 방출되는 대부분의 발성은 남성 26 , 29 세 에 의한 것으로 나타났습니다. 양성 종양 (남성 또는 여성)을 이용한 대부분의 연구에서,남성에 대한 자극은 여성의 발성 양이 4 , 5 , 22 , 30 정도로 무시할 수 있다고 생각하기 때문입니다. 그러나 최근 논문에서는 그룹 수용 조건에서 에미 터의 발성을 국산화하기 위해 삼각 측량을 사용했으며, 한 쌍 내에서 여성은 USV의 ~ 10 %에 기여하는 것으로 나타났습니다. 현재의 프로토콜에서 마취 된 여성의 사용은 사용자가 그녀의 발성없이 여성의 면전에서 남성의 발성을 연구 할 수있게한다. 이 최근의 연구 31의 기대와는 달리, 우리는 FE와 AF 조건 사이에서 방출 된 음절의 수에는 차이가 없다는 것을 발견했다. 살아있는 암컷이 기록에 크게 기여하지 않았거나 암컷이 살아있는 암컷 대 마취 된 fem의 존재 하에서 발성이 덜한 것일 수 있습니다에일. 그럼에도 불구하고 우리는 미래의 실험에서이 삼각 측량 방법을 사용하여 여성 기여의 잠재적 영향을 평가해야한다고 생각합니다.

    소프트웨어 A, 소프트웨어 B를 사용하는 마우스 송 분석기 소프트웨어 스크립트 C, 소프트웨어 B를 사용하는 마우스 송 분석기 소프트웨어 스크립트 C, 소프트웨어 A를 사용하는 마우스 송 분석기 소프트웨어 스크립트 C, 예를 들어, 최근 논문에서는 사용자가 음향 학적 변수를 수동으로 추출한 음향 변수를 자동으로 추출 할 수있는 VoICE라는 소프트웨어를 제안했다. 사용자 (32) 에 의해 선택된다. 그러나 자동화 또는 반자동 서열 분석은 우리의 접근 방식만큼 상세하지 않습니다. 일부 상용 소프트웨어는 음향 기능을 자동으로 분석 할 수 있지만 자동 기능을 제공하지는 않습니다음절의 atic 분류; 사용자는 이후 다른 음절을 정렬해야합니다. Grimsley, Gadziola, et al. 33 은 공유 음향 기능을 기반으로 음절을 클러스터링하지만 음절의 자동 감지는 제공하지 않는 표 기반의 가상 마우스 보컬 오르간 프로그램을 개발했습니다. 그들의 프로그램 34 는 마르코프 모델을 사용하여 녹음 된 노래에서 새로운 시퀀스를 생성한다는 점에서 독보적이며 간단한 편집보다 더 고급 기능을 갖추고 있습니다.

    생쥐에 대한 대부분의 이전의 통신 연구는 이미 터의 측면 35 , 36 에 집중되어있다. 수신기의 측면을 조사한 연구는 거의 없습니다 ( 30 , 37 , 38) . 재생 및 차별 프로토콜은 Asaba, Kato 등이 최근에 설명한 것과 같이 수신자 측을 연구하기위한 간단한 테스트를 제공합니다.al. 39 . 이 연구에서 저자들은 여기에 설명 된 Y- 미로 상자 대신에 음향 거품으로 구분 된 2 가지 선택 테스트 상자를 사용했습니다. 두 선택 설정에는 장단점이 있습니다. 첫째, Y- 미로는 소리를 한 팔에서 다른 팔로 분리하지 않지만 두 선택 상자는 소리를 분리합니다. 그러나 Y-maze 디자인을 사용하여 동물은 동시에 연주되는 두 개의 노래를 빠르게 평가하고 선호하는 음악으로 이동합니다. 그럼에도 불구하고 일반적으로 재생 실험은 실험자가 양성 동물에 대해 생성 된 발성의 의미와 기능을 결정하는 데 도움이됩니다. 결론적으로이 프로토콜의 기술을 습득하고 분석 한 후에 독자는 마우스 USV의 상황, 유전학 및 신경 생물학에 영향을 미치는 많은 질문을 처리 할 수 ​​있어야합니다.

    B6D2F1 / J 마우스를 사용하면 여성 관련 자극이 거의 항상 우리 연구실에서 테스트 한 남성의 USV를 트리거합니다. 동료에게 중요합니다.강력한 통계 분석을 위해서는 충분한 음절 (> 100 분)이 필요합니다. 문제 해결을 위해 USV가 기록되지 않은 경우 (또는 불충분 한 경우) 구성을 확인하여 소리가 녹음되어 있는지 확인하십시오. 자극이 도입 된 후 컴퓨터 화면에서 실시간 초음파 영상을보고 녹음 중에 새장에서 일어나는 일을 실시간 검사합니다. 그렇지 않으면 수컷을 성적으로 성숙한 / 수용성 여성에게 밤새 다시 노출시킨 다음 며칠 또는 최대 1 주일간 혼자 머물면서 다시 녹음하십시오. 일화적인 관찰을 바탕으로, 우리는 일부 남성이 하루 (거의 5 분 동안)에 많이 노래하고, 다음 날에는별로 노래를 부르지 않는다는 것을 알게됩니다. 우리는 그와 같은 대상의 다양성이 발생하는 이유를 알지 못하지만, 남성의 동기 부여 또는 계절성 및 여성의 소변의 발정 상태 일 것으로 추측합니다. USV가 기록되지 않은 경우, 여러 날에 동물을 기록하여 이러한 다양한 효과를 선택하십시오. Unl나는 노래하는 새들과 같이, 시간에 따라 노래하는 양에 명백한 차이를 언급하지 않았다. 우리는 남성이 7 주 전에 많이 노래하지 않는다는 것을 발견했습니다 (5 분 안에 100 음절 미만).

    여기에 제시된 탐지 방법은 몇 분 안에 수천 개의 음절과 모든 음향 매개 변수를 추출 할 수 있습니다. 그러나 자동 감지 방법으로 배경 잡음에 매우 민감합니다. 소음이있는 마우스 노래 분석기 탐지 소프트웨어 (예 : 침구와 함께 녹음 된 동물)를 사용하면 유연성을 높이기 위해 감지 임계 값을 조정해야 할 수 있습니다. 그러나 이는 또한 거짓 긍정 음절의 수를 증가 시키며 자동 감지가 실패 할 수 있습니다. 이러한 상황에서는 수동 코딩을 사용할 수 있습니다.

    앞서 언급했듯이 발성의 수, 레퍼토리 및 대기 시간은 변형에 따라 광범위하게 가변적이므로 매개 변수를 변경해야 할 수도 있습니다 (길이,자극, 자동 음절 탐지 )을 사용하여 통계 분석을위한 최적의 녹음을 보장합니다.

    Disclosures

    저자는 공개 할 것이 없습니다.

    Acknowledgments

    이 작품은 EDJ에 하워드 휴즈 의학 연구소 기금에 의해 지원되었다. 우리는 Pr에 감사드립니다. 우리에게 스피커 하드웨어를 빌려준 Sylvie Granon (NeuroPSI - University Paris south XI - FRANCE). 우리는 Jarvis Lab의 회원들에게 그들의 작품에 대한지지, 토론, 교정 및 의견, 특히 Joshua Jones Macopson의 인물 및 테스트에 대한 도움에 감사드립니다. Dr. Gustavo Arriaga에게 Mouse Song Analyzer 소프트웨어에 대한 도움을 주시고, V1.3으로 업그레이드하고이 프로토콜의 다른 측면에 대해 감사드립니다. 이 소프트웨어의 v1.0은 Arriaga에 의해 Holy and Guo와 v1.1 및 v1.3에 의해 개발되었습니다.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sound proof beach cooler See Gus paper has more info on specific kind Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
    Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 Includes extension cable 
    Ultrasound Gate 1216H sound card Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34175 12 channel sound card
    Ultrasound Gate Player 216H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #70117 2 channels playback player
    Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #60103 2 playback speakers
    Test cage  Ace #PC75J 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
    plexiglas separation home made - 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
    Video camera Logitech C920 logitech HD Pro webcam C920
    Heat pad  Sunbeam 722-810-000
    Y-maze  Home made - Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
    Tweezers
    Software
    Avisoft Recorder (Software A) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    MATLAB R2013a (Software B) MathWorks - MATLAB R2013a (8.1.0.604)
    Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_
    v1.3-2015-03-23.zip
    Microsoft Office Excel 2013 (Software D) Microsoft - Microsoft Office Excel
    Song Analysis Guide v1.1 (Software E) Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
    Syntax decorder v1.1 (Software F) Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    Graphiz (Software G) AT&T Research and others  http://www.graphviz.org
    Avisoft SASLab (Software H) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    Reagents
    Xylazine (20 mg/mL) Anased -
    Ketamine HCl (100 mg/mL) Henry Schein #045822
    distilled water
    Eye ointment  Puralube Vet Ointment  NDC 17033-211-38
    Cotton tips
    Petri dish

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Amato, F. R., Scalera, E., Sarli, C., Moles, A. Pups call, mothers rush: does maternal responsiveness affect the amount of ultrasonic vocalizations in mouse pups. Behav. Genet. 35, 103-112 (2005).
    2. Panksepp, J. B., et al. Affiliative behavior, ultrasonic communication and social reward are influenced by genetic variation in adolescent mice. PloS ONE. 2, e351 (2007).
    3. Moles, A., Costantini, F., Garbugino, L., Zanettini, C., D'Amato, F. R. Ultrasonic vocalizations emitted during dyadic interactions in female mice: a possible index of sociability. Behav. Brain Res. 182, 223-230 (2007).
    4. Chabout, J., et al. Adult male mice emit context-specific ultrasonic vocalizations that are modulated by prior isolation or group rearing environment. PloS ONE. 7, e29401 (2012).
    5. Yang, M., Loureiro, D., Kalikhman, D., Crawley, J. N. Male mice emit distinct ultrasonic vocalizations when the female leaves the social interaction arena. Front. Behav. Neurosci. 7, (2013).
    6. Petric, R., Kalcounis-Rueppell, M. C. Female and male adult brush mice (Peromyscus boylii) use ultrasonic vocalizations in the wild. Behaviour. 150, 1747-1766 (2013).
    7. Bishop, S. L., Lahvis, G. P. The autism diagnosis in translation: shared affect in children and mouse models of ASD. Autism Res. 4, 317-335 (2011).
    8. Lahvis, G. P., Alleva, E., Scattoni, M. L. Translating mouse vocalizations: prosody and frequency modulation. Genes Brain & Behav. 10, 4-16 (2011).
    9. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in the BTBR T+tf/J mouse model of autism. PloS ONE. 3, (2008).
    10. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PloS ONE. 7, (2012).
    11. Holy, T. E., Guo, Z. Ultrasonic songs of male mice. PLoS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
    12. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Amer. Assoc. Lab. Anim. Science: JAALAS. 46, 28-28 (2007).
    13. Wohr, M., Schwarting, R. K. Affective communication in rodents: ultrasonic vocalizations as a tool for research on emotion and motivation. Cell Tissue Res. 81-97 (2013).
    14. Pasch, B., George, A. S., Campbell, P., Phelps, S. M. Androgen-dependent male vocal performance influences female preference in Neotropical singing mice. Animal Behav. 82, 177-183 (2011).
    15. Asaba, A., Hattori, T., Mogi, K., Kikusui, T. Sexual attractiveness of male chemicals and vocalizations in mice. Front. Neurosci. 8, (2014).
    16. Balaban, E. Bird song syntax: learned intraspecific variation is meaningful. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 3657-3660 (1988).
    17. Byers, B. E., Kroodsma, D. E. Female mate choice and songbird song repertoires. Animal Behav. 77, 13-22 (2009).
    18. Hanson, J. L., Hurley, L. M. Female presence and estrous state influence mouse ultrasonic courtship vocalizations. PloS ONE. 7, (2012).
    19. Pomerantz, S. M., Nunez, A. A., Bean, N. J. Female behavior is affected by male ultrasonic vocalizations in house mice. Physiol. & Behav. 31, 91-96 (1983).
    20. White, N. R., Prasad, M., Barfield, R. J., Nyby, J. G. 40- and 70-kHz Vocalizations of Mice (Mus musculus) during Copulation. Physiol. & Behav. 63, 467-473 (1998).
    21. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic 'songs' with approach behaviour. Biology Letters. 5, 589-592 (2009).
    22. Ey, E., et al. The Autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
    23. Chabout, J., Sarkar, A., Dunson, D. B., Jarvis, E. D. Male mice song syntax depends on social contexts and influences female preferences. Front. Behav. Neurosci. 9. 76, (2015).
    24. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. & Behav. 96, 602-605 (2009).
    25. Roullet, F. I., Wohr, M., Crawley, J. N. Female urine-induced male mice ultrasonic vocalizations, but not scent-marking, is modulated by social experience. Behav. Brain Res. 216, 19-28 (2011).
    26. Barthelemy, M., Gourbal, B. E., Gabrion, C., Petit, G. Influence of the female sexual cycle on BALB/c mouse calling behaviour during mating. Die Naturwissenschaften. 91, 135-138 (2004).
    27. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PloS ONE. 7, (2012).
    28. Whitten, W. K. Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male. J. Endocrinol. 13, 399-404 (1956).
    29. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. ULTRASONIC EMISSIONS: DO THEY FACILITATE COURTSHIP OF MICE. J. Comp. Physiolog. Psych. 84, 445-452 (1973).
    30. Asaba, A., et al. Developmental social environment imprints female preference for male song in mice. PloS ONE. 9, 87186 (2014).
    31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. E. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
    32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Penagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Scientific Reports. 5, 10237 (2015).
    33. Grimsley, J. M., Gadziola, M. A., Wenstrup, J. J. Automated classification of mouse pup isolation syllables: from cluster analysis to an Excel-based "mouse pup syllable classification calculator". Front. Behav. Neurosci. 6, (2012).
    34. Grimsley, J. M. S., Monaghan, J. J. M., Wenstrup, J. J. Development of social vocalizations in mice. PloS ONE. 6, (2011).
    35. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Curr. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
    36. Merten, S., Hoier, S., Pfeifle, C., Tautz, D. A role for ultrasonic vocalisation in social communication and divergence of natural populations of the house mouse (Mus musculus domesticus). PloS ONE. 9, 97244 (2014).
    37. Neilans, E. G., Holfoth, D. P., Radziwon, K. E., Portfors, C. V., Dent, M. L. Discrimination of ultrasonic vocalizations by CBA/CaJ mice (Mus musculus) is related to spectrotemporal dissimilarity of vocalizations. PloS ONE. 9, 85405 (2014).
    38. Holfoth, D. P., Neilans, E. G., Dent, M. L. Discrimination of partial from whole ultrasonic vocalizations using a go/no-go task in mice. J. Acoust. Soc. Am. 136, 3401 (2014).
    39. Asaba, A., Kato, M., Koshida, N., Kikusui, T. Determining Ultrasonic Vocalization Preferences in Mice using a Two-choice Playback. J Vis Exp. (2015).
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    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).More

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).

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