Mus produserer et komplekst multisyllabelt repertoar med ultrasoniske vokaliseringer (USVs). Disse USVene er mye brukt som readouts for nevropsykiatriske lidelser. Denne protokollen beskriver noen av praksisene vi lærte og utviklet for konsekvent å indusere, samle og analysere de akustiske funksjonene og syntaksen til musesangene.
Mus produserer ultralyd vocalizations (USVs) i en rekke sosiale sammenhenger gjennom utvikling og voksenliv. Disse USVene brukes til mor-pup retrieval 1 , juvenile interaksjoner 2 , motsatte og samme kjønn interaksjoner 3 , 4 , 5 og territoriale interaksjoner 6 . I flere tiår har USVs blitt brukt av etterforskere som proxyer for å studere nevropsykiatriske og utviklings- eller adferdsforstyrrelser 7 , 8 , 9 , og mer nylig for å forstå mekanismer og evolusjon av vokalkommunikasjon blant vertebrater 10 . Innenfor seksuelle samspill produserer voksne mannlige mus USV-sanger, som har noen funksjoner som ligner sangfugler 11 . Bruken av slik multisyllabisk reperToires kan øke potensiell fleksibilitet og informasjon de bærer, da de kan varieres i hvordan elementene er organisert og rekombinert, nemlig syntaks. I denne protokollen beskrives en pålitelig metode for å fremkalle USV-sanger fra hannmus i ulike sosiale sammenhenger, som eksponering for fersk kvinnelig urin, bedøvede dyr og østrushunn. Dette inkluderer forhold for å indusere en stor mengde stavelser fra musene. Vi reduserer opptak av omgivende lyder med rimelige lydkamre, og presenterer en kvantifiseringsmetode for automatisk å detektere, klassifisere og analysere USVene. Sistnevnte inkluderer evaluering av samtale, vokalrepertoar, akustiske parametere og syntaks. Forskjellige tilnærminger og innsikt i bruk av avspillinger for å studere et dyrs preferanse for bestemte sangtyper er beskrevet. Disse metodene ble brukt til å beskrive akustiske og syntaksforandringer på tvers av forskjellige sammenhenger i hannmus, og sangpreferanser hos kvinnelige mus.
I forhold til mennesker produserer mus både lav- og høyfrekvensvokaliseringer, senere kjent som ultrasoniske vokaliseringer (USVs) over vårt høreområde. USVene er produsert i en rekke sammenhenger, blant annet fra mor-pup retrieval, juvenile interaksjoner, til motsatte eller samme kjønn vekselvirkninger 4 , 12 . Disse USVene er sammensatt av et mangfoldig multisyllabisk repertoar som kan kategoriseres manuelt 9 eller automatisk 10 , 11 . Disse USVs rolle i kommunikasjon har vært under økende etterforskning de siste årene. Disse inkluderer bruk av USVs som utlesninger av musemodeller av nevropsykiatriske, utviklings- eller adferdsforstyrrelser 7 , 8 og interne motiverende / emosjonelle tilstander 13 . USVene antas å formidle pålitelig informasjon på eMitters tilstand som er nyttig for mottakeren 14 , 15 .
I 2005 avgjorde Hellige og Guo 11 ideen om at voksne mannlige mus-USVer ble organisert som en rekke multisyllabiske samtaleelementer eller stavelser som ligner sangfugler. I mange arter tillater et multisyllabelt repertoar emitteren å kombinere og bestille stavelser på forskjellige måter for å øke den potensielle informasjonen som bæres av sangen. Variasjon i denne syntaksen antas å ha en etologisk relevans for seksuell oppførsel og kompispreferanser 16 , 17 . Etterfølgende studier viste at mannlige mus var i stand til å endre den relative sammensetningen av stavelsetyper de produserer før, under og etter tilstedeværelsen av en kvinne 5 , 18 . Det vil si at de voksne mannlige musene bruker sine USV'er for å opptre i rettssaker, enten for å tiltrekke segEller opprettholde nær kontakt med en kvinne, eller for å lette parringen 19 , 20 , 21 . De blir også utsendt i mannlige interaksjoner, sannsynligvis å formidle sosial informasjon under interaksjoner 4 . For å fange disse endringene i repertoarene, måler forskerne vanligvis spektralfunksjonene (akustiske parametere, for eksempel amplitude, frekvenser, etc. ), antall USVs stavelser eller samtaler, og latens til den første USV. Men få ser faktisk på sekvensdynamikken til disse USVene i detalj 22 . Nylig utviklet vår gruppe en ny metode for å måle dynamiske endringer i USV-stavelsessekvensene 23 . Vi viste at stavelsesordre i en sang om (nemlig syntaks) ikke er tilfeldig, at den endres avhengig av sosial kontekst, og at de lyttende dyrene oppdager disse endringene som etologisk relevante.
Vi noterer degHos mange undersøkere som studerer dyrkommunikasjon, legger ikke til begrepet "syntaks" den samme nøyaktige betydningen som syntaks brukt i menneskelig tale. For dyre kommunikasjon studier, betyr vi bare en ordnet, ikke-tilfeldig rekkefølgen av lyder med noen regler. For mennesker er det også kjent at bestemte sekvenser har spesifikke betydninger. Vi vet ikke om dette er tilfellet for mus.
I denne avisen og tilhørende video tar vi sikte på å gi pålitelige protokoller for å registrere mannlige muss forfølgelse USVer i ulike sammenhenger, og utføre avspillinger. Bruken av tre sekvensielt brukt programvare for: 1) automatiserte opptak; 2) stavelsesdeteksjon og koding; Og 3) en grundig analyse av stavelsesfunksjonene og syntaksen er vist ( figur 1 ). Dette tillater oss å lære mer om mannlige mus USV struktur og funksjon. Vi tror at slike metoder letter dataanalyser og kan åpne nye horisonter som karakteriserer normal og unormal vokalkommunikasjon i mouSe modeller for kommunikasjon og nevropsykiatriske lidelser, henholdsvis.
Denne protokollen gir tilnærminger til å samle, kvantifisere og studere mannlige museprospedisjoner i laboratoriet på tvers av en rekke hovedsakelig kvinnelige relaterte stimuli. Som vist tidligere i Chabout et al. 23 og i de representative resultatene, fikk bruk av denne metoden oss til å oppdage kontekstavhengige vokaliseringer og syntaks som betyr noe for de mottakende kvinnene. Standardiseringen av disse stimuliene vil gi innsamling av et pålitelig antall USV'er og tillate detaljerte analyser av mannens rettssanger og repertoarer.
Når en levende kvinne er til stede hos hannen, tillater protokollen ikke oss å tydelig identifisere emitteren av vokaliseringene. Tidligere studier viste imidlertid at flertallet av vokalisasjonene utgitt i en slik sammenheng var av mann 26 , 29 . De fleste av studiene bruker en spesifikke (mann eller kvinne)Som et stimulus for mennene tror at mengden kvinners vokaliseringer i disse sammenhengene er ubetydelig 4 , 5 , 22 , 30 . Imidlertid brukte en nylig papir anvendt triangulering til å lokalisere vokaliseringen av emitteren i gruppebehørte betingelser 31 , og viste at i en dyed bidrar kvinnen til ~ 10% av USVene. I den foreliggende protokollen tillater bruken av den bedøvede kvinnen at brukeren studerer mannlige vokaliseringer i nærvær av en kvinne uten hennes vokalisering. I motsetning til forventningene til denne nylige studien 31 fant vi ingen forskjell i antall stavelser utstilt mellom FE og AF-betingelsene 23 . Det er mulig at levende kvinner ikke bidro signifikant til opptakene, eller at mennene vokaliserte mindre i nærvær av levende kvinner mot anestesiert females. Likevel tror vi at fremtidige eksperimenter bør vurdere bruken av denne trianguleringsmetoden for å vurdere den potensielle effekten av kvinnelige bidrag.
Det finnes annen programvare tilgjengelig som kan gjøre noen trinnene vi har skissert, selv om vi ikke tror på en måte som er tilstrekkelig for de spørsmålene vi spurte ved hjelp av en kombinasjon av tre programmer: Software A, Mouse Song Analyzer programvare skript C ved hjelp av programvare B, Syntaksanalyseprogramvare ved hjelp av en D + E-beregning av egendefinerte regnearkprogrammer og syntaksdekorere ved hjelp av R. For eksempel har et nylig papir foreslått en programvare med navnet VoICE som lar brukeren automatisk trekke ut akustiske variabler fra sonogrammer eller direkte på enheter som var manuelt Valgt av brukeren 32 . Men de automatiserte eller semi-automatiserte sekvensanalysene er ikke like detaljerte som vår tilnærming. Noen kommersielle programvare kan automatisk analysere de akustiske egenskapene, men gir ikke en bilAtisk klassifisering av stavelsene; Brukeren må sortere de forskjellige stavelsene etterpå. Grimsley, Gadziola, et al. 33 utviklet et tabellbasert virtuelt mus vokalorganprogram som klynger stavelser basert på delte akustiske funksjoner, men gir ikke automatisk gjenkjenning av stavelsene. Deres program 34 er unikt ved at det skaper nye sekvenser fra innspilte sanger ved hjelp av Markov-modeller, og har dermed mer avanserte funksjoner enn enkel redigering.
De fleste tidligere kommunikasjonsstudier på mus har fokusert på emitterens side 35 , 36 . Få studier har undersøkt mottakerens side 30 , 37 , 38 . Avspillings- og diskrimineringsprotokoller gir en enkel test for å studere mottakers side, som den som også nylig er beskrevet av Asaba, Kato, etal. 39 . I den studien brukte forfatterne en to-valg test boks skilt med akustisk skum i stedet for Y-labyrintboksen som er beskrevet her. Begge valgoppsettene har fordeler og ulemper. For det første isolerer Y-labyrinten ikke lyden fra den ene armen til den andre, men tovalgskassen gjør det. Imidlertid kan dyret ved å bruke Y-labyrinten raskt vurdere de to sangene som spilles samtidig, og bevege seg mot den foretrukne. Likevel hjelper avspillingseksperimenter generelt eksperimenter med å bestemme betydningen og dermed funksjonene til vokaliseringene som genereres for spesifikke dyr. I konklusjonen, etter å ha behersket teknikkene til denne protokollen og analysene, bør leserne kunne adressere mange spørsmål som påvirker konteksten, genetikken og neurobiologien til musen USVs.
Ved hjelp av B6D2F1 / J-mus utløses de kvinnelige assosierte stimuliene nesten alltid USVs fra hannene vi har testet i vårt laboratorium. Det er kritisk å kollegaCt nok stavelser (> 100 i 5 min) for å kunne få sterk statistisk analyse. For å feilsøke, hvis ingen USV er registrert (eller ikke nok), kontroller du konfigurasjonen for å sikre at lydene blir tatt opp. Gjør en levende inspeksjon av hva som skjer i buret under opptak ved å se på sanntids sonogrammet på dataskjermen etter introduksjonen av stimulansen. Ellers forsøk å re-eksponere hannen til en seksuelt moden / mottakelig kvinne over natten, og husk dem alene i flere dager eller opptil en uke før du tar opp igjen. Basert på anekdotiske observasjoner, finner vi at noen hanner synger mye på en dag (for nesten hele 5 min), og ikke mye neste dag, og så igjen en annen dag. Vi vet ikke hvorfor slike innenfor fagvariabilitet oppstår, men vi antar at det sannsynligvis er en motiverende eller sesongmessig for mennene, og estrusstaten for kvinnelig urin. Hvis det ikke er registrert noen USV'er, kan du prøve å registrere dyret på flere dager for å hente disse variabelen. UNLIke i sangfugler, har vi ikke notert åpenbare forskjeller i mengden sang basert på tid på dagen. Vi finner at mennene ikke synger mye (<100 stavelser om 5 min) før de er 7 uker gamle.
Deteksjonsmetodene som presenteres her, kan trekke ut tusenvis av stavelser og alle de akustiske parametrene om noen få minutter. Men som en hvilken som helst automatisk deteksjonsmetode er den svært følsom overfor bakgrunnsstøy. Ved bruk av Mouse Song Analyzer-programvaren med støyende opptak (for eksempel fra dyr registrert med sengetøy) kan det bli nødvendig å justere gjenkjenningsgrensen for å gi mer fleksibilitet. Dette vil imidlertid også øke antall falske positive stavelser, og den automatiske deteksjonen kan mislykkes. Under slike omstendigheter kan manuell koding brukes.
Som nevnt tidligere er antallet, repertoarene og latensen av vokaliseringer varierte avhengig av belastningen, og man må derfor endre parametere (innspillingslengde,Stimulering, automatisert stavelsesdeteksjon, etc. ) for enkelte stammer for å sikre optimale innspillinger for statistiske analyser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Howard Hughes Medical Institute midler til EDJ. Vi takker Pr. Sylvie Granon (NeuroPSI – Universitetet Paris sør XI – FRANKRIKE) for å låne oss høyttalermaskinen. Vi takker også medlemmer av Jarvis Lab for deres støtte, diskusjoner, rettelser og kommentarer til dette arbeidet, spesielt Joshua Jones Macopson for hjelp med figurer og testing. Vi takker Dr. Gustavo Arriaga for å få hjelp med Mus Song Analyzer-programvaren, oppgradere den for oss til V1.3 og andre aspekter av denne protokollen. V1.0 av programvaren ble utviklet av Holy and Guo, og v1.1 og v1.3 av Arriaga.
Sound proof beach cooler | See Gus paper has more info on specific kind | Inside dimensions (L 27 x W 23 x H 47 cm): | |
Condenser ultrasound microphone CM16/CMPA | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #40011 | Includes extension cable |
Ultrasound Gate 1216H sound card | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #34175 | 12 channel sound card |
Ultrasound Gate Player 216H | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #70117 | 2 channels playback player |
Ultrasonic Electrostatic Speaker ESS polaroid | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #60103 | 2 playback speakers |
Test cage | Ace | #PC75J | 30 x 8 x 13 cm height; plexiglas |
plexiglas separation | home made | – | 4 x 13 cm plexiglas with 1cm holes |
Video camera | Logitech | C920 | logitech HD Pro webcam C920 |
Heat pad | Sunbeam | 722-810-000 | |
Y-maze | Home made | – | Inside dimensions (L 30 x W 11 x H 29 cm): |
Tweezers | |||
Software | |||
Avisoft Recorder (Software A) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
MATLAB R2013a (Software B) | MathWorks | – | MATLAB R2013a (8.1.0.604) |
Mouse Song Analyzer v1.3 (Software C) | Custom designed by Holy, Guo, Arriaga, & Jarvis; Runs with software B | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Mouse_Song_Analyzer_v1.3-2015-03-23.zip | |
Microsoft Office Excel 2013 (Software D) | Microsoft | – | Microsoft Office Excel |
Song Analysis Guide v1.1 (Software E) | Custom designed by Chabout & Jarvis. Excel calculator sheets, runs with software D | http://jarvislab.net/wp-content/uploads/2014/12/Song-analysis_Guided.xlsx | |
Syntax decorder v1.1 (Software F) | Custom designed by Sakar, Chabout, Dunson, Jarvis – in R studio | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ | |
Graphiz (Software G) | AT&T Research and others | http:// www.graphviz.org; | |
Avisoft SASLab (Software H) | Avisoft Bioacoustics, Berlin, Germany | #10101, #10111, #10102, #10112 | http://www.avisoft.com |
Reagents | |||
Xylazine (20mg/ml) | Anased | – | |
Ketamine HCL (100mg/ml) | Henry Schein | #045822 | |
distilled water | |||
Eye ointment | Puralube Vet Ointment | NDC 17033-211-38 | |
Cotton tips | |||
Petri dish |