Mus producerer et komplekst multisyllabelt repertoire af ultralyd vocalizations (USVs). Disse USV'er anvendes i vid udstrækning som læsninger til neuropsykiatriske lidelser. Denne protokol beskriver nogle af de metoder, vi har lært og udviklet til konsekvent at fremkalde, indsamle og analysere de akustiske egenskaber og syntaksen af musesange.
Mus producerer ultralyd vocalizations (USV'er) i en række sociale sammenhænge gennem udvikling og voksenalder. Disse USV'er anvendes til moderpuppersøgning 1 , ungdomsinteraktioner 2 , modsatte og samme kønsinteraktioner 3 , 4 , 5 og territoriale interaktioner 6 . I flere årtier er USV'erne blevet brugt af efterforskere som proxyer til at studere neuropsykiatriske og udviklingsmæssige eller adfærdsmæssige lidelser 7 , 8 , 9 og for nylig at forstå mekanismer og udvikling af vokalkommunikation blandt hvirveldyr 10 . Inden for de seksuelle interaktioner producerer voksne mandlige mus USV sange, som har nogle funktioner, der ligner sangfugle i sangfugle 11 . Anvendelsen af en sådan multisyllabisk reperToires kan øge potentiel fleksibilitet og information, de bærer, da de kan varieres i, hvordan elementer organiseres og rekombineres, nemlig syntaks. I denne protokol beskrives en pålidelig metode til at fremkalde USV sange fra hanmus i forskellige sociale sammenhænge, såsom eksponering for frisk kvindelig urin, bedøvede dyr og østrushunner. Dette indbefatter betingelser for at fremkalde en stor mængde stavelser fra musene. Vi reducerer optagelse af omgivende lyde med billige lydkamre og præsenterer en kvantificeringsmetode til automatisk detektering, klassificering og analyse af USV'erne. Sidstnævnte omfatter evaluering af call rate, vokal repertoire, akustiske parametre og syntaks. Forskellige fremgangsmåder og indsigt i brugen af afspilninger for at studere et dyrs præference for specifikke sangtyper er beskrevet. Disse metoder blev anvendt til at beskrive akustiske og syntaksændringer på tværs af forskellige kontekster hos hanmus og sangpræferencer hos hunmus.
I forhold til mennesker producerer mus både lave og højfrekvente vokaliseringer, de senere kendt som ultralydvokaliseringer (USV'er) over vores høreområde. USV'erne produceres i en række sammenhænge, herunder fra moderpuppersøgning, ungdomsinteraktioner, til modsatte eller samme køn voksne interaktioner 4 , 12 . Disse USV'er er sammensat af et mangfoldigt multisyllabisk repertoire, der kan kategoriseres manuelt 9 eller automatisk 10 , 11 . Disse USVs rolle i kommunikationen har været under stigende efterforskning de seneste år. Disse omfatter at bruge USV'erne som udlæsninger af musemodeller af neuropsykiatriske, udviklingsmæssige eller adfærdsmæssige forstyrrelser 7 , 8 og interne motiverende / følelsesmæssige tilstande 13 . USV'erne menes at formidle pålidelige oplysninger om eMitters tilstand, der er nyttig for modtageren 14 , 15 .
I 2005 avancerede Hellige og Guo 11 ideen om, at voksne mandlige USV'er blev organiseret som en række multisyllabiske opkaldselementer eller stavelser, der lignede sangfugle. I mange arter giver et multisyllabisk repertoire emitteren mulighed for at kombinere og bestille stavelser på forskellige måder for at øge den potentielle information, der bæres af sangen. Variation i denne syntaks antages at have en etologisk relevans for seksuel adfærd og mage præferencer 16 , 17 . Efterfølgende undersøgelser viste, at hanmus kunne ændre den relative sammensætning af stavelsetyper, de producerer før, under og efter tilstedeværelsen af en kvinde 5 , 18 . Det vil sige, at de voksne hanmus bruger deres USV'er til domstolsadfærd, enten for at tiltrækkeEller opretholde tæt kontakt med en kvinde eller for at lette parringen 19 , 20 , 21 . De udsendes også i mandlige interaktioner, sandsynligvis at formidle sociale oplysninger under interaktioner 4 . For at fange disse ændringer i repertoirerne måler forskerne sædvanligvis spektralfunktionerne (akustiske parametre, såsom amplitude, frekvenser osv. ), Antal USVs stavelser eller opkald og latens til den første USV. Men få ser faktisk på sekvensdynamikken af disse USV'er i detaljer 22 . For nylig udviklede vores gruppe en ny metode til at måle dynamiske ændringer i USV-stavelsesekvenserne 23 . Vi viste at stavelsesordre inden for en sang om (nemlig syntaks) ikke er tilfældig, at den ændres afhængigt af den sociale kontekst, og at de lyttende dyr opdager disse ændringer som etologisk relevante.
Vi bemærker thHos mange forskere, der studerer dyrekommunikation, vedhæfter ikke udtrykket "syntaks" den samme nøjagtige betydning som syntaks anvendt i menneskelig tale. Til dyre kommunikationsstudier betyder vi simpelthen en ordnet, ikke-tilfældig, lydsekvens med nogle regler. For mennesker er der også kendte specifikke sekvenser at have specifikke betydninger. Vi ved ikke, om det er tilfældet med mus.
I dette dokument og tilhørende video sigter vi på at levere pålidelige protokoller til optagelse af hanmusens uskyldige USV'er i forskellige sammenhænge og udføre afspilninger. Anvendelsen af tre sekventielt anvendte software til: 1) automatiske optagelser; 2) stavelsesdetektering og kodning; Og 3) dybtgående analyse af stavelsesfunktionerne og syntaxen er demonstreret ( figur 1 ). Dette giver os mulighed for at lære mere om mannlige mus USV struktur og funktion. Vi mener, at sådanne metoder letter dataanalyser og kan åbne nye horisonter for at karakterisere normal og unormal vokal kommunikation i mouSe modeller af kommunikation og neuropsykiatriske lidelser, henholdsvis.
Denne protokol tilvejebringer metoder til at indsamle, kvantificere og studere mandlige museprocedurer i laboratoriet på tværs af en række primært kvindelige relaterede stimuli. Som tidligere beskrevet i Chabout et al. 23 og i de repræsentative resultater fik brugen af denne metode os til at opdage kontekstafhængige vokaliseringer og syntaks, der betyder noget for de modtagende kvinder. Standardiseringen af disse stimuli vil tilvejebringe indsamling af et pålideligt antal USV'er og tillade detaljerede analyser af mandens hoftsange og repertoirer.
Når en levende kvinde er til stede hos hanen, tillader protokollen os ikke klart at identificere emitteren af vokaliseringen. Tidligere undersøgelser viste imidlertid, at størstedelen af vokaliseringen udsendt i en sådan sammenhæng var af mand 26 , 29 . De fleste af undersøgelserne bruger en konspecifik (mand eller kvinde)Som et stimulus for mændene mener at mængden af kvinders vokaliseringer i disse sammenhænge er ubetydelig 4 , 5 , 22 , 30 . Imidlertid har en nylig papir anvendt triangulering til lokalisering af vokaliseringen af emitteren i gruppehusbetingelser 31 , og viste at i en dyad bidrager kvinden til ~ 10% af USV'erne. I den foreliggende protokol tillader brugen af den bedøvede kvindelige bruger at studere mandlige vokaliseringer i nærværelse af en kvinde uden hendes vokalisering. I modsætning til forventningerne til denne nylige undersøgelse 31 fandt vi ingen forskel i antallet af stavelser emitteret mellem FE og AF-betingelserne 23 . Det er muligt, at levende kvinder ikke bidrager væsentligt til optagelserne, eller at mændene vokaliserede mindre i nærværelse af levende kvinder mod bedøvet females. Ikke desto mindre mener vi, at fremtidige eksperimenter bør overveje anvendelsen af denne trianguleringsmetode for at vurdere den potentielle virkning af kvinders bidrag.
Der er anden software til rådighed, der kan gøre nogle af de trin, vi har skitseret, selv om vi ikke tror på en måde, der er tilstrækkelig til de spørgsmål, vi stillede ved hjælp af en kombination af tre programmer: Software A, Mouse Song Analyzer software script C ved hjælp af software B, Syntaxanalyseprogrammer ved hjælp af en D + E-beregning af brugerdefinerede regnearksoftware og syntetisk dekorator ved hjælp af R. For eksempel har et nyere papir foreslået en software med navnet VoICE, der giver brugeren mulighed for automatisk at udvinde akustiske variabler fra sonogrammerne eller direkte på enheder, der var manuelt Valgt af brugeren 32 . Men de automatiserede eller semi-automatiserede sekvensanalyser er ikke så detaljerede som vores tilgang. Nogle kommercielle software kan automatisk analysere de akustiske funktioner, men giver ikke en automatAtisk klassifikation af stavelserne; Brugeren skal sortere de forskellige stavelser bagefter. Grimsley, Gadziola, et al. 33 udviklede et tabelbaseret virtuelt mus vocal organprogram, der klynger stavelser baseret på delte akustiske egenskaber, men giver ikke automatisk registrering af stavelserne. Deres program 34 er unikt, fordi det skaber nye sekvenser fra indspillede sange ved brug af Markov-modeller, og har således mere avancerede funktioner end simpel redigering.
De fleste tidligere kommunikationsstudier på mus har fokuseret på emitterens side 35 , 36 . Få studier har undersøgt modtagerens side 30 , 37 , 38 . Afspilnings- og diskriminationsprotokoller giver en simpel test for at studere modtagerens side, som den, der for nylig er beskrevet af Asaba, Kato, etal. 39 . I den undersøgelse anvendte forfatterne en to-valg testboks adskilt med akustisk skum i stedet for den Y-labyrint, der er beskrevet her. Begge valgopsætninger har fordele og ulemper. For det første isolerer Y-labyrinten ikke lyden fra den ene arm til den anden, men to-valgboksen gør det. Ved at bruge Y-labyrintdesignet kan dyret dog hurtigt evaluere de to sange, der spilles samtidigt, og bevæge sig mod den foretrukne. Ikke desto mindre hjælper afspilningseksperimenter generelt eksperimenter med at bestemme betydningen og dermed funktionerne af vokaliseringen, der genereres til specifikke dyr. Afslutningsvis bør læserne, efter at have mestret teknikkerne i denne protokol og analyser, være i stand til at behandle mange spørgsmål, der påvirker musens USVs kontekst, genetik og neurobiologi.
Ved hjælp af B6D2F1 / J-mus udløser de kvindelige associerede stimuli næsten altid USV'er fra de mænd, vi har testet i vores lab. Det er kritisk for kollegaenCt nok stavelser (> 100 i 5 min) for at kunne opnå stærk statistisk analyse. For fejlfinding, hvis der ikke er registreret USV'er (eller ikke nok), skal du kontrollere konfigurationen for at sikre, at lyde optages. Lav en levende inspektion af hvad der sker i buret under optagelse ved at se på real-time sonogrammet på computerskærmen efter introduktionen af stimulus. Ellers forsøge at genudsætte hanen til en kønsmodne / modtagelig kvinde natten over og derefter huske dem alene i flere dage eller op til en uge før optagelse igen. Baseret på anekdotiske observationer finder vi, at nogle mænd synger meget på en dag (i næsten hele 5 min), og ikke meget den næste dag, og så igen en anden dag. Vi kender ikke grunden til, at sådanne inden for fagvariationer forekommer, men vi antager, at det sandsynligvis er motiverende eller sæsonbestemt for mændene og østrus tilstanden for kvindelig urin. Hvis der ikke registreres USV'er, skal du prøve at registrere dyret på flere dage for at afhente disse variable effekter. UbegrIke i sangfugle, har vi ikke bemærket åbenlyse forskelle i sangmængden baseret på tid på dagen. Vi finder, at mændene ikke synger meget (<100 stavelser om 5 minutter), før de er 7 uger gamle.
Detekteringsmetoderne, der præsenteres her, kan udtrække tusindvis af stavelser og alle de akustiske parametre om få minutter. Men som en hvilken som helst automatisk detekteringsmetode er den meget følsom over for baggrundsstøj. Ved brug af Mouse Song Analyzer-registreringssoftware med støjende optagelser (f.eks. Fra dyr optaget med sengetøj) kan det kræves, at detekteringen "tærskel" justeres for at give større fleksibilitet. Dette vil dog også øge antallet af falske positive stavelser, og den automatiske detektering kan mislykkes. Under sådanne omstændigheder kan manuel kodning anvendes.
Som nævnt er antallet, repertoarerne og latensen af vokaliseringer meget variable afhængigt af belastningen, og man må derfor ændre parametre (optagelseslængde,Stimulering, automatiseret stavelsesdetektering osv. ) For nogle stammer for at sikre optimale optagelser til statistiske analyser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Howard Hughes Medical Institute-midler til EDJ. Vi takker Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI – Universitet Paris syd XI – FRANKRIG) for at udlåne os højttalerens hardware. Vi takker også medlemmer af Jarvis Lab for deres support, diskussioner, rettelser og kommentarer til dette arbejde, især Joshua Jones Macopson for hjælp med tal og test. Vi takker Dr. Gustavo Arriaga for hjælp med Mouse Song Analyzer-softwaren, opgradering af den til os til V1.3 og andre aspekter af denne protokol. V1.0 af softwaren blev udviklet af Holy and Guo, og v1.1 og v1.3 af Arriaga.
Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
Tweezers | |||
Software | |||
Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
Reagents | |||
Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
distilled water | |||
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
Cotton tips | |||
Petri dish |