Introduction
La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati sulle superfici di vetro o perline è stato utilizzato per lo studio delle interazioni DNA-proteina, la dinamica delle proteine su substrato di DNA, 1,2 e fisica dei polimeri. 3,4 Una piattaforma per le grandi molecole di DNA a singolo tethered ha pochi distinta vantaggi rispetto ad altri metodi di immobilizzazione DNA. 5 primo, una grande molecola di DNA legato sulla superficie ha una naturale conformazione random coil senza un flusso di taglio, che è criticamente importante per una proteina di legame al DNA di riconoscere suo sito di legame. In secondo luogo, è molto facile cambiare l'ambiente chimico intorno molecole di DNA per una serie di reazioni enzimatiche in una camera di flusso. In terzo luogo, un flusso di taglio microfluidico induce DNA molecolare estende fino al 100% della lunghezza del profilo completo, che è molto difficile da ottenere con allungamento DNA approcci alternativi come superficie di immobilizzazione 6 e nanochannel confinamento. 7 Un completamente stretched molecola di DNA fornisce anche informazioni di posizione che può essere utile per il controllo dei movimenti enzimatici sulla mappa genomica.
Tuttavia, l'approccio tethering DNA ha una lacuna critica che tintura del intercalante come YOYO-1 provoca generalmente molecole di DNA legato ad essere facilmente rotto dalla luce di fluorescenza di eccitazione. Generalmente, grandi molecole di DNA devono essere colorato con un colorante fluorescente per la visualizzazione al microscopio a fluorescenza. A questo scopo, YOYO-1 o altri coloranti della serie TOTO sono utilizzati principalmente perché questi coloranti fluorescenti solo quando intercalare DNA a doppia elica. 8 Tuttavia, è ben noto che bis intercalanti colorante provoca DNA indotta dalla luce foto-scissione, perché della intercalazione di fluorofori. 9 Inoltre, molecole di DNA fluorescente macchiate impastoiati in superficie sono più fragili in quanto i flussi di taglio possono esercitare rottura forze sul liberi di muoversi molecole di DNA. Pertanto, abbiamo sviluppato FP-DBP come un romanzo Ddye proteina NA-colorazione per l'imaging di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie. Il vantaggio di utilizzare FP-DBP è che non provoca foto-scissione delle molecole di DNA a cui si lega. 10 Inoltre, FP-DBP non aumenta la lunghezza del profilo del DNA, mentre bis-intercalanti coloranti aumentano la lunghezza del profilo di circa il 33%.
Questo metodo di video introduce l'approccio sperimentale per legare grandi molecole di DNA ad una superficie PEG-biotina. La Figura 1 illustra i diversi approcci di legare il DNA con estremità smussata ed estremità appiccicose. Così, questo metodo di colorazione può essere applicato a qualsiasi tipo di molecola di DNA. La Figura 2 illustra una rappresentazione schematica del gruppo camera di flusso che può essere controllata da una pompa a siringa per generare flussi di taglio per allungare molecole di DNA e per caricare chimica ed enzimatica soluzioni. la figura 3 mostra micrografie di molecole di DNA completamente allungato impastoiati sul PEGylatdi superficie ed 11 e colorati con FP-DBP.
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Protocol
1. DNA biotinilazione
- Biotinilazione di blunt DNA ended utilizzando Terminal transferasi (TdT)
Nota: utilizzare T4 DNA (166 kbp), che è un DNA ended smussato.- Aggiungere 5 ml di 2,5 mM CoCl 2, 5 ml di 10 × tampone di reazione, 0,5 ml di 10 mM biotina-11-dUTP, 0.5 ml di transferasi terminale (10 unità) e 0,5 ml di T4 DNA (0,5 mcg / ml) alla miscela di reazione. Rendere ad un volume finale di 50 ml aggiungendo 38,5 ml di acqua.
- Incubare la miscela di reazione a 37 ° C per 1 ora.
Nota: tempo di reazione totale può produrre DNA a doppia legato, cioè, è possibile che biotins vengono contrassegnati alle due estremità. - Arrestare la reazione aggiungendo 5 ml di 0,5 M EDTA, pH 8.
- Tenere il tubo a 4 ° C.
- Biotinilazione di DNA ended appiccicoso Utilizzando DNA Ligase
Nota: utilizzare λ DNA (48,5 kbp), che è un DNA appiccicoso-end. <ol> - Aggiungere 1 ml di T4 DNA ligasi, 5 microlitri di 10 × tampone di legatura, 1 ml di 25 ng / ml DNA λ fago, e aggiungere 43 ml di acqua per fare un volume finale di 50 pl.
- Tenere il tubo a 4 ° C.
2. funzionalizzato Derivatizzazione Surface
Nota:. Per legare una estremità di una molecola di DNA sulla superficie di vetro, un gruppo amminico primario è silanizzato su un vetrino seguita da rivestimento biotina-PEG come mostrato in Figura 1 Il processo PEGylation è importante per l'imaging DNA a singola molecola perché può ridurre significativamente il rumore casuale creato da attaccamento di molecole indesiderate sulla superficie.
- Piranha Pulizia
Nota: Le soluzioni Piranha reagire violentemente con materiali organici, pertanto, deve essere maneggiato con cura, seguendo le linee guida di sicurezza adeguate.- Luogo coprioggetto su un politetrafluoroetilene (PTFE) cremagliera, e tenere premuto By PTFE nastro sigillante filo longitudinale, metà sul bordo delle superfici e per metà sul rack. Dopo il confezionamento, lascia un lungo pezzo (~ 5cm) di nastro per la movimentazione della rastrelliera durante la procedura di pulizia.
- Riempire un bicchiere di vetro 1 L con 350 ml di H 2 SO 4 e 150 ml di H 2 O 2 per rendere soluzione piranha in una cappa aspirante. Inserire la griglia in soluzione piranha per 2 ore.
- soluzione Piranha vuoto dal bicchiere, e coprioggetto risciacquo con acqua deionizzata fino a che il pH dell'acqua nel bicchiere raggiunge neutra. Utilizzare strisce di carta pH.
- Sonicare i rack di vetrini in acqua bicchiere contenente, per 30 min. acqua vuota dal bicchiere appena prima che amino silanizzazione. Utilizzare 75 W di potenza sonicazione per pulire e derivatize i substrati di vetro.
- Aminosilanization sulla superficie di vetro
- Aggiungere 2 ml di N - [3- (trimethoxysilyl) propil] etilendiammina e 10 ml di acido acetico glaciale a 200 mldi alcool metilico in un contenitore di polipropilene pulito per la preparazione della soluzione aminosilanization.
- Mettere vetrini puliti nel contenitore in polipropilene. Agitare a 100 rpm e temperatura ambiente per 30 min.
- Sonicare il bicchiere con derivatizzati vetrini per 15 minuti a 75 W. scuoterli a 100 rpm e temperatura ambiente per almeno 30 minuti.
- Svuotare la soluzione dal bicchiere, e risciacquare coprioggetto con attenzione, una volta con alcool metilico, e due volte con alcol etilico. coprioggetto Conservare in alcool etilico e utilizzarli entro due settimane.
- PEGylation del vetrino
- Rendere 10 ml di 0,1 M sodio bicarbonato (NaHCO 3). Filtrare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron.
- Sciogliere 2 mg di carbonato di biotina-PEG-succinimidile (biotina-PEG-SC) e 80 mg di PEG-succinimidyl valerato (MPEG-SVG) in 350 ml di NaHCO 3. Utilizzare un tubo di protezione dalla luce.
- Agitare la provetta con forza per 10 sec e centrifugare a 10.000 g per 1 min per rimuovere le bolle.
- Risciacquare un vetrino con acetone, seguito da risciacquo con alcool etilico. Lasciare che il vetrino all'aria asciugare completamente.
- Mettere una goccia (50 ml) di soluzione di PEG sul vetrino pulito. Coprire la goccia delicatamente con un amino silanizzata copertura di slittamento, senza generare eventuali bolle.
- Collocare i vetrini per 3 ore per una notte in un buio, ben livellato camera umida a temperatura ambiente. Utilizzare un titolare di punta della pipetta vuoto come la camera, con acqua sul fondo. Sigillare soluzione residua PEG nel tubo e la tiene a 4 ° C.
- Sciacquare il vetrino PEGylated accuratamente con acqua deionizzata. Conservare in un luogo buio e asciutto fino al momento dell'uso.
3. Assemblare una camera di flusso
- Realizzare un supporto acrilico perforato, come in Figura 2. Assicurarsi che il diametro dell'inserto tubo è 0,762 millimetri e designare un foro è un ingresso e l'altro èuna uscita (figura 2).
- Posizionare nastri biadesivi Nastro adesivo (larghezza 5-6 mm) su un supporto acrilico (Figura 2), allineando perpendicolarmente ad un foro di ingresso e di uscita, senza perturbare fori canale. Utilizzare queste strisce di nastro come pareti multi-canale per rendere camere. Scrub il nastro utilizzando una punta di pipetta.
- Posizionare un vetrino PEGylated sulla parte superiore per fare camere di flusso, con il lato rivolto verso il basso PEGylated.
- Per evitare qualsiasi soluzione fuoriuscita, premere la parte superiore di un coprioggetto sopra la zona in cui vengono inseriti nastri biadesivi. Aggiungere colla quick-dry epossidica per chiudere i bordi della camera in alto e in basso (colore giallo nella figura 2).
- Collegare un breve brano (2,5 cm) di tubo (diametro esterno, OD, 0,042 ") per una siringa a tenuta di gas e sigillare il giunto con colla epossidica.
- Collegare un lungo tubo flessibile (OD: 0.03 ") per il tubo collegato alla siringa e sigillare il giunto con colla epossidica.
- Riempire il tubing collegato alla siringa con acqua deionizzata. Assicurarsi che non vi è alcuna bolla d'aria.
- Inserire il tubo nel foro della camera di flusso sigillato con colla epossidica.
- Mettere una punta gialla (200 microlitri punta), dall'altro foro come un serbatoio.
4. Esempio Caricamento in camera di flusso
Nota: neutravidina può essere sostituito con altre proteine avidina come streptavidina. Tutte le reazioni possono essere eseguite a temperatura ambiente, che sono menzionate. Prendere soluzione campione in una punta di colore giallo, e installare la punta con la soluzione sul foro del supporto acrilico (Figura 2b).
- Impostare la portata della pompa a siringa a 50 ml / min. Carico 20 ml di proteina avidina (25 ug / ml in soluzione T50, Tris 10 mM, NaCl 50 mM, pH 8), e tenerlo per 10 min.
- Carico 20 l di oligonucleotidi biotinilati (100 micron di 1 × TE), e tenerlo per 10 minuti. Se si utilizza transferasi terminale, saltare il caricodi oligonucleotidi.
- Carico 20 ml di soluzione di DNA dal punto 1 nella camera di flusso ad una portata di 10 ml / min, e tenerlo per 30 min.
- Lavare la camera di flusso con 1 × TE, e caricare 40 ml di FP-DBP 10 (~ 80 Nm).
- Osservare DNA sotto un microscopio a fluorescenza con flusso continuo di molecole di colorazione in 1 × TE su una lente obiettivo 60X. Utilizzare 488 nm laser a stato solido per l'eccitazione di FP (eGFP) -DBP. Per la piena tratto di molecole di DNA, si applicano diverse portate a seconda delle lunghezze di DNA utilizzati. Ad esempio, applicare 50 microlitri / min 48,5 kbp di DNA λ, e 100 microlitri / min per 166 kbp di T4 DNA.
- Per il riciclaggio del titolare acrilico, immergere camere a flusso assemblati in una soluzione detergente per la casa 12. Rimuovere nastri e resina epossidica con una lama di rasoio e strofinare con le mani per prendere completamente fuori. Sbloccare fori con aghi da siringa. Mantenere i titolari in acqua deionizzata fino a nuovo uso.
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Representative Results
La Figura 1 mostra due diversi metodi tethering DNA seconda strutture terminali della molecola di DNA. Figura 1a illustra come i appiccicose molecole di DNA ended sono ibridate con oligonucleotidi biotinilati complementari, che sono immobilizzati sulla superficie PEG avidina-rivestita. Figura 1b mostra l'aggiunta di biotinilato ddNTP o dNTP al gruppo idrossilico 3 'di un DNA ended smussato da transferasi terminale. Abbiamo aggiunto linker flessibili tra molecole di DNA e biotina. Ciò ha aumentato la legatura e avidina-biotina efficienza di legame per fornire spazio sufficiente per le reazioni. Figura 1c illustra la rappresentazione schematica complessiva per il tethering DNA sulla superficie PEG avidina-rivestita.
Figura 2 illustra il montaggio della camera di flusso insieme a un supporto acrilico. Rispetto al Glass / quarzo vetrini, un supporto acrilico su misura semplifica la preparazione della camera di flusso per la microscopia epi-fluorescenza. 12 La camera di flusso consente cambiamento istante di condizioni di buffer per reazioni enzimatiche, 6 e si estende molecole di DNA.
La figura 3 mostra DNA a singolo legato e T4 λDNA macchiato con FP-DBP. taglio Microfluidic scorre allungate singole molecole di DNA fino a lunghezze pieni di contorno come il 16,5 micron (48,5 kb λ DNA x 0,34 nm) e 56,4 micron (166 kb T4 DNA x 0,34 nm). Siamo stati in grado di ripetere DNA stretching e rilassamento più volte durante un periodo prolungato (ad esempio, mezz'ora), dal momento che abbiamo utilizzato FP-DBP che non provoca foto-scissione.
Figura 1. Schema di tethering DNA. a) A sDNA ended ticky è ibridato con un oligonucleotide complementare biotinilato. Glicole trietilenico è un linker flessibile tra l'oligonucleotide e biotina. B) biotinilato dNTP viene aggiunto a una punta smussata di DNA a doppio filamento, da transferasi terminale. Polycarbon distanziale (11-atomi) è un linker flessibile tra dNTP e biotina. C) biotinilato DNA è ancorata ad una proteina avidina, che è collegato a un PEG biotinilato legato in modo covalente alla superficie del vetro. Il rapporto tra PEG biotinilato alla normalità PEG era 0.025 (01:40). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. camera di flusso. a) camera di flusso costituito da un supporto acrilico resina acida, strisce di nastro a doppia faccia e una copertura di slittamento PEGylated. Il supporto acrilico di dimensioni 76 millimetri x 26 mm x 5 mm (L x W x H), è stato fabbricato con taglio laser b) Vista laterale della camera di flusso:. Perforato buchi sono una luce di ingresso su cui è installata una punta di colore giallo per il un serbatoio tampone e una luce di uscita collegata ad un tubo comandato da una siringa pompa. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. immagini microscopiche fluorescenti di molecole di DNA allungate colorati con FP-DBP. a) batteriofago λ DNA (48,5 kbp) legato sulla superficie dopo la legatura con oligonucleotidi complementari biotinilati. b) batteriofago T4 DNA (166 kb) legato in superficie dopo l'aggiunta di biotina con transferasi terminale. frecce indicate mostrano molecul DNAES allungato fino a loro lunghezze pieni di contorno come il 16,5 micron per il DNA λ e 56,4 micron per T4 DNA. Barre di scala:. 10 micron Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui vi presentiamo una piattaforma per la visualizzazione di molecole di DNA lunghe biotinilati per l'ancoraggio sulle superfici. Abbiamo riportato un approccio per molecole di DNA impastoiati su una superficie rivestita proteina avidina con biotinilato albumina sierica bovina. 6 Nell'approccio in precedenza, abbiamo trovato una questione cruciale del DNA foto-scissione causata da coloranti bis-intercalazione che macchiano molecole di DNA legato alla superficie. Poiché questi fluorofori continuamente eccitati hanno un'alta probabilità di attaccare un backbone fosfato di DNA, 9 potenza luce di eccitazione doveva essere minimizzata per evitare foto-scissione.
Al fine di ovviare a questo inconveniente, abbiamo sviluppato geneticamente proteine fluorescenti con capacità DNA-binding (FP-DBP) per il DNA colorazione senza foto-scissione. 10 Abbiamo osservato affidabile colorazione del DNA su superfici proteina avidina rivestite. Tuttavia, questa piattaforma ha avuto un altro problema di aggregazione indesiderabile delle proteine fluorescenti sulsuperficie di proteine, con conseguente aumento del rumore di fondo. È essenziale per minimizzare questo rumore casuale per analisi del DNA singola molecola per migliorare il contrasto di DNA e proteine dallo sfondo. L'uso di FP-DBP richiede quindi passivazione della superficie per evitare che la proteina fluorescente venga adsorbito sulla superficie. PEG potrebbe essere un candidato potente per questo scopo. 12 Quindi, abbiamo usato biotinilato-PEG, che notevolmente migliorato rapporto segnale-rumore per molecole di DNA di imaging FP-DBP macchiati impastoiati sulla superficie.
Ci sono diversi passaggi critici e note in questo metodo per rendimenti più elevati. Per legare una estremità di una molecola di DNA su una superficie di vetro, un gruppo amminico primario è silanizzato su un vetrino seguita da rivestimento biotina-PEG come mostrato in Figura 1. Questo processo di passivazione della superficie è critica per l'imaging DNA a singola molecola perché può ridurre significativamente il rumore che generano adsorbimento casuale sulle superfici.Pertanto, durante la notte e aminosilanization PEGylation sono fortemente raccomandati. Inoltre, la pulizia del vetrino, nonche la vetrata con soluzione piranha può ridurre ulteriormente il rumore di fondo.
Un oligonucleotide biotinilato deve avere un gruppo fosfato al 5 'per collegarlo al 3' gruppo ossidrile di una grande molecola di DNA. La sequenza di oligonucleotide biotinilato è 5'-p-GGGCGGCGACCT-TEG-biotina-3 'per λ tethering DNA. La soluzione λ DNA deve essere caricato subito dopo la preparazione della soluzione di DNA λ (descritto al punto 1.1), perché λ DNA costituisce spesso concatemers con la conservazione a lungo tempo. Per DNA blunt-ended come T4 DNA, transferasi terminale può aggiungere dUTPs biotinilati alle due estremità del DNA senza specificità. Così, il tempo di reazione transferasi terminale deve essere regolata con attenzione circa un'ora, altrimenti la reazione prolungato può produrre il DNA a doppia etichetta (ad esempio, entrambe le estremità sono etichettati con biotina). in addition al DNA virale, come λ e T4, qualsiasi tipo di DNA può essere utilizzato in questa piattaforma. Tuttavia, si consiglia di utilizzare frammenti di DNA genomico gigantesco dopo la digestione con rara cutter enzimi di restrizione, come Swai o Noti.
Diverse portate sono applicate per diverse lunghezze di DNA. Di solito, più lunghe molecole di DNA richiedono velocità di flusso più veloce per allungare pienamente le molecole di DNA, per abbinare la lunghezza esatta di contorno. Ad esempio, λ DNA può allungare fino a 16,5 micron, che corrisponde al valore calcolato di 0,34 nm x 48.502 bp.
E 'molto importante preparare appena tutti i materiali, in particolare tutti proteine e PEG. Ad esempio, neutravidina perde facilmente la sua funzione di biotins vincolante se viene conservato come una soluzione diluita. Per soluzioni PEG, pH è critico per coniugare gruppi funzionali di una ammina primaria e n-idrossi. Pertanto, si raccomanda di preparare appena tutti i materiali almeno ogni settimana.
La visualizzazione di grandi molecole di DNA impastoiati in superficie è una piattaforma versatile da applicare per una varietà di applicazioni quali la genomica, epigenomica, studi biochimici per il DNA e l'interazione delle proteine, e gli studi di fisica dei polimeri. Tuttavia, questo approccio è attualmente limitata solo per modellare sistemi che utilizzano molecole di DNA relativamente semplici e noti come il genoma virale. Per essere esteso al genoma umano e epigenoma, è di fondamentale importanza per stabilire una piattaforma robusta, affidabile e semplice per l'uso pratico. Superando indotta dalla luce DNA photo-scissione e prevenire l'adsorbimento casuale di proteina fluorescente sulla superficie, questa piattaforma fornisce quindi immagini nitide e ad alto contrasto per DNA allungata con flussi di taglio.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. DNA Biotinylation | |||
| 1.1) Biotinylation of blunt-end DNA using Terminal Transferase (TdT) | |||
| Terminal Transferase | New England Biolabs | M0315S | Provided with 10x reaction buffer, 2.5 mM cobalt chloride |
| Biotin-11-dUTP | Invitrogen | R0081 | Biotin-ddNTP is also available |
| T4GT7 Phage DNA | Nippon Gene | 318-03971 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6758 | EDTA |
| 1.2) Biotinylation of sticky end DNA Using DNA Ligase | |||
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | Provided with 10x reaction buffer |
| Lambda Phage DNA | Bioneer | D-2510 | Also available at New England Biolabs |
| 2. Functionalized Surface Derivatization | |||
| 2.1) Piranha Cleaning | |||
| Coverslip | Marienfeld-Superior | 0101050 | 22 mm x 22 mm, No. 1 Thickness |
| Teflon rack | Custom Fabrication | ||
| PTFE Thread Seal Tape | Han Yang Chemical Co. Ltd. | 3032292 | Teflon™ tape |
| Sulfuric acid | Jin Chemical Co. Ltd. | S280823 | H2SO4, 95% Purity |
| Hydrogen peroxide | Jin Chemical Co. Ltd. | H290423 | H2O2, 35% in water |
| Sonicator | Daihan Scientific Co. Ltd. | WUC-A02H | Table-top Ultrasonic Cleaner |
| 2.2) Aminosilanization on Glass Surface | |||
| N-[3-(Trimethoxysilyl)propyl] ethylenediamine |
Sigma-Aldrich | 104884 | |
| Glacial Acetic Acid | Duksan Chemicals | 414 | 99% Purity |
| Methyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | M300318 | 99.9% Purity |
| Polypropylene Container | Qorpak | PLC-04907 | |
| Ethyl Alcohol | Jin Chemical Co. Ltd. | A300202 | 99.9% Purity |
| 2.3) PEGylation of the coverslip | |||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Syringe Filter | Sartorius | 16534----------K | |
| Biotin-PEG-SC | Laysan Bio | Biotin-PEG-SC-5000 | |
| mPEG-SVG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| Acetone | Jin Chemical Co. Ltd. | A300129 | 99% Purity |
| Microscope Slides | Marienfeld-Superior | 1000612 | ~76 mm x 26 mm x 1 mm |
| 3. Assembling a Flow Chamber | |||
| Acrylic Support | Custom Fabrication | ||
| Double-sided Tape | 3M | Transparent type | |
| Quick-dry Epoxy | 3M | ||
| Polyethylene Tubing | Cole-Parmer | 06417-11, 06417-21 | |
| Gas Tight 250 µl Syringe | Hamilton | 81165 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| 4. Sample Loading into Flow Chamber | |||
| Neutravidin | Thermo Scientific | 31000 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503-5KG | Trizma base |
| Microscope | Olympus | IX70 | |
| EMCCD Camera | Q Imaging | Rolera EM-C2 | |
| Solid-state Laser (488 nm) | Oxxius | LBX488 | |
| Alconox | Alconox Inc. | ||
References
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