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Behavior

Eliciting e analisi di canzoni ad ultrasuoni (USV) di topo maschio

doi: 10.3791/54137 Published: May 9, 2017

Summary

I topi producono un complesso repertorio multisilabico di vocalizzazioni ultrasoniche (USVs). Questi USV sono ampiamente usati come letture per i disturbi neuropsichiatrici. Questo protocollo descrive alcune delle pratiche apprese e sviluppate per indurre, raccogliere e analizzare costantemente le caratteristiche acustiche e la sintassi delle canzoni del mouse.

Abstract

I topi producono vocalizzazioni ultrasoniche (USVs) in una varietà di contesti sociali durante lo sviluppo e l'età adulta. Questi USV sono utilizzati per il recupero madre-pup, 1 , le interazioni giovanili 2 , le interazioni opposte e le stesse interazioni di sesso 3 , 4 , 5 e le interazioni territoriali 6 . Per decenni i USVs sono stati usati dagli investigatori come proxy per studiare i disturbi neuropsichiatrici e di sviluppo o comportamentali 7 , 8 , 9 e più recentemente per comprendere i meccanismi e l'evoluzione della comunicazione vocale tra i vertebrati 10 . Nell'ambito delle interazioni sessuali, i topi maschi adulti producono canzoni USV, che presentano alcune caratteristiche simili alle canzoni di canto da cortile 11 . L'uso di tale reper multisilabicoI giocatori possono aumentare la potenziale flessibilità e le informazioni che portano, in quanto possono essere variate in come gli elementi sono organizzati e ricombinati, vale a dire la sintassi. In questo protocollo è descritto un metodo affidabile per elicitare canzoni USV da topi maschi in vari contesti sociali, come esposizione a urine fresche femminili, animali anestetizzati e femmine estrusse. Ciò include condizioni per indurre una grande quantità di sillabe dai topi. Riduciamo la registrazione dei rumori ambientali con camere a basso costo e presentiamo un metodo di quantificazione per rilevare, classificare e analizzare automaticamente gli USV. Quest'ultimo include la valutazione del call-rate, del repertorio vocale, dei parametri acustici e della sintassi. Sono descritti diversi approcci e approfondimento sull'uso delle riproduzioni per studiare la preferenza di un animale per tipi di song specifici. Questi metodi sono stati utilizzati per descrivere cambiamenti acustici e sintattici in diversi contesti nei topi maschi e preferenze canzoni nei topi femminili.

Introduction

Rispetto agli esseri umani, i topi producono sia vocalizzazioni basse che ad alta frequenza, più tardi chiamate vocalizzazioni ultrasoniche (USV) sopra la nostra gamma uditiva. Gli USV sono prodotti in una varietà di contesti, tra cui da recupero madre-pup, interazioni giovanili, interazioni adulte opposte o stesse del sesso 4 , 12 . Questi USV sono composti da un repertorio multisilabo diversificato che può essere classificato manualmente 9 o automaticamente 10 , 11 . Il ruolo di questi USV nella comunicazione è stato in atto da indagini crescenti negli ultimi anni. Questi includono l'utilizzo degli USV come letture di modelli di topo dei disturbi neuropsichiatrici, di sviluppo o comportamentali 7 , 8 e di stati motivazionali / emotivi interni 13 . Si pensa che gli USV trasmettano informazioni attendibili sull'eStato di mittente che è utile per il ricevitore 14 , 15 .

Nel 2005, Santo e Guo 11 hanno avanzato l'idea che i maschi adulti maschi degli Usa vennero organizzati come una successione di elementi di chiamata multisilabica o sillabe simili a canzoni da canto. In molte specie, un repertorio multisilabico consente all'emettitore di combinare e ordinare le sillabe in modi diversi per aumentare le informazioni potenziali trasportate dalla canzone. Si ritiene che la variazione in questa sintassi abbia una rilevanza etologica per il comportamento sessuale e le preferenze del compagno 16 , 17 . Gli studi successivi hanno mostrato che i topi maschi hanno potuto modificare la composizione relativa dei tipi di sillabazione che producono prima, durante e dopo la presenza di una femmina 5 , 18 . Cioè, i topi maschi adulti usano i loro USV per comportamenti di corteggiamento, sia per attirareO mantenere un contatto stretto con una femmina, o per facilitare l'accoppiamento 19 , 20 , 21 . Esse sono emesse anche nelle interazioni maschili e maschili, probabilmente per trasmettere informazioni sociali durante le interazioni 4 . Per catturare questi cambiamenti nei repertori, gli scienziati misurano normalmente le caratteristiche spettrali (parametri acustici, quali ampiezza, frequenze, ecc. ), Il numero di sillabe o chiamate degli USV e la latenza al primo USV. Tuttavia, pochi in realtà considerano le dinamiche di sequenza di questi USV in dettaglio 22 . Recentemente il nostro gruppo ha sviluppato un metodo nuovo per misurare i cambiamenti dinamici nelle sequenze sillabali USV 23 . Abbiamo mostrato che l'ordine di sillabazione all'interno di una canzone (cioè la sintassi) non è casuale, che cambia a seconda del contesto sociale e che gli animali ascolti rilevano questi cambiamenti come etologicamente rilevanti.

Noi notiamo thA molti investigatori che studiano la comunicazione animale non attribuiscono al termine "sintassi" lo stesso significato esatto della sintassi utilizzata nel discorso umano. Per gli studi sulla comunicazione animale, si intende semplicemente una sequenza ordinata e non casuale di suoni con alcune regole. Per gli esseri umani, inoltre, le sequenze specifiche sono note per avere significati specifici. Non sappiamo se questo è il caso per i topi.

In questo documento e nel video associato, ci proponiamo di fornire protocolli affidabili per registrare i contatti USV di corteggiamento maschile dei maschi in diversi contesti e eseguire le riproduzioni. L'utilizzo di tre software sequenzialmente usati per: 1) registrazioni automatiche; 2) sillabe rilevazione e codifica; E 3) è stata dimostrata un'analisi approfondita delle caratteristiche di sillabazione e della sintassi ( Figura 1 ). Questo ci permette di saperne di più sulla struttura e la funzione USV dei topi maschi. Crediamo che tali metodi facilitino l'analisi dei dati e possono aprire nuovi orizzonti nel caratterizzare la normale comunicazione anormale e vocale in mouSe modelli di comunicazione e disturbi neuropsichiatrici, rispettivamente.

Protocol

Dichiarazione di etica: Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Duke University (IACUC) con il protocollo # A095-14-04. Nota: vedere la tabella 1 nella sezione " Materiali e attrezzature " per i dettagli del software utilizzato .

1. Stimolare e registrare i mouse USVs

  1. Preparazione dei maschi prima delle sessioni di registrazione
    NOTA: I risultati rappresentativi sono stati ottenuti utilizzando topi maschi adulti B6D2F1 / J (7 - 8 settimane). Questo protocollo può essere adattato per qualsiasi ceppo.
    1. Impostare il ciclo di luce della stanza animale su un ciclo chiaro / scuro di 12 ore, salvo diversa indicazione. Seguire le regole standard di alloggiamento da 4 a 5 maschi per gabbia a meno che non sia necessario o necessario. Tre giorni prima della registrazione, esporre i maschi individualmente a una femmina sessualmente matura e ricettiva (fino a 3 maschi con una femmina per gabbia) dello stesso ceppo durante la notte.
    2. Il giorno dopo rimuoviLa femmina della gabbia maschile e ospita i maschi senza femmine per almeno due giorni prima della prima sessione di registrazione per aumentare la motivazione sociale per cantare (sulla base delle nostre analisi aneddotiche di prova e di errore).
  2. Preparazione delle casse di registrazione
    1. Utilizzare un dispositivo di raffreddamento da spiaggia (le dimensioni interne sono L 27 x W 23 x H 47 cm) per agire come studio di box di attenuazione sonora ( Figura 2A ). Praticare un piccolo foro sulla parte superiore della scatola per far funzionare il filo del microfono.
      NOTA: è preferibile registrare gli animali in un ambiente sonoro attenuato e visivamente isolato, per registrare decine di topi contemporaneamente senza che essi si sentano o si vedano l'un l'altro, impediscano la contaminazione del rumore ambientale delle apparecchiature ambientali e della stanza, Registrazioni sonore dei topi ( Figura 2B ). Non abbiamo notato effetti sonori o distorsioni al suono quando si confrontano le vocalizzazioni dello stesso topo dentro all'esterno di tHa suono la camera di attenuazione ( figura 2C ); Piuttosto, i suoni possono essere più forti e avere meno armoniche all'interno della camera.
    2. Collegare il microfono al filo, al filo alla scheda audio e alla scheda audio al computer per lavorare con un software di registrazione audio ( ad es. Software A in Figura 1 e Tabella 1 ). È necessario un software di registrazione audio appropriato, ad esempio il software A che genera file audio .wav.
    3. Inserire una gabbia vuota (58 x 33 x 40 cm) all'interno della scatola insonorizzata e regolare l'altezza del microfono in modo che la membrana del microfono sia di 35 - 40 cm sopra il fondo della gabbia e che il microfono sia centrato sopra la gabbia ( Vedi figura 2A ).
  3. Configurazione del software di registrazione A ( Tabella 1 ) per la registrazione continua
    1. Fare doppio clic e aprire il software A. Fare clic e aprire il menu "configurazione" e selezionare il dispositivo denominato, Frequenza di campionamento (250.000 Hz), formato (16 bit).
    2. Seleziona l'opzione "Trigger" e seleziona "Toggle".
      NOTA: Questa impostazione consente di avviare la registrazione premendo un tasto (F1, F2, ecc. ) Mentre si posiziona lo stimolo nella gabbia del mouse.
    3. Inserisci l'ID del mouse nel parametro "Nome".
    4. Impostare la dimensione massima del file nei minuti di registrazione desiderati (di solito è impostato su 5 minuti).
      NOTA: Più lunghi i minuti la quantità di memoria di memoria necessaria. Se non è impostata la modalità continua, il software interrompe i brani di canzone all'inizio o alla fine di una sequenza in base ai parametri impostati e quindi non è possibile quantificare in sequenza le sequenze affidabili.
  4. Registrare USV usando i diversi stimoli. Nota: Ogni stimolo può essere utilizzato indipendentemente in base alle esigenze sperimentali dell'utente.
    1. Sollevare delicatamente l'animale per essere registrato dalla coda e collocarlo in una gabbia senza biancheria da letto (per impedire movRumore di ement sul letto) all'interno della scatola insonorizzata, e mettere il coperchio metallico a scatto aperto sulla cima, con il coperchio rivolto verso l'alto.
    2. Chiudere la scatola attenuata del suono e lasciare che l'animale si abitua per 15 minuti. Effettuare la preparazione degli stimoli (1.4) in questo momento.
  5. Stimuli preparazione
    1. Preparazione di campioni di urina fresca (UR) come stimolo
      1. Ottieni campioni di urina per un massimo di 5 minuti prima della sessione di registrazione per assicurare il massimo effetto per indurre la canzone dai maschi. NOTA: L'urina che è stata seduta più a lungo, e specialmente per ore o pernottamento, non è così efficace 24 , 25 , che abbiamo empiricamente verificato 23 .
      2. Scegliere una femmina o un maschio (a seconda del sesso dello stimolo da utilizzare) in una gabbia, afferrare la pelle dietro il collo e trattenere l'animale in una mano come per una procedura di iniezione di droga con la pancia esposta.
      3. Quindi, seleziona un'altra gabbia. E ripetere la stessa procedura con un'altra femmina o un maschio, ma con la stessa punta di cotone precedentemente utilizzata.
        NOTA: Questa procedura consente di mescolare l'urina di almeno due femmine o maschi da due gabbie indipendenti sulla stessa punta di cotone per assicurarsi contro qualsiasi estrusione o altri effetti individuali, poiché è noto che il ciclo dell'estrusso potrebbe influenzare il comportamento di canto 18 , 26 .
      4. Posizionare la punta del cotone da utilizzare in un bicchiere pulito o piatto di petri di plastica.
        NOTA: poiché la punta del cotone con l'urina dovrà essere utilizzata entro i prossimi 5 minuti, non è necessario coprire per prevenire l'evaporazione.
    2. PreparatiSul stimolo femminile vivo (FE) come stimolo
      1. Selezionare una o due nuove gabbie di femmine sessualmente mature. Identificare le femmine nello stadio pro-estrus o estruso mediante ispezione visiva (ampia apertura vagina e rosa rosa come mostrato in 27 , 28 ). Separarli in una gabbia diversa fino all'uso.
    3. Preparazione delle donne femminili anestetizzate (AF) o maschi (AM) come stimolo
      1. Per l'AF, selezionare una femmina dalla piscina sopra (in pro-estrus o estrus). Per l'AM, selezionare un maschio da una gabbia di topi maschi adulti.
      2. Anestetizzare la femmina o il maschio con un'iniezione intraperitoneale di una soluzione di Ketamine / Xylazine (rispettivamente 100 e 10 mg / kg).
      3. Utilizzare unguento per prevenire la disidratazione degli occhi mentre l'animale viene anestetizzato. Controllare l'anestesia corretto provando il riflesso di richiamo della zampa quando è pinzato. Posizionare l'animale anestetizzato in una gabbia pulita su un tovagliolo di cartaH la gabbia sul tappo termico impostato su "calore minimo" per garantire il controllo della temperatura corporea.
      4. Riutilizzare gli stessi animali fino a 2-3 volte per diverse sessioni di registrazione se necessario prima di svegliarsi (di solito circa 45 minuti). Mettetele nuovamente sul pad di calore dopo ogni sessione di registrazione.
      5. Controlla la frequenza respiratoria mediante ispezione visiva (~ 60 - 80 breath per min) e la temperatura corporea toccando l'animale ogni 5 minuti (deve essere caldo al tatto).
    4. Quando è pronto per registrare, fare clic sul pulsante "Registra" del software A.
      NOTA: Le registrazioni non verranno avviate a meno che l'utente faccia clic sul pulsante tasto associato a ciascun canale; Monitorare l'alimentazione audio dal vivo dalle gabbie sullo schermo del computer per assicurarsi che gli animali cantano e che le registrazioni siano state ottenute correttamente.
    5. Premere contemporaneamente il pulsante corrispondente della casella (i) desiderata da registrare ( cioè F1 per la casella 1) e introdurre lo stimolo desiderato.
      1. Presentare uno degli stimoli come segue. Posizionare la punta di cotone con i campioni di urina fresca all'interno della gabbia, oppure posizionare la femmina viva all'interno della gabbia, oppure collocare uno degli animali anestetizzati (AF o AM) sulla parte superiore del coperchio metallico della gabbia.
    6. Chiudere in silenzio la scatola di registrazione e lasciare che la registrazione scenda per il numero di minuti preselezionato ( ad es. 5 min come descritto nel paragrafo 1.3).
    7. Dopo la registrazione, fai clic sul pulsante rosso di stop square per interrompere la registrazione.
    8. Se un animale anestetizzato è stato utilizzato come stimolo, aprire la casella di registrazione insonorizzata, prendere l'animale anestetizzato dal coperchio metallico della gabbia e riportarlo nuovamente sul pannello di riscaldamento prima della prossima sessione di registrazione o se non usa più l'animale come controllo stimolo Ogni 15 minuti fino a quando non ha ripreso sufficiente coscienza per mantenere la ricostruzione sternale.
    9. Aprire la gabbia e rimuovere l'animale di prova cosciente e riportarlo nella sua gabbia. Pulire la gabbia di prova con alcool al 70% aAcqua distillata.

2. Elaborazione di file .wav e codifica in forma sillaba utilizzando l'analizzatore di canali Mouse v1.3

  1. Aprire il software di codifica B ( Figura 1 , Tabella 1 ) e inserire la cartella contenente il Software Script C di "Mouse Song Analyzer" ( Figura 1 , Tabella 1 ) nel percorso del software cliccando su "percorso impostato" e aggiungere la cartella sul software B. Chiudere quindi il software B per salvare.
  2. Configurare le impostazioni di identificazione delle sillabe del software combinato B + C. NOTA: Il codice C di script software crea automaticamente una nuova cartella chiamata "sonogrammi" con file in formato .sng nella stessa cartella sono stati trovati i file .wav. Di solito è meglio mettere tutti i file .wav dalla stessa sessione di registrazione generata utilizzando il software A nella stessa cartella.
    1. Aprire il software B configurato con C.
      NOTA: Questa versione del software B è interamente cÈ ompatibile con lo script software C. Non è possibile garantire che le versioni successive accettino tutte le funzioni incluse nel codice corrente.
    2. Passare alla cartella di interesse che contiene i file .wav di registrazione da analizzare utilizzando la finestra "cartella corrente".
    3. Nella "finestra di comando", immettere il comando "whis_gui".
    4. Nella nuova finestra whis-gui, osservare diverse sezioni di sotto-finestra con diversi parametri ( Figura 3 ), inclusi "Parametri Sonogram", "Opzioni del fischio" e tutti gli altri. Regolare i parametri per rilevare gli USV. Utilizzare le seguenti impostazioni dei parametri per rilevare le sillabe di USV da topi da laboratorio ( ad es. I ceppi di mouse B6D2F1 / J e C57BL / 6J utilizzati nei nostri studi):
    5. Nella sezione Parametri Sonogram, regolare la frequenza minima a 15.000 Hz, la frequenza massima a 125.000 Hz, la frequenza di campionamento ( numero di frequenza ) tO 256 kHz, e la soglia a 0,3.
    6. Nella sezione Opzioni whistle, regola la soglia di purezza a 0.075, la durata minima della sillaba a 3 ms, la frequenza minima sweep a 20.000 Hz e la durata del filtro a 3 ms.
    7. Nelle altre sezioni, regola la durata della nota minima a 3 ms e il valore minimo della nota a 1.
    8. Per il protocollo di categorizzazione sillaba, selezionare le caselle nella sezione centrale della finestra whis_gui:
      La categorizzazione predefinita si basa su Santo e Guo 11 e Arriaga et al. 10 , che codifica la sillaba per il numero di salti di passo e la direzione del salto: S per semplice sillaba continua; D per un salto al passo; U per un salto in salita; DD per due salti in sequenza; DU per un dowN e un salto in su; Ecc. Questo sarà il default se l'utente non seleziona nulla. L'utente ha l'opzione di eseguire l'analisi su determinati tipi di sillabazione selezionando ciascuna delle caselle rappresentative.
      Per scegliere la categorizzazione sillaba come descritto da Scattoni, et al. 9 , selezionare inoltre la categoria Split s , che separa questo tipo in più sottocategorie basate sulla forma sillaba.
      Seleziona Harmonics se l'utente desidera ordinare ulteriormente le sillabe in quelle con e senza armoniche.
  3. Classificare le sillabe nei file wav di interesse
    1. Seleziona tutti i file wav da una sessione di registrazione nella parte superiore sinistra della finestra whis_gui.
    2. Fai clic su "Get sonograms" nel mezzo della finestra whis_gui ( Figura 3 ). Verrà creata una nuova cartella contenente i sonogrammi con il formato di file .sng. Selezionare tutti i sonogrammi (file .sng) nella parte superioreL'angolo sinistro della finestra whis-gui.Inserire "Animal ID" e "ID sessione" nelle caselle sotto la finestra del file sonogramma. Quindi fare clic su sonogrammi di processo.
      1. Osservate tre tipi di file nella cartella sonogramma: "Animal ID-Session ID -Notes.csv" (contiene informazioni sulle note estratte dalle sillabe), "Animal ID-Session ID -Sillables.csv" (contiene valori di tutti i Sillabe classificate, comprese le loro caratteristiche spettrali e il numero totale di sillabe rilevate nei sonogrammi), "Animal ID-Session ID -Traces.mat", (contiene rappresentazioni grafiche di tutte le sillabe).
        NOTA: Il file "Animal ID-Session ID -Syllables" contiene talvolta un piccolo percentuale (2-16%) di sillabe USV non classificate più complesse di quelle selezionate o che hanno due sillabe di animali che si sovrappongono 23 . Questi possono essere esaminati separatamente dal file di traccia, se necessario.

3. Quantificazione della struttura acustica sillaba e sintassi

NOTA: Le istruzioni per i passaggi da eseguire per le analisi iniziali di sintassi sono incluse nel "LETTURA ME!" Foglio di calcolo del file "Song Analysis Guide v1.1.xlsx", il nostro calcolatore di fogli di calcolo progettato personalizzato E ( Figura 1 , Tabella 1 ).

  1. Aprire l'output del file script C del software "Animal ID-Session ID -Sillables.csv" ottenuto nella sezione precedente con il software di fogli di calcolo D ( Figura 1 , Tabella 1 ). Contiene il numero totale di sillabe rilevate in tutti i sonogrammi e tutte le loro caratteristiche spettrali.
  2. Se non è ancora convertito, nel file del foglio di calcolo D convertite questo file .csv alla separazione di colonna nel software D per mettere ogni valore in singole colonne.
  3. Aprire il file "Song Analysis Guide v1.1.xlsx" anche nel software D. Fare clic su thE copia e incolla i dati del file "Animal ID-Session ID -Sillables.csv" in questa scheda come raccomandato nelle istruzioni del foglio del modello. Rimuovi le righe con la categoria 'sbloccabili' non classificate.
  4. Dopo aver rimosso le righe 'non classificate', prima copiare e ricalcolare i dati ISI (interlima intervallo di sillabazione) nella colonna O nella colonna E. In secondo luogo, copiare tutti i dati dalla colonna A alla N nel foglio di calcolo 'Data'.
  5. Nel foglio dati, immettere gli ID animali (colonna AF) e la lunghezza della registrazione (in minuti, colonna AC).
    NOTA: Gli ID animali devono corrispondere a quelli inseriti nel set di registrazione. Il file rileverà i caratteri inseriti e lo confronterà con il nome dei file wav.
  6. Determinare l'intervallo ISI per definire una sequenza utilizzando il foglio di calcolo denominato "Densità ISI", il risultato della trama ISI.
    NOTA: Nel nostro studio passato 23 abbiamo impostato la cutoff a due standaLe deviazioni dal centro dell'ultimo picco. Esso consisteva di lunghi intervalli (LI) di oltre 250 ms, che separavano diversi attacchi di canzoni all'interno di una sessione di canto.
  7. Visualizzare i risultati principali nel foglio di calcolo "Caratteristiche" (raggruppando tutte le caratteristiche spettrali misurate da ciascun animale).
    NOTA: Se l'utente ha utilizzato l'impostazione di categoria di sillabazione predefinita nello script software C descritto nella sezione 2.8.9, le sillabe vengono quindi ulteriormente classificate in 4 categorie come sopra descritto e in Chabout, et al. 23 : 1) semplice sillaba senza salti di passo, «s»; 2) due sillabe di nota separate da un singolo salto verso l'alto («u»); 3) due sillabe di nota separate da un singolo salto verso il basso («d»); E 4) sillabe più complesse con due o più salti di passo tra le note («m»).
  8. Per i valori di sintassi, fare clic sul foglio di calcolo "Probabilità globali" che calcola le probabilità di ogni coppia di sI tipi di transizione superiore, indipendentemente dalle sillabe di partenza, utilizzando la seguente equazione 23 .
    P (presenza di un tipo di transizione) = numero totale di occorrenze di un tipo di transizione / numero totale di transizioni di tutti i tipi
  9. Fai clic sul foglio di calcolo "probabilità condizionale" per calcolare le probabilità condizionale per ciascun tipo di transizione rispetto alle sillabe di avvio, che utilizza la seguente equazione:
    P (presenza di un tipo di transizione dato alla sillaba di avvio) = Numero totale di occorrenze di un tipo di transizione / Numero totale di occorrenze di tutti i tipi di transizione con la stessa sillaba di avvio
  10. Per verificare se e quali di queste probabilità di transizione differiscono da quelle non casuali, utilizzando un modello Markov di primo ordine, seguendo l'approccio in 23 , per utilizzare il software personalizzato F ( ad es. La decodifica di sintassi in studio R, la figura 1 ,Strong> Tabella 1) con i seguenti script R: Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Contexts.R per gruppi all'interno di differenti condizioni; O Tests_For_Differences_In_Dynamics_Between_Genotypes.R per i gruppi nelle stesse condizioni.
  11. Esegui un test di Chi-Square o un altro test della tua preferenza, per verificare le differenze statistiche nelle probabilità di transizione dello stesso animale in diversi contesti (in coppia), seguendo l'approccio in 23 .
    NOTA: Ulteriori dettagli sul modello statistico utilizzato per confrontare la sintassi tra i gruppi sono riportati in 23 . I ricercatori possono utilizzare altri approcci per analizzare le probabilità di transizione globali o condizionale che essi o altri svilupparono.
  12. Per visualizzare graficamente le sequenze come schemi di sintassi, immettere i valori in un software di grafica di rete G (vedere la Figura 1 , Tabella 1 ), con nodi che indicano diverse sillabe di sillabazioneGories e colore della freccia e / o pixel di spessore che rappresentano i valori di probabilità tra le sillabe.
    NOTA: per chiarezza, per i grafici di probabilità globali, mostriamo solo transizioni superiori a 0,005 (superiore a 0,5% di probabilità). Per le probabilità condizionale, utilizziamo una soglia di 0,05 perché ogni probabilità nel "modello globale" è inferiore considerando che dividiamo per il numero totale di sillabe e non solo per un singolo tipo di sillabazione.

4. Modifica ed esame delle preferenze per un tipo di canzone

NOTA: Le riproduzioni degli USV possono essere utilizzate per testare sperimentalmente la risposta comportamentale di un animale, inclusa la preferenza per un tipo di song specifico. Poiché le preferenze femminili potrebbero cambiare a seconda dello stato di estrusione, per le femmine assicurarsi che siano nello stesso stato di estrusione prima di procedere come segue:

  1. Preparare le donne con esperienza sessuale diversi giorni prima dell'esperimento di riproduzione Esporre a un maschio per 3 giorni prima che gli esperimenti innescano l'estrusione (effetto Whitten 28 ), esponendo le femmine sessualmente mature (> 7 settimane), mettendole in una gabbia di separazione (chiara in plastica solida con fori forati in esso) che permette alla femmina di vedere e Odore il maschio, ma impedisce il rapporto sessuale.
  2. Monitorare il ciclo di estrusione e quando è pro-estruso o estruso evidente (apertura vaginale e rosa rosa come mostrato in 27 ), mettere le femmine di nuovo nella loro gabbia. Sono pronti per essere testati il ​​giorno successivo.
  • Preparare i file song per la riproduzione
    1. Utilizzare le funzioni di copia e incolla in un software di elaborazione audio H ( ad es. SASLap Pro; Figura 1 , Tabella 1 ) per creare due file wav modificati con le condizioni desiderate da utilizzare per gli stimoli. Per proteggere la quantità di vocalizations come variabile, assicurarsi che i due file audio contengano lo stesso numero di sI suoni e la lunghezza delle sequenze (brani di canto) dagli stessi o differenti maschi / femmine dai contesti desiderati ( ad es. UR).
    2. Aprire il primo file contenente la song dalla condizione 1 nel software H. Quindi passare a File> Speciali> Aggiungi canali dal file e selezionare il secondo file audio da testare dalla condizione 2. Ciò crea 2 canali, uno per ogni condizione.
    3. Se necessario, regolare il volume visivamente se si desidera che i volumi dei due file si abbinino a vicenda, passando a Modifica> Volume.
    4. Quindi vai a Modifica> Formato> Conversione di frequenza di campionamento e seleziona la conversione da 250.000 Hz a 1.000.000 Hz per trasformare i file wav da una frequenza di campionamento da 256 kHz a 1 MHz. Questo passaggio è necessario per il dispositivo di riproduzione per leggere i file wav.
    5. Salvare questi nuovi file come file di prova da riprodurre. Assicuratevi di identificare quale canzone sia in quale canale (1 o 2). Per scopi di chiarezza chiamare "file name.wav".
    6. Vai a EXit> Formato> Scambia canali e scambia i due canali. Salvare le versioni scambiate utilizzando un nome diverso. NOTA: questa sarà la copia opposta con i canali invertiti, denominati in seguito "file name_swapped.wav".
  • Preparare l'apparecchio di riproduzione
    1. Pulire l'apparecchio di riproduzione "Y-labirinto" con alcool al 70% seguito da acqua distillata. Asciugare con asciugamani. Il nostro Y-labirinto è un apparecchio in plastica opaca nera in plastica nera, con bracci di 30 cm e due fori perforati sulle estremità estreme del labirinto per consentire all'altoparlante ad ultrasuoni di adattarsi al livello del pavimento delle braccia ( Figura 4A ).
    2. Assicurarsi che gli altoparlanti siano posizionati correttamente e collegati alla scheda audio e che la scheda sia collegata al computer.
    3. Aprire il software A, selezionare Riproduci> Dispositivo e selezionare il dispositivo di scheda audio di riproduzione. Selezionare "utilizza il tasso di intestazione del file". Vai a Play> Playlist e carica il file di interesse che contiene i due chaNnels ( ad esempio "file.wav"). Selezionare "modalità loop". Impostare il videoregistratore sopra il labirinto per coprire l'intero labirinto.
  • Eseguire l'esperimento di riproduzione
    1. Posizionare la femmina di prova nel labirinto per un periodo di abitudini di 10 minuti. Dopo 10 minuti, se la femmina non è nel braccio di partenza, spingere delicatamente la femmina sul braccio di partenza e chiudere la finestra di separazione in plastica.
    2. Selezionare il file preparato ("file.wav") per riprodurlo e riprodurlo. Avviare la registrazione video e assicurarsi di identificare quale canale sia posizionato sul braccio di Y-labirinto ( ad es . : UR a sinistra o FE nel braccio destro) con una nota di carta nel campo di registrazione video.
    3. Consenti alla femmina di ascoltare le canzoni in modalità loop e esplorare il labirinto durante un numero di minuti desiderato ( cioè 5 minuti): questa è una sessione. Ritorna la femmina nel braccio di partenza. Lasciarla riposare per 1 min durante la preparazione della prossima sessione. RemOve qualsiasi urina traccia e escrementi con acqua distillata.
    4. Caricare il file "file_swapped.wav" Selezionare la posizione delle note di carta per la registrazione video Spostare la sinistra a destra e viceversa Dopo 1 minuto riprodurre il file Liberare la femmina per la seconda sessione .
    5. Ripetere i passaggi da 4.4.3 a 4.4.4 per un totale di 4 sessioni x 5 minuti per controllare la rilevazione delle potenziali potenzialità laterali durante il test. Fermate la registrazione video alla fine di tutte le sessioni facendo clic sul pulsante di arresto rosso. Pulire il labirinto con alcool al 70% e acqua distillata tra le femmine.
    6. Ripetere tutti i passaggi con diversi esemplari di canzoni una settimana dopo con le stesse femmine per ottenere risultati sufficienti per verificare l'affidabilità dei risultati.
    7. Più avanti osserva i video e utilizza il timer sul video e un cronometro per misurare il tempo trascorso dalle femmine in ogni braccio per ogni sessione. Analizzare statisticamente i dati risultanti per le possibili preferenze del brano.
  • Representative Results

    Nel protocollo attuale, sono stati caratterizzati i cambiamenti nel comportamento vocale e nella sintassi dei topi maschi B6D2F1 / J. In generale, utilizzando questo protocollo siamo stati in grado di registrare, in media per maschio per sessione di 5 minuti, 675 ± 98,5 sillabe classificate in risposta all'UR femminile, 615,6 ± 72 in FE, 450 ± 134 in AF, 75,6 ± 38,9 in AM e 0,2 ± 0,1 in UR maschio (n = 12 maschi). I tassi erano ~ 130 sillabe / min per UR femminile, ~ 120 sillabe / min per FE, o ~ 100 sillabe / min per contesti AF ( Figura 5A ). I maschi producono una quantità molto più ampia di sillabe in risposta all'urina appena raccolta rispetto all'urina raccolta durante la notte 10 , 23 . Anche i maschi cantano notevolmente meno in presenza di urine maschili o fresche anestetizzate Figura 5A ). Anche i maschi cambiano il loro repertorio nel contesto 23 . Ad esempio, i maschi B6D2F1 / J aumentano notevolmente La produzione di sillabe di categoria multiple "m" nella condizione delle urine femminili ( Figura 5B ). Cambiano anche le caratteristiche acustiche di singole sillabe in tutto il contesto. Ad esempio, i maschi B6D2F1 / J cantano le sillabe ad una maggiore ampiezza e larghezza di banda nel contesto urinario femminile e una maggiore purezza spettrale nel contesto femminile sveglio rispetto agli altri ( Figura 6 ) 23 .

    Questo protocollo fornisce anche un mezzo per misurare le caratteristiche dinamiche delle sequenze e quindi le modifiche della sintassi. Utilizzando un metodo adattato da Ey, et al. 22 , utilizziamo l'ISI per definire le lacune tra le sequenze ( Figura 7A ) 23 e quindi usiamo le lacune per distinguere e analizzare i pattern temporali delle sequenze sillabe. Abbiamo mostrato lunghezze di sequenza più lunghe sono prodotte nel contesto femminile sveglio ( Figura 7B )F "> 23. Questa tecnica permette di calcolare il rapporto di sequenze complesse (composto da almeno 2 occorrenze del tipo sillaba" m ") rispetto a sequenze semplici (composto da un tipo" no "o" m " S "). Con i maschi B6D2F1 / J, il contesto urinario femminile ha innescato un rapporto più elevato rispetto agli altri ( Figura 7C ) 23 , indicando che hanno generato sillabe più complesse nella condizione delle urine femmine, ma anche che tali sillabe sono distribuite Su più sequenze.

    Possiamo anche calcolare le probabilità di transizione condizionale da un tipo di sillaba ad un altro (24 totali di transizione compresi i passaggi da e allo stato "silenzio") 23 . Abbiamo scoperto che in diversi contesti, la scelta dei tipi di transizione da parte dei topi per determinate sillabe di inizio differisce e che esiste un diverso tipo di sintassiErsità nella condizione delle urine femminili ( Figura 8 ) 23 . Queste osservazioni sono coerenti con i rapporti precedenti che dimostrano che i maschi possono cambiare le caratteristiche acustiche o la composizione dei repertori delle loro vocalizzazioni in risposta a diversi stimoli e esperienze 4 , 5 , 24 .

    Infine, il presente protocollo fornisce indicazioni per testare le preferenze femminili con le riproduzioni. Abbiamo scoperto che le femmine B6D2F1 / J preferiscono canzoni più complesse (contenenti 2 o più sillabe "m") rispetto alle canzoni semplici 23 . La maggior parte delle femmine ha scelto di rimanere più spesso sul lato del labirinto Y che ha suonato le canzoni complesse ( figura 4B ).

    Figura 1
    Figura 1: Diagramma di flusso di SofUso e analisi. Ogni programma e il codice associato sono dotati di un nome di lettera per spiegare la loro identità e l'uso nel testo principale. In () sono i programmi specifici che utilizziamo nel nostro protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    figura 2
    Figura 2: Impostazione per la registrazione di canzoni dei topi maschi. (A) Immagine di una casella di registrazione di attenuazione audio e impostata per registrare vocalizazioni USV. (B) Esempio di sonogramma di una registrazione effettuata con Software A ( Tabella 1 ), comprese le caratteristiche spettrali dettagliate calcolate con "Mouse Song Analyzer v1.3": durata, intervallo intervallo (ISI), frequenza di picco min (Pf min) Massima frequenza di picco (Pf max), avvio di frequenza di picco (inizio Pf), frequenza di picco Fine (fine Pf) e larghezza di banda. (C) Sonogrammi di un altro canto maschio a una femmina viva, all'interno della scatola di attenuazione del suono e all'esterno della scatola sul banco del laboratorio nella stessa stanza. Le nostre osservazioni aneddotiche indicano che le registrazioni nella scatola dello stesso animale mostrano un volume maggiore (intensità più forte) e meno armoniche, ma nessuna prova di eco nella scatola senza schiuma solida. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 3
    Figura 3: Schermata del "Mouse Song Analyzer v1.3" whis_gui Finestra che mostra le diverse opzioni disponibili per le analisi. I parametri mostrati sono quelli utilizzati per registrare USV maschi nelle figure e nelle analisi dei dati presentati (tranne la durata minima della nota è stata di 3 ms). .com / files / ftp_upload / 54137 / 54137fig3large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 4
    Figura 4: Scelte femminili tra riproduzioni di brani complessi e semplici. (A) Immagine dell'apparecchio di labirinto Y e dimensioni delle dimensioni. (B) Tempo trascorso dalle femmine in ciascun braccio, giocando sia da un complesso (urina femminile sollevata) o da una canzone più semplice (sveglia femminile) dello stesso maschio. I dati sono presentati per i topi femminili n = 10 B6D2F1J come media ± SE, con valori individuali anche mostrati; 9 delle 10 femmine hanno mostrato una preferenza per la canzone più sillaba / sequenza più complessa. * P <0,05 t-test condiviso per studenti. Figura modificata da Chabout, et al. 23 con autorizzazione.Blank "> Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Figura 5
    Figura 5: Numero di lingotti emessi e repertorio in condizioni diverse . (A) Il tasso di produzione sillaba dei maschi in diversi contesti. (B) Composizioni repertoriali di maschi in presenza di urine femminili (UR), donne anestetizzate (AF), femmine sveglie (FE) e contesti maschi anestetizzati (AM). I dati sono presentati come media ± SEM. P <0,03; ** p <0,005; *** p <0,0001 per t-test studentesco post-hoc dopo correzione di Benjamini e Hochberg (n = 12 maschi). Figura di Chabout, et al. 23 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    together.within-page = "1"> Figura 6
    Figura 6: Esempi di funzioni spettrali in diversi contesti. (A) Ampiezza. * P <0,025 per t-test dopo l'hoc adesivo post-hoc dopo la correzione. (B) Intervallo di frequenza o larghezza di banda. *: P <0,041; **: p <0,005; ***: p <0,0001 dopo la correzione. (C) Purezza spettrale delle sillabe. * P: <0,025; **: p <0,005; ***: p <0,0001 dopo la correzione. Abbreviazioni: urina femminile (UR), femminile anestetizzato (AF), femmina sveglia (FE) e maschio anestetico (AM). Figure modificate da Chabout, et al. 23 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Figura 7: Misure di sequenza. (A) Uso dell'ISI per separare la sequenza. Per separare le sillabe all'interno di una sequenza, vengono utilizzati brevi ISI (IS) e medio ISI (MI), e due ISI lungo da 250 ms (LI) separano due sequenze. (B) Lunghezza delle sequenze, misurate come numero di sillabe per sequenza, prodotte dai maschi in contesti diversi. *: P <0,025; ** p <0,005; *** p <0,0001 dopo la correzione. (C) Rapporto di canzoni complesse su canzoni semplici prodotte dai maschi in contesti diversi. P <0,041; ** p <0,005; *** p <0,0001 dopo la correzione. I dati sono presentati come media ± SEM (n = 12 maschi). Figura di Chabout, et al. 23 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


    Figura 8: Schemi sintassi sillabe di sequenze basate su probabilità condizionale per ogni contesto. Lo spessore della freccia è proporzionale alla probabilità di probabilità condizionale di un tipo di transizione in ciascun contesto in media da n = 12 maschi: P (presenza di una transizione data dalla sillaba di partenza). Per chiarezza, non sono mostrate rari transizioni inferiori a una probabilità di 0,05. Figura di Chabout, et al. 23 con autorizzazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Discussion

    Questo protocollo fornisce approcci per raccogliere, quantificare e studiare vocalizzazioni maschili di corteggiamento di topi maschi in laboratorio attraverso una serie di stimoli principalmente legati alle donne. Come precedentemente presentato in Chabout, et al. 23 e nei risultati rappresentativi, l'uso di questo metodo ci ha permesso di scoprire vocalizzazioni e sintassi dipendenti dal contesto che sono rilevanti per le femmine riceventi. La standardizzazione di questi stimoli fornirà la raccolta di un numero affidabile di USV e consentirà analisi dettagliate delle canzoni e dei repertori del corteggiamento maschile.

    Quando una femmina viva è presente con il maschio, il protocollo non ci consente di identificare chiaramente l'emettitore delle vocalizzazioni. Tuttavia, gli studi precedenti hanno mostrato che la maggior parte delle vocalizzazioni emesse in tale contesto erano da parte del maschio 26 , 29 . La maggior parte degli studi con un conspecifico (maschio o femmina)Come stimolo per i maschi ritengono che la quantità di vocalizzazioni femminili in questi contesti sia trascurabile 4 , 5 , 22 , 30 . Tuttavia un recente studio ha utilizzato la triangolazione per localizzare le vocalizzazioni dell'emettitore nelle condizioni di gruppo 31 , e ha mostrato che all'interno di un dyad, la femmina contribuisce al ~ 10% degli USVs. Nel presente protocollo l'uso della femmina anestetizzata consente all'utente di studiare le vocalizzazioni maschili in presenza di una donna senza la sua vocalizzazione. A differenza delle aspettative di questo recente studio 31 , non abbiamo trovato alcuna differenza nel numero di sillabe emesse tra le condizioni FE e AF 23 . È possibile che le femmine vive non contribuiscano in modo significativo alle registrazioni o che i maschi hanno vocalizzato meno in presenza di femmine vive contro femorale anestetizzatoAles. Ciononostante, riteniamo che gli esperimenti futuri dovrebbero considerare l'uso di questo metodo di triangolazione per valutare l'effetto potenziale del contributo femminile.

    Ci sono altri software disponibili che possono fare alcuni passi che abbiamo descritto, anche se non crediamo in un modo sufficiente per le domande che abbiamo chiesto usando una combinazione di tre programmi: Software A, Mouse Song Analyzer script C utilizzando il software B, Software di analisi di sintassi che utilizza un calcolo D + E dei programmi di calcolo personalizzato e la decodifica di sintassi con R. Ad esempio, un documento recente ha proposto un software denominato VoICE che consente all'utente di estrarre automaticamente le variabili acustiche dai sonogrammi o direttamente su unità manualmente Selezionato dall'utente 32 . Ma le analisi di sequenza automatica o semi-automatizzata non sono dettagliate del nostro approccio. Alcuni software commerciali possono analizzare automaticamente le caratteristiche acustiche, ma non forniscono un automobileClassificazione delle sillabe; L'utente deve ordinare successivamente le diverse sillabe. Grimsley, Gadziola, et al. 33 ha sviluppato un programma organico vocale virtuale a base di tabella basato su funzionalità acustiche condivise, ma non fornisce la rilevazione automatica delle sillabe. Il loro programma 34 è unico in quanto crea sequenze nuove da brani registrati usando modelli Markov e quindi ha funzioni più avanzate rispetto alla semplice modifica.

    La maggior parte degli studi di comunicazione precedenti sui topi si sono concentrati sul lato dell'emettitore 35 , 36 . Alcuni studi hanno esplorato il lato del ricevitore 30 , 37 , 38 . I protocolli di riproduzione e discriminazione forniscono un semplice test per studiare il lato del ricevitore, come quello recentemente descritto da Asaba, Kato eal. 39 . In questo studio, gli autori hanno usato una scatola di prova a due scelte separata con schiuma acustica invece che la scatola di labirinti Y descritta qui. Entrambe le strutture di scelta hanno vantaggi e svantaggi. In primo luogo, il labirinto Y non isola il suono da un braccio all'altro, ma la scatola a due scelte fa. Tuttavia, usando il design del labirinto Y, l'animale può valutare rapidamente le due canzoni che vengono riprodotte contemporaneamente e si spostano verso quella preferita. Tuttavia, esperimenti di riproduzione in generale aiutano i sperimentatori a determinare il significato e quindi le funzioni delle vocalizzazioni generate per gli animali conspecifiche. In conclusione, dopo aver masterizzato le tecniche di questo protocollo e le analisi, i lettori devono essere in grado di affrontare molte domande che influenzano il contesto, la genetica e la neurobiologia degli USV del mouse.

    Utilizzando i topi B6D2F1 / J, gli stimoli femminili associati quasi sempre innescano USV dai maschi che abbiamo testato nel nostro laboratorio. E 'fondamentale per il colleCt abbastanza sillabe (> 100 in 5 min) per essere in grado di ottenere una forte analisi statistica. Per la risoluzione dei problemi, se non vengono registrati (o non sufficienti) USV, controllare la configurazione per assicurarsi che i suoni siano registrati. Eseguire un'ispezione dal vivo di ciò che sta accadendo nella gabbia durante la registrazione guardando il sonogram real-time sullo schermo del computer dopo l'introduzione dello stimolo. Altrimenti cerchi di riesporre il maschio a una femmina sessualmente matura / ricettiva durante la notte e poi custodirli da soli per diversi giorni o fino a una settimana prima di registrare di nuovo. Sulla base di osservazioni aneddotiche, scopriamo che alcuni maschi cantano molto in un giorno (per quasi tutti i 5 minuti), e non molto il giorno successivo, e poi ancora un altro giorno. Non sappiamo il motivo per cui si verifica tale variabilità di soggetto, ma supponiamo che sia probabilmente una motivazione o stagionale per i maschi e lo stato di estrusione per le urine femminili. Se non vengono registrati USV, cercare di registrare l'animale in più giorni per raccogliere questi effetti variabili. UnlIke in canti da canto, non abbiamo notato notevoli differenze nella quantità di canto basato sul tempo del giorno. Troviamo che i maschi non cantano molto (<100 sillabe in 5 minuti) prima che siano 7 settimane.

    I metodi di rilevazione qui presentati possono estrarre migliaia di sillabe e tutti i parametri acustici in pochi minuti. Ma come qualsiasi metodo di rilevamento automatico, è molto sensibile al rumore di fondo. Utilizzando il software di rilevazione Mouse Song Analyzer con registrazioni rumorose (ad esempio da animali registrati con biancheria da letto) può richiedere la regolazione della "soglia" di rilevazione per consentire maggiore flessibilità. Tuttavia, questo aumenterà anche il numero di sillabe false positive e il rilevamento automatico potrebbe non riuscire. In tali circostanze è possibile utilizzare codifica manuale.

    Come si è detto in precedenza, il numero, i repertori e la latenza delle vocalizzazioni sono ampiamente variabili a seconda del ceppo, quindi potrebbe essere necessario modificare i parametri (lunghezza di registrazione,Stimolo, rilevazione sillabazione automatica, ecc. ) Per alcuni ceppi per garantire registrazioni ottimali per analisi statistiche.

    Disclosures

    Gli autori non hanno niente da rivelare.

    Acknowledgments

    Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi Howard Hughes Medical Institute a EDJ. Ringraziamo Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI - Università Parigi sud XI - FRANCIA) per averci prestato l'hardware dell'altoparlante. Ringraziamo anche i membri del Jarvis Lab per il loro supporto, discussioni, correzioni e commenti su questo lavoro, in particolare Joshua Jones Macopson per aiuto con figure e prove. Ringraziamo il dottor Gustavo Arriaga per aiuto con il software Mouse Song Analyzer, aggiornandolo per V1.3 e altri aspetti di questo protocollo. V1.0 del software è stato sviluppato da Holy e Guo, e v1.1 e v1.3 da Arriaga.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sound proof beach cooler See Gus paper has more info on specific kind Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm):
    Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #40011 Includes extension cable 
    Ultrasound Gate 1216H sound card Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #34175 12 channel sound card
    Ultrasound Gate Player 216H Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #70117 2 channels playback player
    Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #60103 2 playback speakers
    Test cage  Ace #PC75J 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas
    plexiglas separation home made - 4 x 13 cm plexiglas with 1 cm holes
    Video camera Logitech C920 logitech HD Pro webcam C920
    Heat pad  Sunbeam 722-810-000
    Y-maze  Home made - Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm):
    Tweezers
    Software
    Avisoft Recorder (Software A) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    MATLAB R2013a (Software B) MathWorks - MATLAB R2013a (8.1.0.604)
    Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_
    v1.3-2015-03-23.zip
    Microsoft Office Excel 2013 (Software D) Microsoft - Microsoft Office Excel
    Song Analysis Guide v1.1 (Software E) Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx
    Syntax decorder v1.1 (Software F) Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis - in R studio https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/
    Graphiz (Software G) AT&T Research and others  http://www.graphviz.org
    Avisoft SASLab (Software H) Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany #10101, #10111, #10102, #10112 http://www.avisoft.com
    Reagents
    Xylazine (20 mg/mL) Anased -
    Ketamine HCl (100 mg/mL) Henry Schein #045822
    distilled water
    Eye ointment  Puralube Vet Ointment  NDC 17033-211-38
    Cotton tips
    Petri dish

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    References

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    Eliciting e analisi di canzoni ad ultrasuoni (USV) di topo maschio
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    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).More

    Chabout, J., Jones-Macopson, J., Jarvis, E. D. Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs. J. Vis. Exp. (123), e54137, doi:10.3791/54137 (2017).

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