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Éliminer et analyser les chansons de la vocalisation par ultrasons de souris masculine (USV)

doi: 10.3791/54137 Published: May 9, 2017

Summary

Les souris produisent un répertoire multisyllabique complexe de vocalisations ultrasonores (USV). Ces USV sont largement utilisés comme lectures pour les troubles neuropsychiatriques. Ce protocole décrit certaines des pratiques que nous avons apprises et développées pour induire, collecter et analyser systématiquement les caractéristiques acoustiques et la syntaxe des chansons de souris.

Abstract

Les souris produisent des vocalisations à ultrasons (USV) dans divers contextes sociaux tout au long du développement et de l'âge adulte. Ces USV sont utilisés pour la recherche de la mère-chiot 1 , les interactions juvéniles 2 , les interactions opposées et du même sexe 3 , 4 , 5 et les interactions territoriales 6 . Depuis des décennies, les enquêteurs ont utilisé les USV comme proxys pour étudier les troubles neuropsychiatriques et développementaux ou comportementaux 7 , 8 , 9 et plus récemment pour comprendre les mécanismes et l'évolution de la communication vocale entre les vertébrés 10 . Dans les interactions sexuelles, les souris mâles adultes produisent des chansons USV, qui présentent des caractéristiques similaires à celles des oiseaux chanteurs 11 . L'utilisation de ce répertoire multisyllabiqueLes efforts peuvent accroître la flexibilité et l'information potentielles qu'ils portent, car ils peuvent être variés dans la façon dont les éléments sont organisés et recombinés, à savoir la syntaxe. Dans ce protocole, on décrit une méthode fiable pour susciter des chansons USV de souris mâles dans divers contextes sociaux, tels que l'exposition à de l'urine féminine fraîche, des animaux anesthésiés et des femelles d'oestrus. Cela comprend des conditions pour induire une grande quantité de syllabes chez les souris. Nous réduisons l'enregistrement des bruits ambiants avec des chambres sonores peu coûteuses et nous présentons une méthode de quantification pour détecter, classer et analyser automatiquement les USV. Ce dernier comprend l'évaluation du taux d'appel, du répertoire vocal, des paramètres acoustiques et de la syntaxe. Différentes approches et connaissances sur l'utilisation des playbacks pour étudier la préférence d'un animal pour des types de morceaux spécifiques sont décrites. Ces méthodes ont été utilisées pour décrire les changements acoustiques et syntaxiques dans différents contextes chez les souris mâles et les préférences de chanson chez les souris femelles.

Introduction

Par rapport aux humains, les souris produisent des vocalisations à faible et à haute fréquence, plus tard connues sous le nom de vocalisations ultrasonores (USV) au-dessus de notre gamme auditive. Les USV sont produites dans une variété de contextes, y compris de la recherche de la mère-chiot, des interactions juvéniles, des interactions adultes opposées ou du même sexe 4 , 12 . Ces USV sont composés d'un répertoire multisyllabique diversifié qui peut être catégorisé manuellement 9 ou automatiquement 10 , 11 . Le rôle de ces USV dans la communication a fait l'objet d'une enquête approfondie ces dernières années. Ceux-ci incluent l'utilisation des USV comme lectures de modèles de souris de troubles neuropsychiatriques, de développement ou de comportement 7 , 8 et des états motivationnels / émotionnels internes 13 . On pense que les USV transmettent des informations fiables sur le eL'état du mitter qui est utile pour le destinataire 14 , 15 .

En 2005, Holy et Guo 11 , ont avancé l'idée que les souris américaines adultes USV étaient organisées comme une succession d'éléments appelants multisyllabiques ou de syllabes similaires aux oiseaux chanteurs. Dans de nombreuses espèces, un répertoire multisyllabique permet à l'émetteur de combiner et de commander des syllabes de différentes manières pour augmenter l'information potentielle portée par la chanson. La variation de cette syntaxe est considérée comme ayant une pertinence éthologique pour le comportement sexuel et les préférences du couple 16 , 17 . Des études ultérieures ont montré que les souris mâles pouvaient modifier la composition relative des types de syllabes qu'ils produisaient avant, pendant et après la présence d'une femelle de 5 , 18 . C'est-à-dire que les souris mâles adultes utilisent leurs USV pour le comportement de la cour, soit pour attirerOu maintenir un contact étroit avec une femme, ou pour faciliter l'accouplement 19 , 20 , 21 . Ils sont également émis dans les interactions homme-homme, probablement pour véhiculer l'information sociale pendant les interactions 4 . Pour capturer ces changements dans les répertoires, les scientifiques mesurent généralement les caractéristiques spectrales (paramètres acoustiques, tels que l'amplitude, les fréquences, etc. ), le nombre de syllabes ou d'appels USV et la latence au premier USV. Cependant, peu d'entre eux examinent en détail la dynamique de séquence de ces USV 22 . Récemment, notre groupe a développé une nouvelle méthode pour mesurer les changements dynamiques dans les séquences de syllabes USV 23 . Nous avons montré que l'ordre de la syllabe au sein d'une chanson (à savoir la syntaxe) n'est pas aléatoire, qu'il change en fonction du contexte social et que les animaux qui écoutent détectent ces changements comme pertinents sur le plan éthologique.

Nous notons queChez de nombreux chercheurs qui étudient la communication animale n'attachent pas au terme «syntaxe» la même signification exacte que la syntaxe utilisée dans le langage humain. Pour les études de communication animale, on entend simplement une séquence de sons ordonnée, non aléatoire, avec certaines règles. Pour les humains, en outre, on sait que des séquences spécifiques ont des significations spécifiques. Nous ne savons pas si c'est le cas pour les souris.

Dans cet article et dans la vidéo associée, nous nous efforçons de fournir des protocoles fiables pour enregistrer les USV de la parade masculine dans différents contextes et effectuer des playbacks. L'utilisation de trois logiciels séquentiellement utilisés pour: 1) enregistrements automatisés; 2) détection et codage de la syllabe; Et 3) une analyse approfondie des caractéristiques de la syllabe et de la syntaxe est démontrée ( Figure 1 ). Cela nous permet d'en apprendre davantage sur la structure et la fonction USV des souris mâles. Nous croyons que de telles méthodes facilitent l'analyse des données et peuvent ouvrir de nouveaux horizons pour caractériser la communication vocale normale et anormale dans mouSe modèles de communication et les troubles neuropsychiatriques, respectivement.

Protocol

Déclaration sur l'éthique: tous les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Comité d'aide et de prise en charge des animaux institutionnels de l'Université Duke (IACUC) selon le protocole N ° A095-14-04. Note: Voir le tableau 1 dans la section " Matériaux et équipement " pour plus de détails sur les logiciels utilisés.

1. Stimuler et enregistrer les USV de la souris

  1. Préparation des mâles avant les sessions d'enregistrement
    NOTE: Les résultats représentatifs ont été obtenus à l'aide de souris mâles adultes B6D2F1 / J (7 à 8 semaines). Ce protocole peut être adapté pour toute souche.
    1. Réglez le cycle lumineux de la salle des animaux sur un cycle lumière / obscurité de 12 h, sauf indication contraire. Suivez les règles habituelles de logement de 4 à 5 mâles par cage, sauf indication contraire ou nécessaire. Trois jours avant l'enregistrement, exposez les mâles individuellement à une femme sexuellement mature et réceptive (jusqu'à 3 mâles avec une femelle par cage) de la même souche pendant la nuit.
    2. Le lendemain, retirezLa femelle de la cage masculine et la maison des mâles sans les femelles pendant au moins deux jours avant la première séance d'enregistrement pour augmenter la motivation sociale à chanter (en fonction de nos analyses anecdotiques d'essai et d'erreur).
  2. Préparation des boîtes d'enregistrement
    1. Utilisez un refroidisseur de plage (les dimensions internes sont L 27 x W 23 x H 47 cm) pour fonctionner comme un studio de correction d'atténuation sonore ( Figure 2A ). Percez un petit trou sur le dessus pour laisser passer le fil du microphone.
      REMARQUE: il est préférable d'enregistrer les animaux dans un environnement sonore atténué et visuellement isolé, afin d'enregistrer des dizaines de souris immédiatement sans les entendre ou se voir, empêcher l'enregistrement de contaminer le bruit de l'équipement ambiant et les personnes dans la pièce et d'obtenir un nettoyage Enregistrements sonores des souris ( Figure 2B ). Nous n'avons pas noté d'échos sonores ou de distorsions sur le son lors de la comparaison des vocalisations de la même souris entre l'intérieur et l'extérieur de TIl sonne la chambre d'atténuation ( Figure 2C ); Plutôt, les sons peuvent être plus forts et ont moins d'harmoniques à l'intérieur de la chambre.
    2. Connectez le microphone au fil, au fil à la carte son et à la carte son à l'ordinateur pour fonctionner avec un logiciel d'enregistrement sonore ( p. Ex. Logiciel A dans la figure 1 et tableau 1 ). Un logiciel d'enregistrement sonore adéquat est nécessaire, tel que le logiciel A qui génère des fichiers son .wav.
    3. Placez une cage vide (58 x 33 x 40 cm) dans la boîte insonorisée et réglez la hauteur du microphone afin que la membrane du microphone soit à 35 - 40 cm au-dessus du fond de la cage et que le microphone soit centré au-dessus de la cage ( Voir la figure 2A ).
  3. Configuration du logiciel d'enregistrement A ( Tableau 1 ) pour l'enregistrement continu
    1. Double-cliquez et ouvrez le logiciel A. Cliquez et ouvrez le menu "configuration" et sélectionnez le périphérique nommé, Taux d'échantillonnage (250 000 Hz), format (16 bits).
    2. Sélectionnez la clé "Trigger" et cochez "Toggle".
      REMARQUE: ce réglage permet de démarrer l'enregistrement en appuyant sur une touche (F1, F2, etc. ) tout en plaçant le stimulus dans la cage de la souris.
    3. Entrez l'ID de la souris sous le paramètre "Nom".
    4. Définissez la taille maximale du fichier dans les minutes d'enregistrement souhaitées (on règle généralement 5 minutes).
      REMARQUE: Plus les minutes sont nécessaires, plus la mémoire de stockage est nécessaire. Si le mode continu n'est pas défini, le logiciel coupe les boucles de chanson au début ou à la fin d'une séquence en fonction des paramètres définis, et donc on ne peut pas quantifier de manière fiable les séquences.
  4. Enregistrez les USV en utilisant les différents stimuli. Remarque: Chaque stimulus peut être utilisé indépendamment en fonction des besoins expérimentaux de l'utilisateur.
    1. Soulevez doucement l'animal pour être enregistré par la queue, et placez-le dans une cage sans literie (pour éviter les mouvementsSur le linge de lit) à l'intérieur de la boîte insonorisée, et placez le couvercle en métal à cage ouvert sur le dessus, avec le couvercle orienté vers le haut.
    2. Fermez la boîte acoustique atténuée et laissez l'animal habituer pendant 15 min. Effectuer la préparation des stimuli (1.4) en ce moment.
  5. Préparation des stimuli
    1. Préparation d'échantillons d'urine fraîche (UR) comme stimulus
      1. Obtenez des échantillons d'urine au maximum 5 minutes avant la séance d'enregistrement afin d'assurer un effet maximal dans l'incitation à la chanson des mâles. REMARQUE: L'urine qui a été assise plus longtemps, et surtout pendant des heures ou le jour de nuit, n'est pas aussi efficace 24 , 25 , que nous avons vérifié empiriquement 23 .
      2. Choisissez une femme ou un mâle (selon le sexe du stimulus à utiliser) dans une cage, saisissez la peau derrière le cou et retenez l'animal d'une main comme pour une procédure d'injection de médicament avec le ventre exposé.
      3. Ensuite, sélectionnez une autre cage. Et répétez la même procédure avec une autre femme ou un mâle, mais avec le même bout de coton précédemment utilisé.
        REMARQUE: cette procédure permet de mélanger l'urine d'au moins deux femelles ou mâles à partir de deux cages indépendantes sur le même bout de coton pour éviter tout effet d'oestrus ou d'autres effets individuels car on sait que le cycle d'oestrus pourrait influencer le comportement de chant 18 , 26 .
      4. Placez la pointe de coton à utiliser dans un verre propre ou une boîte en Petri en plastique.
        REMARQUE: Étant donné que le bout de coton avec de l'urine doit être utilisé dans les 5 prochaines minutes, il n'est pas nécessaire de le couvrir pour éviter l'évaporation.
    2. PréparationSur le stimulus féminin en direct (FE) comme stimulus
      1. Sélectionnez une ou deux nouvelles cages de femelles sexuellement matures. Identifiez les femelles dans le stade pro-oestrus ou oestrus par inspection visuelle (large ouverture du vagin et surround rose comme indiqué en 27 , 28 ). Séparez-les dans une cage différente jusqu'à l'utilisation.
    3. Préparation des animaux anesthésiés femelles (AF) ou des mâles (AM) comme stimulus
      1. Pour l'AF, sélectionnez une femelle dans la piscine ci-dessus (soit en pro-oestrus ou oestrus). Pour l'AM, sélectionnez un mâle à partir d'une cage de souris mâles adultes.
      2. Anesthésier la femelle ou le mâle avec une injection intrapéritonéale d'une solution de Ketamine / Xylazine (100 et 10 mg / kg respectivement).
      3. Utilisez une pommade oculaire pour éviter la déshydratation des yeux pendant que l'animal est anesthésié. Vérifiez l'anesthésie appropriée en testant le réflexe de rétraction de la patte lorsque vous êtes pincé. Placez l'animal anesthésié dans une cage propre sur une serviette en papier, l'espritH la cage sur le coussin chauffant réglée sur "chaleur minimale" pour assurer le contrôle de la température corporelle.
      4. Réutilisez les mêmes animaux jusqu'à 2 à 3 fois pour différentes sessions d'enregistrement si nécessaire avant leur réveil (habituellement environ 45 minutes). Remettez-les sur le coussin chauffant après chaque session d'enregistrement.
      5. Contrôler le taux respiratoire par inspection visuelle (~ 60 - 80 respirations par minute) et la température corporelle en touchant l'animal tous les 5 min (devrait être chaud au toucher).
    4. Lorsque vous êtes prêt à enregistrer, cliquez sur le bouton "Enregistrement" du logiciel A.
      REMARQUE: les enregistrements ne démarreront que si l'utilisateur clique sur le bouton de touche associé à chaque canal; Surveillez l'alimentation audio en direct des cages sur l'écran de l'ordinateur pour vous assurer que les animaux chantent et que les enregistrements sont correctement obtenus.
    5. Appuyez simultanément sur le bouton-clé associé de la (les) boîte (s) souhaitée (s) à enregistrer ( c'est-à-dire F1 pour la case 1) et introduisez le stimulus souhaité.
      1. Présentez l'un des stimuli comme suit. Placez la pointe de coton avec des échantillons d'urine fraîches à l'intérieur de la cage ou placez la femelle en direct dans la cage ou placez l'un des animaux anesthésiés (AF ou AM) sur le couvercle métallique de la cage.
    6. Fermez soigneusement la boîte d'enregistrement et laissez l'enregistrement passer pour le nombre de minutes préréglé ( par exemple, 5 minutes, comme décrit dans la section 1.3).
    7. Après l'enregistrement, cliquez sur le bouton rouge stop square pour arrêter l'enregistrement.
    8. Si un animal anesthésié a été utilisé comme stimulus, ouvrez la boîte d'enregistrement insonorisée, retirez l'animal anesthésié du couvercle métallique de la cage et remettez-le sur le coussin chauffant avant la prochaine session d'enregistrement, ou si vous n'utilisez plus l'animal comme contrôle de relance Toutes les 15 minutes jusqu'à ce qu'il ait retrouvé une conscience suffisante pour maintenir la recule sternale.
    9. Ouvrez la cage et retirez l'animal de test conscient, puis remettez-la dans sa cage à domicile. Nettoyer la cage d'essai avec 70% d'alcool aEt de l'eau distillée.

2. Traitement des fichiers .wav et du codage Syllable à l'aide de Mouse Song Analyzer v1.3

  1. Ouvrez le logiciel de codage B ( Figure 1 , Tableau 1 ) et placez le dossier contenant le Script de Logiciel C de "Mouse Song Analyzer" ( Figure 1 , Tableau 1 ) dans le chemin du logiciel B en cliquant sur "définir le chemin" et ajouter le dossier sur le logiciel B. Ensuite, fermez le logiciel B à enregistrer.
  2. Configurez les paramètres d'identification de la syllabe du logiciel combiné B + C. REMARQUE: Le code C du script logiciel crée automatiquement un nouveau dossier appelé «sonogrammes» avec des fichiers au format .sng dans le même dossier si les fichiers .wav sont situés. Il est généralement préférable de mettre tous les fichiers .wav de la même session d'enregistrement générée à l'aide du logiciel A dans le même dossier.
    1. Ouvrez le logiciel B configuré avec C.
      REMARQUE: cette version du logiciel B est entièrement cOmpatible avec le script logiciel C. Il ne peut être garanti que les versions ultérieures accepteront toutes les fonctions incluses dans le code actuel.
    2. Accédez au dossier d'intérêt contenant les fichiers .wav d'enregistrement à analyser à l'aide de la fenêtre "dossier actuel".
    3. Dans la "fenêtre de commande", entrez la commande "whisky".
    4. Dans la nouvelle fenêtre de whisky, observez plusieurs sections de sous-fenêtres avec des paramètres différents ( Figure 3 ), y compris "Sonogram Parameters", "Whistle Options" et tous les autres. Ajustez les paramètres pour détecter les USV. Utilisez les paramètres suivants pour détecter les syllabes USV à partir de souris de laboratoire ( p. Ex . Souches de souris B6D2F1 / J et C57BL / 6J utilisées dans nos études):
    5. Dans la section Paramètres de sonogramme, réglez la fréquence minimale à 15 000 Hz, la fréquence maximale à 125 000 Hz, la fréquence d'échantillonnage ( nombre de fréquence ) tO 256 kHz, et le seuil à 0,3.
    6. Dans la section Options de sifflet, réglez le seuil de pureté à 0,075, la durée minimale de la syllabe à 3 ms, le balayage à fréquence minimale à 20 000 Hz et la durée du filtre à 3 ms.
    7. Dans les autres sections, ajustez la Durée de Min Note à 3 ms et le Min Note Count à 1.
    8. Pour le protocole de catégorisation de la syllabe, sélectionnez les cases dans la section du milieu de la fenêtre de whis_gui:
      La catégorisation par défaut est basée sur Holy et Guo 11 et Arriaga et al. 10 , qui code syllable par le nombre de sauts de hauteur et la direction du saut: S pour une syllabe continue simple; D pour un pitch pitch pitch; U pour un saut de hauteur; DD pour deux sauts descendants séquentiels; DU pour un dowN et un saut vers le haut; Etc. Ceci sera par défaut si l'utilisateur ne sélectionne rien. L'utilisateur a la possibilité d'exécuter l'analyse sur certains types de syllabes en sélectionnant chacune des cases représentatives.
      Choisir une catégorisation de syllabe telle que décrite par Scattoni, et al. 9 , sélectionnez en outre la catégorie Split s , qui sépare ce type en plus de sous-catégories en fonction de la forme de la syllabe.
      Sélectionnez Harmonics si l' utilisateur souhaite trier les syllabes dans ceux avec ou sans harmoniques.
  3. Classer les syllabes dans les fichiers .wav d'intérêt
    1. Sélectionnez tous les fichiers .wav à partir d'une session d'enregistrement dans la partie supérieure gauche de la fenêtre de whis_gui.
    2. Cliquez sur "Obtenir des sonogrammes" au milieu de la fenêtre de whis_gui ( Figure 3 ). Un nouveau dossier contenant les sonogrammes sera créé, avec un format de fichier .sng. Sélectionnez tous les sonogrammes (fichiers .sng) en hautCoin gauche de la fenêtre de whisky. Insérez "Animal ID" et "Session ID" dans les cases ci-dessous la fenêtre du fichier sonogramme. Ensuite, cliquez sur sonogrammes de processus.
      1. Observez trois types de fichiers dans le dossier sonogramme: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (contient des informations sur les notes extraites des syllabes), "Animal ID-Session ID -Syllables.csv", (contient des valeurs de tous les Les syllabes classées, y compris leurs caractéristiques spectrales et le nombre total de syllabes détectées dans les sonogrammes), "Animal ID-Session ID -Traces.mat", (contient des représentations graphiques de toutes les syllabes).
        REMARQUE: le fichier «Animal ID-Session ID -Syllables» contient parfois un faible pourcentage (2 à 16%) de syllabes USV non classifiées qui sont plus complexes que celles sélectionnées ou que les syllabes de deux animaux se chevauchent 23 . Ceux-ci peuvent être examinés séparément du fichier de trace si nécessaire.

3. Quantification de Syllable Acoustic Structure and Syntax

REMARQUE: les instructions pour les étapes à suivre pour les analyses de syntaxe initiales sont incluses dans "LISEZ-MOI!" Feuille de calcul du fichier «Guide de l'analyse des morceaux v1.1.xlsx», notre calculatrice personnalisée E ( figure 1 , tableau 1 ).

  1. Ouvrez la sortie du fichier C du script logiciel "Animal ID-Session ID -Syllables.csv" obtenu dans la section ci-dessus avec le logiciel de calcul D ( Figure 1 , Tableau 1 ). Il contient le nombre total de syllabes détectées dans tous les sonogrammes et toutes leurs caractéristiques spectrales.
  2. Si ce n'est pas encore converti, dans le logiciel de tableur D, convertissez ce fichier .csv en séparation de colonnes dans le logiciel D afin de placer chaque valeur dans des colonnes individuelles.
  3. Ouvrez le fichier «Guide de l'analyse des morceaux v1.1.xlsx» également dans le logiciel D. Ensuite, cliquez sur leE template spreadsheet et copiez et collez les données du fichier «Animal ID-Session ID -Syllables.csv» dans cette fiche, comme recommandé dans les instructions de la feuille de modèle. Supprimez les lignes avec la catégorie de syllabes «Non classifiée».
  4. Après avoir supprimé les lignes «Non classifiées», copiez et recalculez les données ISI (inter-syllabes) dans la colonne O dans la colonne E. Deuxièmement, copiez toutes les données de la colonne A à N dans la feuille de calcul «Données».
  5. Dans la feuille de calcul de données, entrez les ID d'animal (colonne AF) et la durée d'enregistrement (en minutes, colonne AC).
    REMARQUE: les identifiants d'animaux doivent correspondre à ceux entrés dans la configuration d'enregistrement. Le fichier détecte les caractères saisis et comparez-le au nom des fichiers .wav.
  6. Déterminez le seuil ISI pour définir une séquence en utilisant la feuille de calcul intitulée "Density ISI", le résultat 'ISI plot'.
    NOTE: Dans notre étude précédente 23 , nous avons réglé le seuil à deux niveauxRd déviations par rapport au centre du dernier pic. Il s'agissait d'intervalles longs (LI) de plus de 250 ms, qui séparaient différents combats de chansons dans une session de chant.
  7. Affichez les résultats principaux dans la feuille de calcul «Caractéristiques» (regroupant toutes les caractéristiques spectrales mesurées à partir de chaque animal).
    REMARQUE: si l'utilisateur a utilisé le paramètre de catégorie de syllabe par défaut dans le script logiciel C décrit dans la section 2.8.9, les syllabes sont ensuite classées en 4 catégories comme décrit ci-dessus et dans Chabout, et al. 23 : 1) syllabe simple sans sauts de hauteur, «s»; 2) syllabes à deux notes séparées par un seul saut vers le haut («u»); 3) syllabes à deux notes séparées par un seul saut vers le bas («d»); Et 4) syllabes plus complexes avec deux ou plusieurs sauts de hauteur entre les notes («m»).
  8. Pour les valeurs de syntaxe, cliquez sur la feuille de calcul "Global Probabilities" qui calcule les probabilités de chaque paire de sTypes de transition possibles indépendamment des syllabes de départ, en utilisant l'équation suivante 23 .
    P (Occurrence d'un type de transition) = Nombre total d'occurrences d'un type de transition / Nombre total de transitions de tous types
  9. Cliquez sur la feuille de calcul "Probabilités conditionnelles" pour calculer les probabilités conditionnelles pour chaque type de transition par rapport aux syllabes de démarrage, qui utilise l'équation suivante:
    P (occurrence d'un type de transition étant donné la syllabe de départ) = Nombre total d'occurrences d'un type de transition / Nombre total d'occurrences de tous les types de transition avec la même syllabe de départ
  10. Pour tester si et dont les probabilités de transition ci-dessus diffèrent de celles non aléatoires, en utilisant un modèle Markov de premier ordre, suivant l'approche de 23 , pour utiliser un logiciel personnalisé F ( p. Ex. Décodage de syntaxe dans le studio R, figure 1 , <Strong> Tableau 1) avec les scripts R suivants: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R pour les groupes dans différentes conditions; Ou Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R pour entre les groupes dans les mêmes conditions.
  11. Effectuer un test du Chi-carré, ou un autre test de votre préférence, pour tester les différences statistiques dans les probabilités de transition du même animal dans un contexte différent (par paire), en suivant l'approche en 23 .
    REMARQUE: Plus de détails sur le modèle statistique utilisé pour comparer la syntaxe entre les groupes se trouvent en 23 . Les chercheurs peuvent utiliser d'autres approches pour analyser les probabilités globales ou conditionnelles de transition qu'ils ont développées ou d'autres.
  12. Pour afficher graphiquement les séquences sous forme de diagrammes de syntaxe, entrez les valeurs dans un logiciel de graphe de réseau G (voir la figure 1 , tableau 1 ), avec des noeuds désignant différentes catégories de syllabesLes gories et la couleur de la flèche et / ou l'épaisseur du pixel représentant des plages de valeurs de probabilité entre les syllabes.
    REMARQUE: Pour plus de clarté, pour les graphiques de probabilité globaux, nous montrons uniquement des transitions supérieures à 0,005 (plus de 0,5% de l'occurrence de hasard). Pour les probabilités conditionnelles, nous utilisons un seuil de 0,05 parce que chaque probabilité dans le «modèle global» est inférieure, compte tenu du fait que nous divisons par le nombre total de syllabes et pas seulement par un type de syllabe spécifique.

4. Édition de morceau et test de préférence pour un type de chanson

REMARQUE: Les reproductions de USV peuvent être utilisées pour tester expérimentalement la réponse comportementale d'un animal, y compris la préférence pour un type de chanson spécifique. Étant donné que les préférences féminines peuvent changer en fonction de l'état d'oestrus, pour les femmes, assurez-vous qu'elles sont dans le même état d'oestrus avant de tester comme suit:

  1. Préparer les femmes ayant une expérience sexuelle plusieurs jours avant l'expérience de lecture Exposer les femelles sexuellement matures (> 7 semaines) à un mâle pendant 3 jours avant les expériences pour déclencher l'oestrus (effet Whitten 28 ), en les plaçant dans une cage de séparation (plastique solide transparent avec des trous forés) permettant à la femelle de voir et Sentir le mâle mais prévenir les rapports sexuels.
  2. Surveillez le cycle de l'oestrus, et lorsque le pro-oestrus ou l'oestrus est évident (ouverture vaginale et surround rose comme indiqué en 27 ), remettre les femelles dans leur propre cage. Ils sont prêts à être testés le lendemain.
  • Préparez les fichiers de morceaux pour la lecture
    1. Utilisez les fonctions copier et coller dans un logiciel de traitement de son H ( ex: SASLap Pro, Figure 1 , Tableau 1 ) pour créer deux fichiers .wav édités avec les conditions souhaitées pour les stimuli. Pour éviter le nombre de vocalisations en tant que variable, assurez-vous que les deux fichiers sonores contiennent le même nombre de sYllables et la longueur des séquences (morceaux de chanson) des mâles ou des femelles identiques ou différents des contextes souhaités ( p. Ex. UR).
    2. Ouvrez le premier fichier contenant la musique de la condition 1 dans le logiciel H. Ensuite, allez dans Fichier> Spéciaux> Ajouter les chaînes du fichier et sélectionnez le deuxième fichier son à tester à partir de la condition 2. Cela crée 2 canaux, un pour chaque condition.
    3. Ajustez le volume visuellement si nécessaire pour vous assurer que les volumes des deux fichiers s'accordent, en allant dans Edit> Volume.
    4. Ensuite, passez à Édition> Format> Conversion de fréquence d'échantillonnage et sélectionnez convertir de 250 000 Hz à 1 000 000 Hz pour transformer les fichiers .wav d'une fréquence d'échantillonnage de 256 kHz à 1 MHz. Cette étape est nécessaire pour que le périphérique de lecture lise les fichiers .wav.
    5. Enregistrez ces nouveaux fichiers en tant que fichiers de test à lire. Assurez-vous d'identifier quelle chanson est dans quel canal (1 ou 2). Pour plus de clarté, nommez-le "file name.wav".
    6. Aller à EXit> Format> Échangez les canaux et échangez les deux canaux. Enregistrez les versions échangées à l'aide d'un nom différent. REMARQUE: ceci sera la copie inverse avec les canaux inversés, nommés plus tard 'file name_swapped.wav'.
  • Préparer l'appareil de lecture
    1. Nettoyez l'appareil de lecture "Y-maze" avec 70% d'alcool suivi d'eau distillée. Séchez-le avec des serviettes en papier. Notre labyrinthe Y est un appareil en plastique noir résistant opaque fait à la main, avec des bras de 30 cm de long et deux trous forés aux extrémités du labyrinthe pour permettre au haut-parleur ultrasonore de s'adapter au niveau du sol des bras ( Figure 4A ).
    2. Assurez-vous que les haut-parleurs sont dans leurs positions appropriées et connectés à la carte son et que la carte est connectée à l'ordinateur.
    3. Ouvrez le logiciel A, sélectionnez Jouer> Périphérique et sélectionnez le périphérique de la carte son de la lecture. Sélectionnez "utiliser le taux d'en-tête du fichier". Aller à Play> Playlist et charger le fichier d'intérêt contenant les deux chaNnels ( c.-à-d. "File.wav"). Sélectionnez "mode boucle". Configurez le magnétoscope au-dessus du labyrinthe pour couvrir tout le labyrinthe.
  • Effectuer l'expérience de lecture
    1. Placez le test féminin dans le labyrinthe pour une période d'habitude de 10 minutes. Après 10 minutes, si la femelle ne se trouve pas dans le bras de démarrage, pousser doucement la femme vers le bras de départ et fermer la fenêtre de séparation en plastique.
    2. Sélectionnez le fichier préparé ("fichier.wav") pour le lire et le lire. Commencez l'enregistrement vidéo et assurez-vous d'identifier quel canal est positionné sur lequel le bras de Y-maze ( c'est-à-dire : UR à gauche ou FE dans le bras droit) avec une note papier dans le champ de visionnement vidéo.
    3. Permettre à la femme d'entendre les chansons en mode boucle et d'explorer le labyrinthe pendant un nombre souhaité de minutes ( c'est-à-dire 5 min): il s'agit d'une session. Retournez la femelle dans le bras de départ. Laissez-la reposer pendant 1 min pendant la préparation de la prochaine session. RemToute trace d'urine et excréments avec de l'eau distillée.
    4. Chargez le fichier "file_swapped.wav". Changez l'emplacement des notes papier pour l'enregistrement vidéo. Déplacez le côté gauche vers la droite et vice versa. Après 1 min, jouez le fichier. Libérez la femelle pour la deuxième session .
    5. Répétez les étapes 4.4.3 à 4.4.4 pour un total de 4 sessions x 5 minutes pour contrôler la détection de biais potentiel pendant le test. Arrêtez l'enregistrement vidéo à la fin de toutes les sessions en cliquant sur le bouton d'arrêt rouge. Nettoyez le labyrinthe avec 70% d'alcool et d'eau distillée entre les femelles.
    6. Répétez toutes les étapes avec différents exemplaires de chanson une semaine plus tard avec les mêmes femelles pour obtenir des résultats suffisants pour vérifier la fiabilité des résultats.
    7. Plus tard, regardez les vidéos et utilisez la minuterie sur la vidéo et un chronomètre pour mesurer le temps passé par les femelles dans chaque bras pour chaque session. Analyser statistiquement les données résultantes pour les préférences de chanson possibles.
  • Representative Results

    Dans le présent protocole, des changements dans le comportement vocal et la syntaxe des souris mâles B6D2F1 / J ont été caractérisés. En général, en utilisant ce protocole, nous avons pu enregistrer, en moyenne par homme par session de 5 minutes, des syllabes classées 675 ± 98,5 en réponse à une UR féminine, 615,6 ± 72 en FE, 450 ± 134 dans AF, 75,6 ± 38,9 en AM et 0,2 ± 0,1 en UR masculin (n = 12 mâles). Les taux étaient de ~ 130 syllables / min pour les femmes UR, ~ 120 syllables / min pour FE, ou ~ 100 syllables / min pour les contextes AF ( Figure 5A ). Les hommes produisent une quantité beaucoup plus grande de syllabes en réponse à l'urine fraîchement recueillie par rapport à l'urine collectée pendant la nuit 10 , 23 . Les mâles chantent également beaucoup moins en présence d'une urine masculine ou fraiche d'anesthésie Figure 5A ). Les hommes changent également leur répertoire dans le contexte 23 . Par exemple, les mâles B6D2F1 / J augmentent de manière significative Production de syllabes de catégorie «m» de saut à pas multiple dans l'état de l'urine féminine ( figure 5B ). Ils modifient également les caractéristiques acoustiques des syllabes individuelles à travers le contexte. Par exemple, les mâles B6D2F1 / J chantent des syllabes à une amplitude et une largeur de bande plus élevées dans le contexte de l'urine féminine et une plus grande pureté spectrale dans le contexte féminin éveillé par rapport aux autres ( figure 6 ) 23 .

    Ce protocole fournit également un moyen de mesurer les caractéristiques dynamiques de la séquence et donc des changements de syntaxe. En utilisant une méthode adaptée de Ey, et al. 22 , nous utilisons l'ISI pour définir les écarts entre les séquences ( Figure 7A ) 23 , puis utiliser les lacunes pour distinguer et analyser les motifs temporels des séquences syllabes. Nous avons montré que des longueurs de séquence plus longues sont produites dans le contexte féminin réveillé ( Figure 7B )F "> 23. Cette technique nous permet de calculer le rapport des séquences complexes (composé d'au moins 2 occurrences du type" m "syllable) par rapport à des séquences simples (composées d'un ou d'un type" m ", et donc principalement de" S "). Nous avons constaté qu'avec les mâles B6D2F1 / J, le contexte urinaire féminin a déclenché un ratio plus élevé par rapport aux autres ( Figure 7C ) 23 , indiquant qu'ils produisaient des syllabes plus complexes dans l'état de l'urine féminine, mais aussi que ces syllabes étaient distribuées Sur plus de séquences.

    Nous sommes également en mesure de calculer les probabilités de transition conditionnelle d'un type de syllabe à l'autre (24 types de transition total incluant les transitions depuis et vers l'état "silence") 23 . Nous avons constaté que dans différents contextes, le choix des souris pour les types de transition pour les syllabes de départ donnée diffère et qu'il y a plus de division de syntaxeErsité dans l'état de l'urine féminine ( figure 8 ) 23 . Ces observations sont conformes aux rapports précédents qui montrent que les hommes peuvent modifier les caractéristiques acoustiques ou la composition du répertoire de leurs vocalisations en réponse à différents stimuli et expériences 4 , 5 , 24 .

    Enfin, le présent protocole fournit des conseils pour tester les préférences féminines avec les reproductions. Nous avons constaté que les femelles B6D2F1 / J préfèrent des chansons plus complexes (contenant 2 ou plus de syllabes "m") par rapport aux chansons simples 23 . La plupart des femmes ont choisi de rester plus souvent sur le côté du labyrinthe Y qui a joué les chansons complexes ( figure 4B ).

    Figure 1
    Figure 1: diagramme de flux de SofTachez l'utilisation et les analyses. Chaque programme et code associé reçoit un nom de lettre pour expliquer son identité et son utilisation dans le texte principal. In () sont les programmes spécifiques que nous utilisons dans notre protocole. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 2
    Figure 2: Configurer pour enregistrer des morceaux de souris mâles. (A) Image d'une boîte d'enregistrement d'atténuation sonore et configurée pour enregistrer les vocalisations USV. (B) Exemple de sonogramme d'un enregistrement réalisé avec le logiciel A ( Tableau 1 ), y compris les caractéristiques spectrales détaillées calculées par "Mouse Song Analyzer v1.3": durée, intervalle inter-syllabes (ISI), fréquence de crête min (Pf min), Fréquence de crête maximale (Pf max), début de fréquence de crête (début Pf), fréquence de pointe Fin (fin Pf) et bande passante. (C) Sonogrammes d'un autre chant masculin à une femelle en direct, à l'intérieur de la boîte d'atténuation sonore et à l'extérieur de la boîte sur le banc de laboratoire dans la même pièce. Nos observations anecdotiques indiquent que les enregistrements dans la boîte du même animal montrent un volume plus important (intensité plus forte) et moins d'harmoniques, mais aucune preuve d'échos dans la boîte sans mousse sonore. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    figure 3
    Figure 3: Capture d'écran de la fenêtre "Mouse Song Analyzer v1.3" whis_gui montrant les différentes options disponibles pour les analyses. Les paramètres présentés sont ceux utilisés pour enregistrer les USV mâles dans les figures et les analyses de données présentées (à l'exception de la durée minimale de la note était de 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: Choix féminins entre les reproductions de morceaux complexes et simples. (A) Image de l'appareil Y-labyrinthe utilisé et mesures dimensionnelles. (B) Le temps passé par les femelles dans chaque bras, en jouant soit à partir d'une chanson complexe (orchidée féminine) ou plus simple (éveillée féminine) du même mâle. Les données sont présentées pour n = 10 souris femelles B6D2F1J comme moyenne ± SE, avec des valeurs individuelles également indiquées; 9 des 10 femelles ont montré une préférence pour la syllabe plus complexe / la chanson de séquence. * P <0,05 test jumelé de l'élève. Figure modifiée de Chabout, et al. 23 avec la permission.Vide "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5: nombre de syllabes émis et répertoire dans toutes les conditions . (A) Taux de production de syllabe chez les hommes dans différents contextes. (B) Répertoire des compositions de mâles en présence d'urine féminine (UR), de femmes femelles anesthésiées (FA), de femmes éveillées (FE) et anesthésiées (AM). Les données sont présentées sous la forme moyenne ± SEM. * P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 pour le test t d'étudiant jumelé post-hoc après correction Benjamini et Hochberg (n = 12 mâles). Figure de Chabout, et al. 23 avec la permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Together.within-page = "1"> Figure 6
    Figure 6: Exemples de caractéristiques spectrales dans un contexte différent. (A) Amplitude. * P <0,025 pour le test post-hoc jumelé après la correction. (B) Fréquence ou bande passante. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 après correction. (C) Pureté spectrale des syllabes. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 après correction. Abréviations: urine féminine (UR), femelle anesthésiée (FA), femme réveillée (FE) et mâle anesthésié (AM). Figures modifiées de Chabout et al. 23 avec la permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    37fig7.jpg "/>
    Figure 7: Mesures de séquence. (A) Utilisation de l'ISI pour séparer la séquence. L'ISI (SI) court et l'ISI moyen (MI) sont utilisés pour séparer les syllabes dans une séquence, et l'ISI long sur 250 ms (LI) séparent deux séquences. (B) Longueur des séquences, mesurées en nombre de syllabes par séquence, produites par des hommes dans différents contextes. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0.0001 après correction. (C) Ratio de chansons complexes sur des chansons simples produites par des hommes dans différents contextes. * P <0,041; ** p <0,005; *** p <0.0001 après correction. Les données sont présentées comme moyen ± SEM (n = 12 mâles). Figure de Chabout, et al. 23 avec la permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.


    Figure 8: Diagrammes de syntaxe Syllable de séquences basées sur des probabilités conditionnelles pour chaque contexte. L'épaisseur de la flèche est proportionnelle à l'occurrence de probabilité conditionnelle d'un type de transition dans chaque contexte moyen de n = 12 mâles: P (occurrence d'une transition donnée par la syllabe de départ). Pour plus de clarté, les transitions rares inférieures à une probabilité de 0,05 ne sont pas affichées. Figure de Chabout, et al. 23 avec la permission. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Discussion

    Ce protocole fournit des approches pour recueillir, quantifier et étudier les vocalisations de la parade masculine dans le laboratoire à travers une variété de stimuli principalement liés à la femme. Comme présenté précédemment dans Chabout, et al. 23 et dans les résultats représentatifs, l'utilisation de cette méthode nous a permis de découvrir des vocalisations et une syntaxe dépendantes du contexte qui importent les femelles réceptrices. La standardisation de ces stimuli fournira la collecte d'un nombre fiable de USV et permettra des analyses détaillées des chansons et des répertoires de la parade masculine.

    Quand une femelle en direct est présente avec le mâle, le protocole ne nous permet pas d'identifier clairement l'émetteur des vocalisations. Cependant, des études antérieures ont montré que la majorité des vocalisations émises dans ce contexte étaient les hommes 26 , 29 . La plupart des études utilisant un conspécifique (masculin ou féminin)Comme stimulant pour les hommes, croient que la quantité de vocalisations féminines dans ces contextes est négligeable 4 , 5 , 22 , 30 . Cependant, un article récent a utilisé la triangulation pour localiser les vocalisations de l'émetteur dans les conditions logées dans le groupe 31 et a montré que dans une dyade, la femelle contribue à ~ 10% des USV. Dans le présent protocole, l'utilisation de la femme anesthésiée permet à l'utilisateur d'étudier les vocalisations masculines en présence d'une femme sans son vocalisation. Contrairement aux attentes de cette étude récente 31 , nous n'avons trouvé aucune différence dans le nombre de syllabes émis entre les conditions FE et AF 23 . Il est possible que les femelles vivantes ne contribuent pas de manière significative aux enregistrements ou que les mâles vocalisent moins en présence de femelles vivantes contre femelles anesthésiéesAles. Néanmoins, nous pensons que les expériences futures devraient considérer l'utilisation de cette méthode de triangulation pour évaluer l'effet potentiel de la contribution féminine.

    Il existe d'autres logiciels disponibles qui peuvent faire quelques-unes des étapes que nous avons décrites, bien que nous ne croyions pas suffisamment aux questions que nous avons posées en utilisant une combinaison de trois programmes: le logiciel A, le script logiciel Mouse Song Analyzer C en utilisant le logiciel B, le Logiciel d'analyse de syntaxe à l'aide d'un calcul de tableaux de calcul personnalisé calculs D + E et décoteur de syntaxe à l'aide de R. Par exemple, un document récent proposait un logiciel appelé VoICE qui permet à l'utilisateur d'extraire les variables acoustiques automatiquement à partir des sonogrammes ou directement sur des unités qui avaient été manuellement Sélectionné par l'utilisateur 32 . Mais, les analyses automatisées ou semi automatisées des séquences ne sont pas aussi détaillées que notre approche. Certains logiciels commerciaux peuvent analyser automatiquement les caractéristiques acoustiques, mais ne fournissent pas d'automateClassification des syllabes; L'utilisateur doit ensuite trier les différentes syllabes. Grimsley, Gadziola, et al. 33 ont développé un programme d'organe vocal vocal virtuel basé sur une table qui regroupe des syllabes basées sur des caractéristiques acoustiques partagées, mais ne fournit pas une détection automatique des syllabes. Leur programme 34 est unique en ce sens qu'il crée de nouvelles séquences à partir de chansons enregistrées à l'aide de modèles Markov, et a donc des fonctionnalités plus avancées que l'édition simple.

    La plupart des études de communication antérieures sur les souris se sont concentrées sur le côté de l'émetteur 35 , 36 . Peu d'études ont exploré le côté du récepteur 30 , 37 , 38 . Les protocoles de lecture et de discrimination fournissent un test simple pour étudier le côté du récepteur, tel que décrit récemment par Asaba, Kato, etAl. 39 . Dans cette étude, les auteurs ont utilisé une boîte de test à deux choix séparée avec de la mousse acoustique au lieu de la boîte de labyrinthe Y décrite ici. Les deux configurations de choix présentent des avantages et des inconvénients. Tout d'abord, le labyrinthe Y isole le son d'un bras à l'autre, mais la boîte à deux choix le fait. Cependant, en utilisant le design Y-maze, l'animal peut évaluer rapidement les deux chansons jouées simultanément et passer à l'image préférée. Néanmoins, les expériences de lecture en général aident les expérimentateurs à déterminer la signification et donc les fonctions des vocalisations générées pour les animaux conspécifiques. En conclusion, après avoir maîtrisé les techniques de ce protocole et des analyses, les lecteurs devraient pouvoir répondre à de nombreuses questions qui influent sur le contexte, la génétique et la neurobiologie des USV de souris.

    À l'aide de souris B6D2F1 / J, les stimuli associés à la femelle déclenchent presque toujours des USV chez les hommes que nous avons testés dans notre laboratoire. Il est essentiel pour le collègeCt assez de syllabes (> 100 en 5 min) pour pouvoir obtenir une analyse statistique forte. Pour le dépannage, si aucun USV n'est enregistré (ou pas assez), vérifiez la configuration pour vous assurer que les sons sont enregistrés. Faites une inspection en direct de ce qui se passe dans la cage lors de l'enregistrement en regardant le sonogramme en temps réel sur l'écran de l'ordinateur après l'introduction du stimulus. Sinon, essayez de ré-exposer le mâle à une femme sexuellement mature / réceptive pendant la nuit, puis les loger seul pendant plusieurs jours ou jusqu'à une semaine avant d'enregistrer à nouveau. Sur la base d'observations anecdotiques, nous constatons que certains hommes chantent beaucoup sur une journée (pour presque 5 minutes entières), et pas beaucoup le lendemain, puis encore un autre jour. Nous ne connaissons pas la raison pour laquelle il existe une telle variation dans la matière, mais nous supposons qu'il est probablement motivant ou saisonnier chez les mâles et l'état d'oestrus pour l'urine féminine. Si aucun USV n'est enregistré, essayez d'enregistrer l'animal sur plusieurs jours pour reprendre ces effets variables. UnlDans les oiseaux chanteurs, nous n'avons pas noté de différences manifestes quant à la quantité de chant en fonction de l'heure. Nous trouvons que les mâles ne chantent pas beaucoup (<100 syllabes en 5 min) avant qu'elles aient 7 semaines.

    Les méthodes de détection présentées ici peuvent extraire des milliers de syllabes et tous les paramètres acoustiques en quelques minutes. Mais comme toute méthode de détection automatique, elle est très sensible au bruit de fond. L'utilisation du logiciel de détection Mouse Song Analyzer avec des enregistrements bruyants (par exemple à partir d'animaux enregistrés avec literie) peut nécessiter un ajustement du seuil de détection pour permettre une plus grande flexibilité. Cependant, cela augmentera également le nombre de syllabes fausses positives et la détection automatique pourrait échouer. Dans de telles circonstances, le codage manuel peut être utilisé.

    Comme indiqué précédemment, le nombre, les répertoires et la latence des vocalisations sont largement variables en fonction de la contrainte, il se peut donc qu'il soit nécessaire de modifier les paramètres (longueur d'enregistrement,Stimulus, détection de syllabes automatiques, etc. ) pour certaines contraintes pour assurer des enregistrements optimaux pour les analyses statistiques.

    Disclosures

    Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

    Acknowledgments

    Ce travail a été soutenu par les fonds de l'Institut médical Howard Hughes à EDJ. Nous remercions le Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Université Paris sud XI - FRANCE) pour nous fournir le matériel du haut-parleur. Nous remercions également les membres du laboratoire Jarvis pour leur soutien, discussions, corrections et commentaires sur ce travail, en particulier Joshua Jones Macopson pour l'aide avec des chiffres et des tests. Nous remercions le Dr Gustavo Arriaga pour l'aide du logiciel Mouse Song Analyzer, en le mettant à la V1.3 et d'autres aspects de ce protocole. V1.0 du logiciel a été développé par Holy et Guo, et v1.1 et v1.3 par Arriaga.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sound proof beach cooler See Gus paper has more info on specific kind Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
    Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 Includes extension cable 
    Ultrasound Gate 1216H sound card Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34175 12 channel sound card
    Ultrasound Gate Player 216H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #70117 2 channels playback player
    Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #60103 2 playback speakers
    Test cage  Ace #PC75J 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
    plexiglas separation home made - 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
    Video camera Logitech C920 logitech HD Pro webcam C920
    Heat pad  Sunbeam 722-810-000
    Y-maze  Home made - Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
    Tweezers
    Software
    Avisoft Recorder (Software A) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    MATLAB R2013a (Software B) MathWorks - MATLAB R2013a (8.1.0.604)
    Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_
    v1.3-2015-03-23.zip
    Microsoft Office Excel 2013 (Software D) Microsoft - Microsoft Office Excel
    Song Analysis Guide v1.1 (Software E) Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
    Syntax decorder v1.1 (Software F) Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    Graphiz (Software G) AT&T Research and others  http://www.graphviz.org
    Avisoft SASLab (Software H) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    Reagents
    Xylazine (20 mg/mL) Anased -
    Ketamine HCl (100 mg/mL) Henry Schein #045822
    distilled water
    Eye ointment  Puralube Vet Ointment  NDC 17033-211-38
    Cotton tips
    Petri dish

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    References

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    Éliminer et analyser les chansons de la vocalisation par ultrasons de souris masculine (USV)
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    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).More

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).

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