Introduction
Visualisation de grandes molécules d'ADN attachés sur des surfaces de verre ou de perles a été utilisé pour étudier les interactions ADN-protéine, la dynamique des protéines sur le substrat d'ADN, de 1,2 et la physique des polymères 3,4 . Une plate - forme unique asservies de grandes molécules d'ADN a peu distincte avantages par rapport à d' autres méthodes d' ADN d'immobilisation. 5 d' abord, une grande molécule d'ADN attaché à la surface a une naturelle conformation aléatoire bobine sans un flux de cisaillement, ce qui est très important pour une protéine de liaison à l' ADN à reconnaître son site de liaison. En second lieu, il est très facile de changer l'environnement chimique dans les molécules d'ADN d'une série de réactions enzymatiques dans une chambre d'écoulement. En troisième lieu , un flux de cisaillement induit microfluidique ADN moléculaire d' étirage allant jusqu'à 100% de la longueur totale du contour, ce qui est très difficile à réaliser en utilisant les autres élongation d'ADN approches telles que l' immobilisation de la surface de confinement 6 et nanocanal. 7 Une entièrement stretched molécule d'ADN contient également des informations de position qui peuvent être utiles pour surveiller les mouvements enzymatiques sur la carte génomique.
Néanmoins, l'approche de l'ADN d'attache a une lacune critique en ce que le intercalant colorant tel que YOYO-1 provoque généralement des molécules d'ADN attachés à être facilement brisées par la lumière d'excitation de fluorescence. En règle générale, les grandes molécules d'ADN doivent être colorées avec un colorant fluorescent pour la visualisation sous un microscope à fluorescence. A cet effet, YOYO-1 ou d' autres colorants de la série de TOTO sont principalement utilisés parce que ces colorants fluorescents seulement quand ils intercalent ADN double brin. 8 Cependant, il est bien connu que les bis-intercalation colorant provoque l' ADN induite par la lumière photo-clivage parce de l'intercalation de fluorophores. 9 en outre, les molécules d'ADN colorées par fluorescence attachés à la surface sont plus fragiles car les flux de cisaillement peuvent exercer des forces de rupture se déplacer librement sur des molécules d'ADN. Par conséquent, nous avons développé FP-DBP comme un roman DNA-coloration des protéines de colorant pour former une image de grandes molécules d'ADN attachés à la surface. L'avantage de l' utilisation de FP-DBP est qu'il ne provoque pas de photo-clivage des molécules d'ADN auquel il se lie. 10 En outre, FP-DBP ne pas augmenter la longueur du contour de l' ADN, tandis que les bis-colorants intercalants augmentent la longueur du contour d'environ 33%.
Cette méthode vidéo présente l'approche expérimentale pour attacher les grandes molécules d'ADN sur une surface PEG-biotine. La figure 1 illustre les différentes approches de attacher l' ADN avec des extrémités franches et des extrémités cohésives. Ainsi, cette méthode de coloration peut être appliquée à tout type de molécule d'ADN. La figure 2 illustre une représentation schématique de l'ensemble de chambre de débit qui peut être commandé par une pompe à seringue pour générer des flux de cisaillement pour étirer les molécules d'ADN ainsi que pour charger chimique et enzymatique des solutions. la figure 3 montre des micrographies de molécules d'ADN complètement étirées attachés sur la PEGylatsurface ed 11 et colorées avec FP-DBP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ADN biotinylation
- Biotinylation d'ADN à extrémités franches en utilisant Terminal transférase (TdT)
Remarque: L'utilisation d'ADN T4 (166 kpb), qui est un ADN à extrémités franches.- Ajouter 5 ul de 2,5 mM CoCl2, 5 pi de 10 x tampon de réaction, 0,5 pi de 10 mM de biotine-11-dUTP, 0,5 ul d' une transferase terminale (10 unités) et 0,5 pi de T4 ADN (0,5 pg / pl) au mélange réactionnel. Faire un volume final de 50 ul en ajoutant 38,5 pi d'eau.
- Incuber le mélange réactionnel à 37 ° C pendant 1 heure.
Remarque: le temps de réaction prolongée peut donner l' ADN double-tethered, à savoir, il est possible que biotine sont marquées aux deux extrémités. - Arrêter la réaction en ajoutant 5 ul d'EDTA 0,5 M pH 8.
- Garder le tube à 4 ° C.
- Biotinylation de l' ADN à extrémité collante utilisant l' ADN ligase
Remarque: L'utilisation de l'ADN (48,5 kbp), qui est un ADN collant fin. <ol> - Ajouter 1 pi de ligase d'ADN T4, 5 pi de 10 x tampon de ligature, 1 pl de 25 ng / ul d'ADN de phage λ et ajouter 43 ul d'eau pour obtenir un volume final de 50 ul.
- Garder le tube à 4 ° C.
2. fonctionnalisés dérivatisation de surface
. Remarque: Afin d'attacher une extrémité d'une molécule d'ADN sur une surface de verre, un groupe amine primaire est silanisée sur une lamelle couvre -objet, suivie par un revêtement de biotine-PEG comme représenté sur la figure 1 Ce processus de pégylation est important pour l' imagerie d'ADN simple molécule parce qu'il peut diminuer de façon significative le bruit aléatoire créé par l'attachement des molécules indésirables sur la surface.
- Piranha Nettoyage
Remarque: Les solutions Piranha réagissent vigoureusement avec des matières organiques, il doit donc être manipulé avec soin, en suivant les directives de sécurité appropriées.- Lieu sur un lamelles de polytétrafluoroéthylène (PTFE) rack, et maintenez-les by PTFE Ruban d'étanchéité de fil de la longueur, la moitié sur le bord des surfaces et à moitié sur le rack. Après emballage, laisser une pièce longue (environ 5 cm) de bande pour manipuler la crémaillère pendant l'opération de nettoyage.
- Remplir un bécher de 1 L en verre avec 350 ml de H 2 SO 4 et 150 ml de H 2 O 2 pour rendre la solution piranha dans une hotte. Placer la grille dans une solution piranha pendant 2 heures.
- solution Empty piranha du bêcher, et des lamelles de rinçage avec de l'eau déminéralisée jusqu'à ce que le pH de l'eau dans le bécher atteint neutre. Utiliser des bandes de papier pH.
- Soniquer les grilles de lamelles de couverture dans le bécher contenant de l'eau, pendant 30 min. Vider l'eau du bécher juste avant amino silanisation. Utiliser 75 W de puissance de traitement par ultrasons pour nettoyer et transformer en dérivés des substrats en verre.
- Aminosilanization sur verre Surface
- Ajouter 2 ml de N - [3- (triméthoxysilyl) propyl] éthylènediamine et 10 ml d'acide acétique glacial à 200 mld'alcool méthylique dans un récipient en polypropylene propre pour préparer la solution de aminosilanization.
- Placer les lamelles nettoyées dans le récipient de polypropylène. Secouez à 100 rpm et la température ambiante pendant 30 min.
- Soniquer le bécher avec des lamelles dérivatisés pendant 15 min à 75 W. Secouez eux à 100 tours par minute et la température ambiante pendant au moins 30 min.
- Vider la solution dans le bêcher, puis rincer soigneusement les lamelles, une fois avec de l'alcool méthylique, et deux fois avec de l'alcool éthylique. des lamelles de Stocker dans l'alcool éthylique et les utiliser dans les deux semaines.
- La PEGylation de la lamelle
- Faire 10 ml de 0,1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO 3). On filtre la solution avec un filtre à seringue de 0,22 um.
- Dissoudre 2 mg de carbonate biotine-PEG-succinimidyle (biotine-PEG-SC) et 80 mg de PEG-succinimidyle valérate (mPEG-SVG) dans 350 pi de NaHCO 3. Utilisez un tube de protection contre la lumière.
- Vortex vigoureusement le tube pendant 10 sec, et centrifuger à 10000 × g pendant 1 min pour éliminer les bulles.
- Rincer une lame de verre avec de l'acétone, suivie d'un rinçage à l'alcool éthylique. Laisser la lame sécher à l'air complètement.
- Déposer une goutte (50 pi) de solution PEG sur la lame de verre propre. Couvrir la gouttelette doucement avec un amino silanisé lamelle, sans générer de bulles.
- Placer les lames pendant 3 heures pour la nuit dans un endroit sombre, bien nivelées chambre humide à température ambiante. Utilisez un support de pointe de la pipette vide comme la chambre, avec de l'eau au fond. Sceller solution résiduelle PEG dans le tube et le maintenir à 4 ° C.
- Rincer la lamelle pégylé abondamment avec de l'eau déminéralisée. Conservez-la dans un endroit sombre et sec jusqu'à utilisation.
3. Assembler une chambre de débit
- Fabriquer un support acrylique perforé, comme sur la figure 2. Assurez -vous que le diamètre de l'insert de tube est de 0,762 mm, et de désigner un trou est un orifice d' entrée et l'autre estune sortie (Figure 2).
- Placer double face collant des bandes de ruban (largeur de 5-6 mm) sur un support acrylique (figure 2), perpendiculairement à l' alignement d' un trou d'entrée et de sortie, sans perturber les trous de canal. Utilisez ces bandes de ruban comme des murs multi-canaux pour faire des chambres. Frotter la bande à l'aide d'une pointe de pipette.
- Placez une lamelle pégylé sur le dessus pour faire des chambres d'écoulement, avec le côté pégylé facedown.
- Pour éviter toute solution de fuir, appuyez sur le sommet d'une lamelle sur la zone où les bandes double face sont placés. Ajouter de la colle époxy à séchage rapide pour fermer les bords de la chambre en haut et en bas (de couleur jaune dans la figure 2).
- Connectez une courte pièce (2,5 cm) d'un tube (diamètre extérieur, OD, 0,042 ") à une seringue étanche aux gaz et sceller le joint avec de la colle époxy.
- Connecter un long tube flexible (DO: 0,03 ") pour le tube relié à la seringue et l'étanchéité du joint avec de la colle époxy.
- Remplissez le tubing liée à la seringue avec de l'eau DI. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles d'air.
- Insérer le tube dans le trou de la chambre d'écoulement scellée avec de la colle époxy.
- Placez une pointe jaune (200 pi pointe) de l'autre trou comme un réservoir.
4. Echantillon Chargement en chambre de débit
Remarque: neutravidine peut être remplacée par d'autres protéines telles que l'avidine streptavidine. Toutes les réactions peuvent être effectuées à la température ambiante, à moins qu'elle ne soit mentionnée. Prenez solution d'échantillon dans une pointe jaune, et installer la pointe avec la solution sur le trou du support acrylique (Figure 2b).
- Régler le débit de la pompe de la seringue d'écoulement à 50 pi / min. Charge 20 pi de protéine avidine (25 ug / ml dans une solution T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8) et la maintenir pendant 10 minutes.
- Charge 20 pi de oligodésoxynucléotides biotinylé (100 uM dans 1 x TE), et le garder pendant 10 min. Si transférase terminal est utilisé, passez le chargementdes oligodésoxynucléotides.
- Charge 20 pi de solution d'ADN de l'étape 1 dans la chambre d'écoulement à un débit de 10 ul / min, et le garder pendant 30 min.
- Laver la chambre d'écoulement avec 1 x TE et on charge 40 pi de FP-DBP 10 (~ 80 nM).
- ADN observer au microscope à fluorescence avec un écoulement continu des molécules de coloration dans 1 x TE à un objectif 60X. Utilisez 488 nm laser à état solide pour l'excitation de FP (eGFP) -dbp. Pour la pleine étendue de molécules d'ADN, appliquer des débits différents en fonction des longueurs d'ADN utilisées. Par exemple, appliquer 50 pl / min 48,5 kbp d'ADN λ, et 100 pi / min pour 166 kbp de T4 ADN.
- Pour le recyclage du support acrylique, trempez chambres d'écoulement assemblés dans une solution de détergent ménager 12. Retirer les bandes et les époxy avec une lame de rasoir et frotter avec les mains pour prendre complètement les. Déboucher les trous avec des aiguilles de seringues. Gardez les supports dans de l'eau déminéralisée jusqu'à utilisation ultérieure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La figure 1 montre deux méthodes d' ADN d'attache différentes en fonction des structures terminales de la molécule d'ADN. La figure 1a montre comment les molécules d'ADN à extrémités cohésives sont hybridés avec des oligonucléotides biotinylés complémentaires, qui sont immobilisés sur la surface de PEG revêtues d' avidine. La figure 1b montre l'addition de biotinylé ddNTP ou dNTP à un groupe hydroxyle 3 'd'un ADN à extrémités franches par la terminale transférase. Nous avons ajouté des lieurs flexibles entre les molécules d'ADN et la biotine. Cette augmentation de la ligature et avidine-biotine efficacité de liaison pour fournir un espace suffisant pour que les réactions. La figure 1c montre la représentation schématique générale de l' ADN attache sur la surface de PEG revêtues d' avidine.
La figure 2 représente l'ensemble de la chambre d'écoulement le long d'un support acrylique. Par rapport au verres / lamelles en verre de quartz, un support acrylique sur mesure simplifie la préparation de la chambre d'écoulement pour la microscopie épi-fluorescence. 12 La chambre d'écoulement permet de modifier instantanément les conditions de tampon pour les réactions enzymatiques, 6 et d' étirement des molécules d'ADN.
La figure 3 montre l' ADN simple attaché et T4 colorées avec FP ADN X-DBP. cisaillement microfluidique flux allongés molécules d'ADN simple jusqu'à des longueurs de contour complètes telles que 16,5 um (ADN de 48,5 kb x 0,34 nm) et 56,4 um (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Nous avons été en mesure de répéter l' ADN d' étirement et de relaxation plusieurs fois pendant une période prolongée (par exemple, une demi-heure), puisque nous avons utilisé FP-DBP qui ne provoque pas de photo-clivage.
Figure 1. Représentation schématique de l' ADN tethering. a) A sL'ADN à extrémité ticky est hybridé avec un oligonucléotide complémentaire biotinylé. Triéthylèneglycol est un segment de liaison flexible entre l'oligonucléotide et la biotine. B) biotinylé dNTP est ajoutée à une extrémité franche d'ADN double brin, par la terminale transférase. Polycarbone entretoise (11 atomes de carbone) est un segment de liaison flexible entre les dNTP et de la biotine. C) l' ADN biotinylé est ancré à une protéine avidine, qui est lié à un PEG biotinylé lié de façon covalente à la surface du verre. Le rapport du PEG biotinylé au PEG normale était de 0,025 (01h40). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Chambre de circulation. a) la chambre de débit constitué d'un support de résine d'acide acrylique, des bandes de rubans double face et un pégylé lamelle. Le support acrylique de dimensions 76 mm x 26 mm x 5 mm (L x P x H), a été fabriqué avec la découpe laser b) Vue de côté de la chambre de débit:. Poinçonné trous sont un orifice d'entrée sur laquelle une pointe jaune est installé pour un réservoir tampon, et un orifice de sortie qui est relié à un tube contrôlé par une seringue-pompe. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. images microscopiques fluorescentes de molécules d'ADN étirées colorées avec FP-DBP. a) Les bactériophages d'ADN (48,5 kpb) attaché à la surface après la ligature avec des oligonucléotides complémentaires biotinylés. b) bactériophage T4 ADN (166 kpb) attaché à la surface après addition de la biotine avec la transferase terminale. flèches indiquées montrent l'ADN molecules étirées jusqu'à leur longueur de contour complet telles que 16,5 um pour l'ADN λ et 56,4 um pour T4 DNA. Barres d'échelle:. 10 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ici, nous présentons une plate-forme de visualisation de longues molécules d'ADN biotinylées pour l'ancrage sur les surfaces. Nous avons rapporté une approche pour les molécules d'ADN attachés sur une surface protéine avidine revêtue d'biotinylé sérum - albumine bovine. 6 Dans la première approche, nous avons trouvé un problème crucial de l' ADN photo-clivage provoqué par les colorants bis-intercalation qui tachent les molécules d'ADN attaché sur la surface. Etant donné que ces fluorophores excités en permanence ont une forte probabilité d'attaquer un squelette phosphate de l' ADN, 9 la puissance de lumière d'excitation doit être réduite au minimum pour éviter la photo-clivage.
Afin de remédier à cet inconvénient, nous avons développé génétiquement des protéines fluorescentes avec une capacité de liaison à l' ADN (FP-DBP) pour coloration de l' ADN sans photo-clivage. 10 Nous avons observé une coloration de l' ADN fiable sur les surfaces de protéines avidine. Néanmoins, cette plate-forme avait une autre question de l'agrégation indésirable des protéines fluorescentes sur lesurface de la protéine, ce qui entraîne une augmentation du bruit de fond. Il est essentiel de réduire ce bruit aléatoire pour l'analyse de l'ADN simple molécule pour améliorer le contraste de l'ADN et des protéines à partir de l'arrière-plan. L'utilisation de FP-DBP nécessite donc une passivation de surface pour éviter la protéine fluorescente d'être adsorbée sur la surface. PEG pourrait être un candidat efficace à cette fin. 12 Par conséquent, nous avons utilisé le PEG-biotinylé, qui a amélioré considérablement le rapport signal sur bruit pour l' imagerie de molécules d'ADN FP-DBP colorés attachés à la surface.
Il y a plusieurs étapes critiques et des notes dans cette méthode pour des rendements plus élevés. Dans le but d'attacher une extrémité d'une molécule d'ADN sur une surface de verre, un groupe amine primaire est silanisée sur une lamelle couvre -objet, suivie par un revêtement de biotine-PEG comme représenté sur la figure 1. Ce procédé de passivation de surface est critique pour l' imagerie d'ADN simple molécule parce qu'il peut réduire considérablement le bruit de génération aléatoire d'adsorption sur les surfaces.Par conséquent, pendant la nuit et aminosilanization PEGylation sont fortement recommandées. En outre, le nettoyage de la lame de verre ainsi que le cache de verre avec une solution piranha peut réduire davantage le bruit de fond.
Un oligonucleotide biotinylé doit avoir un groupe phosphate à l'extrémité 5 ', afin de le relier à 3' un groupe hydroxyle d'une grande molécule d'ADN. La séquence de l'oligonucléotide biotinylé est 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotine-3 'pour λ tethering d'ADN. La solution d'ADN de λ doit être chargé juste après la préparation de la solution d'ADN λ (décrit en 1.1), car λ ADN se forme souvent des concatémères avec un stockage de longue durée. Pour l'ADN à extrémités franches telles que T4 DNA, transférase terminal peut ajouter dUTP biotinylé aux deux extrémités de l'ADN sans spécificité. Ainsi, le terminal le temps de réaction de transférase doit être soigneusement ajusté autour d' une heure, sinon la réaction prolongée peut donner l' ADN double-marqué (ie, les deux extrémités sont marquées avec de la biotine). En complémentition d'ADN viral tel que λ et T4, tous les types d'ADN peut être utilisé dans cette plate-forme. Toutefois, il est recommandé d'utiliser des fragments d'ADN génomique par digestion gigantesque après des enzymes de restriction coupe-rares tels que le Swal ou Notl.
débits différents sont appliqués à différentes longueurs d'ADN. En général, les molécules d'ADN plus longues nécessitent des débits plus rapides pour étirer complètement les molécules d'ADN, pour correspondre à la longueur du contour précis. Par exemple, λ ADN peut s'étendre jusqu'à 16,5 um, ce qui correspond à la valeur calculée de 0,34 nm x 48 502 pb.
Il est très important de préparer fraîchement tous les matériaux, en particulier toutes les protéines et les PEGs. Par exemple, la neutravidine perd rapidement sa fonction de liaison de biotine si elle est stockée sous la forme d'une solution diluée. Pour les solutions de PEG, le pH est critique pour conjuguer des groupes fonctionnels d'une amine primaire et le N-hydroxysuccinimide. Par conséquent, il est recommandé de préparer tous les matériaux fraîchement au moins chaque semaine.
Visualisation de grandes molécules d'ADN attachés à la surface est une plate-forme souple pour être appliquée pour une variété d'applications telles que la génomique, épigénomique, études biochimiques pour l'ADN et de l'interaction de la protéine, et des études de physique des polymères. Cependant, cette approche ne se limite actuellement à modéliser des systèmes utilisant des molécules d'ADN relativement simples et bien connues telles que le génome viral. Pour être étendue au génome humain et épigénome, il est extrêmement important de mettre en place une plate-forme robuste, fiable, et simple pour une utilisation pratique. En surmontant l'ADN photo-clivage induit par la lumière et la prévention de l'adsorption aléatoire de la protéine fluorescente à la surface, cette plate-forme fournit donc des images claires et à fort contraste pour l'ADN allongé avec des flux de cisaillement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulfuric acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95% Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35% in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99% Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9% Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9% Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99% Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76 mm x 26 mm x 1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct Mechanical Measurements of the Elasticity of Single DNA-Molecules by Using Magnetic Beads. Science. 258 (5085), 1122-1126 (1992).
- Finkelstein, I. J., Visnapuu, M. -L., Greene, E. C. Single-molecule imaging reveals mechanisms of protein disruption by a DNA translocase. Nature. 468 (7326), 983-987 (2010).
- Doyle, P. S., Ladoux, B., Viovy, J. L. Dynamics of a tethered polymer in shear flow. Phys. Rev. Lett. 84 (20), 4769-4772 (2000).
- Perkins, T. T., Quake, S. R., Smith, D. E., Chu, S. Relaxation of a Single DNA Molecule Observed by Optical Microscopy. Science. 264 (5160), 822-826 (1994).
- Cai, W., et al. Ordered restriction endonuclease maps of yeast artificial chromosomes created by optical mapping on surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (11), 5164-5168 (1995).
- Kim, Y., Jo, K. Neutravidin coated surfaces for single DNA molecule analysis. Chem. Comm. 47 (22), 6248-6250 (2011).
- Kim, Y., et al. Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length. Lab on a Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).
- Glazer, A. N., Rye, H. S. Stable dye-DNA intercalation complexes as reagents for high-sensitivity fluorescence detection. Nature. 359 (6398), 859-861 (1992).
- Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers. Langmuir. 22 (1), 292-299 (2006).
- Lee, S., et al. DNA binding fluorescent proteins for the direct visualization of large DNA molecules. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nat Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. J. Vis. Exp. (86), e50549 (2014).
