Introduction
Diverse piattaforme per la diagnosi della malattia sono stati sviluppati sulla base di materiali su scala nanometrica 1,2, come nanofili, 3 nanoparticelle, nanotubi 4, 5 e nanofibre (NFS) 6-8. Questi nanomateriali offrono ottime prospettive nella progettazione di nuove tecnologie per saggi biologici altamente sensibili per le loro proprietà fisico-chimiche uniche. Ad esempio, mesoporosa zinco nanofibre ossido sono stati utilizzati per la rivelazione sensibile femto-molare di biomarcatori cancro al seno. 9 Recentemente, nanomateriali a base di biossido di titanio (TiO 2) sono stati esplorati per applicazioni bioanalitici 10 considerando la loro stabilità chimica, 11 denaturazione proteica trascurabile , 12 e biocompatibilità. 13 Inoltre, i gruppi idrossilici sulla superficie di TiO 2 facilitare modificazione chimica e l'attacco covalente di biomolecole. 14,15 modellato TiO 2 thin film 16 o TiO 2 nanotubi 17 sono stati utilizzati per migliorare la sensibilità di rilevazione di una proteina bersaglio, aumentando l'area superficiale; Tuttavia, il processo di fabbricazione è piuttosto complessa e richiede attrezzature costose. D'altra parte, NFS elettrofilate stanno ricevendo attenzione a causa della loro elevata area superficiale, così come processo semplice e di fabbricazione a basso costo; 18,19 ancora, la caratteristica fragile o allentato del NF mat elettrofilate TiO 2 rende difficile da gestire e integrazione con dispositivi microfluidici. 6,20 Pertanto, le TiO2 tappetini NF sono stati raramente utilizzati in applicazioni bioanalitiche, in particolare quelle che richiedono condizioni di lavaggio difficili.
In questo studio, per superare queste limitazioni, abbiamo sviluppato una nuova tecnologia per il trasferimento del elettrofilate NF stuoie sulla superficie di un substrato bersaglio utilizzando uno strato adesivo polidimetilsilossano sottile (PDMS). Furthermore, abbiamo dimostrato con successo l'integrazione di elettrofilate TiO 2 NF stuoie su un dispositivo microfluidico centrifuga in policarbonato (PC). Utilizzando questo dispositivo, una rivelazione sensibile alto, completamente automatizzato e integrato di proteina C-reattiva (CRP) e troponina I cardiaca (cTnI) è stata raggiunta entro 30 minuti da solo 10 ml di sangue intero. 21 A causa della combinata vantaggi delle proprietà della FN e la piattaforma centrifuga, il saggio esposti un'ampia gamma dinamica di sei ordini di grandezza da 1 pg / ml (~ 8 fM) a 100 ng / ml (~ 0,8 pm) con un limite inferiore di rilevamento di 0,8 pg / ml (~ 6 fM) per CRP e una gamma dinamica di 10 pg / ml (~ 0,4 pM) a 100 ng / ml (~ 4 nM) con un limite di rilevazione di 37 pg / ml (~ 1,5 pM) per cTnI. Questi limiti di rilevabilità sono ~ 300 ~ e 20 volte inferiore rispetto ai loro corrispondenti risultati convenzionali ELISA. Questa tecnica può essere applicata per la rilevazione di eventuali proteine bersaglio, con anticorpi appropriati. Nel complesso, questo dispositivo could contribuiscono notevolmente alla diagnostica in vitro e saggi biochimici poiché può rilevare rare quantità di proteine bersaglio con grande sensibilità anche da piccole quantità di campioni biologici; ad esempio, 10 ml di sangue intero. Sebbene abbiamo dimostrato solo la rilevazione di proteine del siero utilizzando ELISA in questo studio, la tecnologia di trasferimento e l'integrazione dei elettrofilate NFs con dispositivi microfluidici potrebbe essere più ampiamente applicato in altre reazioni biochimiche che richiedono una grande superficie per alta sensibilità di rilevazione.
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Protocol
NOTA: Il sangue è stato prelevato da individui sani ed è stato raccolto in un tubo di raccolta del sangue. Consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i volontari.
1. Realizzazione di TiO2 NF Mat
- Preparazione della soluzione di precursore 22
- Sciogliere 1.5 g di titanio tetraisopropoxide (TTIP) in una miscela di etanolo (99,9%, 3 ml) e acido acetico glaciale (3 ml) e miscelare la soluzione a temperatura ambiente (25 ° C) per 30 minuti su un agitatore magnetico.
- Sciogliere 11% in peso di polivinil pirrolidone (PVP) in 3,64 g di etanolo (99,9%) e agitare la soluzione a 65 ° C per 1 ora con un agitatore magnetico a piastra calda.
- Combinare e mescolare le due soluzioni a 65 ° C per 4 ore su un agitatore magnetico a piastra calda.
- electrospinning
- Caricare la soluzione preparata in una siringa collegata ad un ago di acciaio inox da 200 micron diame internoter. Versare la soluzione direttamente nella siringa dopo aver rimosso lo stantuffo.
- Introdurre la soluzione costantemente ad una velocità di flusso di 0,3 ml / h per 10 min su un Si fetta (2 cm x 2 cm) posto su un substrato a massa ad una tensione continua elevata (15 kV). Durante l'elettrofilatura, impostare la distanza tra l'ago e il substrato a massa a 10 cm.
- Calcinazione del tappeto NF
- Posizionare il tappetino NF in un forno e aumentare la temperatura fino a 500 ° C con una velocità di rampa di 3 ° C / min in condizioni di alto vuoto (5 x 10 -5 torr).
- Mantenere la temperatura a 500 ° C per 3 ore. Raffreddare la temperatura dei campioni alla RT (25 ° C) nel forno.
2. Integrazione del TiO2 NF Mat in un Microfluidic disco centrifugo
- Realizzazione di un disco
- Utilizzare il software di progettazione 3D (ad esempio, SolIDWorks o simile) per raffigurano camere, canali o valvole di ogni strato di disco. Convertire i file di progettazione di codice a controllo numerico computerizzato (CNC) utilizzando il codice che genera il software (ad esempio, Edgecam o simili). Utilizzare i software in base al manuale di istruzioni 23,24. Nota: Le dimensioni del canale tipici usati in questo dispositivo sono 1,0 millimetri x 0.3 mm (larghezza x profondità).
- Aprire il software di funzionamento della fresatrice CNC (ad es., DeskCNC o simili) e caricare il codice CNC al software operativo e selezionare la seguente nell'ordine: "AUTO" -> "G codice aperto" -> Selezionare il codice CNC generato.
- Fissare la piastra PC sulla fresatrice CNC: utilizzare 1 piastre mm PC per lo strato superiore e piastre PC 5 mm per lo strato del disco. Eseguire la fresatrice CNC per tagliare ogni strato del disco facendo clic sul pulsante "Start".
- Trasferimento di TiO2 NF tappetino sul disco
- Inserire un substrato di silicio e una piccola capsula di Petri contenenti 40 ml di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl) -1-triclorosilano in una camera a vuoto sotto vuoto per 30 min. Il fluorosilane vaporizza e viene rivestita sul substrato.
- Mescolare polidimetilsilossano (PDMS) pre-polimero con un agente indurente in un rapporto di 10: 1 e degasare in una camera a vuoto. Spin-coat PDMS su un substrato di silicio a 650 rpm per 60 sec.
- Curare il PDMS stesi su substrato di silicio in stufa a 65 ° C per 10 minuti per ottenere uno stato aderente.
NOTA: Tempo di polimerizzazione può essere variata a seconda delle condizioni ambientali, e la forza di adesione può essere una prova di virata utilizzando un reometro. - Trasferire il tappetino TiO2 NF preparato da electrospinning e calcinazione sul silicio PDMS-rivestite utilizzando una pinzetta. Quindi, applicare manualmente una pressione conforme sul TiO2 NF tappeto trasferito con un oggetto piatto (ad es., Vetrino) e rimuovere l'oggetto. Metterequesto campione in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente lo strato PDMS.
- Coat camere di reazione vincolanti il disco con 20 microlitri del / indurimento miscela agente PDMS (10: 1), che agisce come uno strato adesivo per fissare TiO 2 NF stuoia sul disco.
- Versare 50 ml di etanolo (99,9%) del TiO 2 NF mat sullo strato PDMS, tagliare il tappetino NF con una foratura di diametro di 6 mm, e trasferire il taglio TiO 2 NF tappetino per camere di reazione di legame rivestite con 20 microlitri dei PDMS nel passaggio precedente.
NOTA: In questo passaggio, etanolo sarà utile per scollegare il NF stuoia taglio TiO 2 dal substrato di Si. - Incubare la NF stuoia disco integrato TiO 2 in forno a 65 ° C per 4 ore oppure a 80 ° C per 1 ora per curare completamente il PDMS.
- Modifica della superficie del TiO 2 NF mat sul disco
- Prepare 1% v / v soluzione di (3-glicidossipropil) silano methyldiethoxy (GPDES) in etanolo (99,9%).
- Trattare il disco integrato TiO2 NF tappeto con plasma di ossigeno a 140 W, il flusso di ossigeno 50 sccm per 180 sec. Dispensare 100 ml di soluzione di GPDES su ogni tappeto nanofibre e incubare a RT (25 ° C) per 2 ore.
- Lavare il substrati brevemente dispensando etanolo (99,9%) con una bottiglia di lavaggio, quindi rimuovere l'etanolo completamente invertendo il disco e assorbente contro un panno pulito. Polimerizzare a 80 ° C per 1 ora. Lavare due volte con etanolo (99,9%) nello stesso modo come sopra, per rimuovere le fisicamente adsorbite e non legati molecole GPDES.
- Asciugare con un flusso di azoto, a secco sotto vuoto.
NOTA: Il disco può essere conservato in un contenitore sigillato a RT (25 ° C) fino al momento dell'uso.
- Immobilizzazione di anticorpi sulla superficie
- Fare una soluzione di 200 mg / ml di anticorpi di cattura (monoclonale anti topohsCRP umana o monoclonale di topo anti-cTnI) diluendo gli anticorpi con tampone fosfato salino (PBS) (pH 7,4). Dispensare 5 ml di soluzione su ogni tappeto NF in un disco utilizzando una micropipetta. Vedi l'elenco dei materiali per ulteriori informazioni sui anticorpi.
- Conservare i dischi in una camera umidificata e incubare a 37 ° C per 4 ore. Lavare gli anticorpi rivestiti NF tappeto con lo 0,1% tampone BSA-PBS. Riempire la camera con 100 ml di tampone di lavaggio utilizzando una micropipetta, rimuovere il buffer aspirando o decantazione. Infine, capovolgere il disco e asciugare contro un panno pulito, e poi montare il disco.
- gruppo disco
- Disegnare il disegno del disco su nastro biadesivo utilizzando un programma CAD (ad esempio, AutoCAD o simili). Caricare il disegno CAD al plotter da taglio.
- Tagliare il nastro biadesivo con il plotter da taglio. Stacchi un strato di protezione di doppio nastro adesivo e fissare it sulla parte superiore dello strato disco. Staccare l'altro strato di protezione e fissare lo strato superiore sullo strato disco.
- Caricare il disco preliminarmente riuniti nella pressa e allineare con precisione i livelli superiore / adesivi / disco utilizzando segni di allineamento in ogni strato per collegare ciascuna valvola, canale, e le camere. Applicare una pressione conforme utilizzare la macchina di pressatura.
3. Immunoassay
- Riempire le camere con 1% tampone BSA-PBS utilizzando una micropipetta e incubare il disco a 37 ° C per 1 ora. Rimuovere il buffer mediante aspirazione utilizzando una micropipetta. Eseguire questo passaggio per bloccare i siti non-reagito e per ridurre l'adsorbimento non specifico di proteine in un disco.
- Lavare due volte con 0,1% BSA-PBS compilando ed aspirando le camere con una micropipetta.
NOTA: A questo punto il disco può essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo. - Carico 10 ml di antigene-spillo sangue intero o nel siero privo di CRP per il rilevamento CRP sul disco utilizzando un micropipette. Per rendere i grafici di calibrazione, utilizzare concentrazioni di CRP da 1 pg / ml a 100 ng / ml; e cTnI da 10 pg / ml a 100 ng / ml.
NOTA: A causa dei livelli elevati di CRP nel sangue intero, che è di solito nella gamma micron, senza siero-CRP è stato utilizzato per dimostrare il limite di rilevamento basso del dispositivo. - Girare il disco a 3.600 rpm (391 xg) per 60 sec per separare i globuli rossi.
- Aprire il rubinetto # 1 per irraggiamento laser, e il trasferimento di 4 ml di plasma surnatante alla camera contenente 8 ml di ricerca degli anticorpi coniugati con HRP facendo girare il disco a 2.400 giri al minuto per 3 sec.
NOTA:. I procedimenti generali per l'azionamento della valvola e la visualizzazione di funzionamento del disco sono descritti in dettaglio in una precedente relazione 21 - Applicare una modalità di miscelazione (15 Hz s -1, 15 °) per 5 secondi per il legame degli anticorpi della proteina e rilevamento.
- Aprire la valvola # 2, e trasferire il composto preparato al punto 6 alla camera di reazione di legame (2.400 rpm, 3 sec). Quindi, applicare una modalità di miscelazione (60 Hz s -1, 2 °) per 20 minuti per ottenere un immunoreaction tra la miscela e gli anticorpi leganti sui TiO 2 NFs. Dopo la reazione, valvola aperta # 3 e trasferire la miscela residua nella camera di scarico (2.400 rpm, 10 sec).
- Trasferire il tampone di lavaggio (600 microlitri) alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 4 e girare il disco (2.400 rpm, 4 sec). Quindi applicare una modalità di miscelazione (30 Hz s -1, 30 °) per 120 secondi per lavare i TiO2 NFs nella camera.
- Lavare le TiO2 NFs altre due volte seguendo stessa condizione di passo 3,8, e rimuovere completamente il tampone di lavaggio residua facendo girare il disco a 2.400 rpm per 20 sec. Quindi, chiudere la valvola # 5.
- Per la reazione chemiluminescente, applicare un metodo di miscelazione (30 Hz s -1, 2 °) per 1 min dopo il trasferimento della soluzione di substrato chemiluminescente alla camera di reazione di legame aprendo la valvola # 6 e filaturail disco a 2400 rpm per 10 sec successivamente.
- Trasferire la soluzione di substrato reagito alle camere di rilevamento aprendo la valvola # 7 e girare il disco a 2.400 rpm per 10 sec.
- Misurare segnali chemiluminescenza dalla soluzione di substrato reagito utilizzando un tubo fotomoltiplicatore (PMT) sistema di rilevamento attrezzato modulo.
NOTA: Il sistema di rilevamento è una macchina su misura utilizzando i seguenti componenti: motore di punto, i componenti ottico-meccanici, fasi di traduzione e disponibile in commercio PMT. Le parti optomechanical e il motore passo sono assemblati per tenere il dispositivo, e il motore può ruotare il disco. La rilevazione viene eseguita da PMT fissato sulle parti optomeccanici, e si trova sopra le camere di rilevamento del dispositivo. Manipolando il motore passo-passo, le camere di rilevamento sono allineati proprio sotto la zona di rilevamento di PMT.
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Representative Results
Usando questo protocollo, un dispositivo di microfluidica centrifuga completamente automatizzato per il rilevamento di proteine dal sangue intero ad alta sensibilità è stato preparato. TIO 2 tappetini NF sono stati preparati da processi di elettrospinning e calcinazione. Al fine di realizzare NFS di diametro desiderato, la morfologia e lo spessore, condizioni quali la portata, la tensione, e il tempo spinning electrospinning sono stati ottimizzati. Se le condizioni non sono state ottimizzate, la qualità delle NFs formate era scadente. In particolare, NFS non erano filate dalla soluzione polimerica a bassa tensione (5 kV), e sono stati rotti quando la tensione è alta (> 20 kV). Allo stesso modo, il tempo di filatura era critica per la fabbricazione di NFs adeguata densità, non troppo sparse (1 min) o troppo densa (30 min). Inoltre, per evitare la formazione del branello causata da elevata portata, la velocità di flusso è stato manipolato. Quindi, una tensione applicata di 15 kV, 10 min Tempo electrospinning e una portata di 0,3 ml hr
La NF mat TiO 2 è stato trasferito con successo sul substrato bersaglio usando uno strato PDMS adesivo, che è stato preparato da PDMS spin-coating su un substrato di silicio silanizzato e pre-indurimento in forno a 65 ° C. Il tempo di pre-indurimento dello strato PDMS è stato ottimizzato controllando la forza di adesione, utilizzando un test tack (Figura 2A). La Figura 2B mostra l'effetto del tempo di polimerizzazione sull'attacco nanofibre. Se il PDMS è stata riscaldata per 3 min, non vi è alcuna forza di adesione come PDMS era ancora polimerizzato e rimane come un liquido e la NFs ottenuto incorporato nello strato PDMS. Quando viene riscaldata per 30 minuti, la forza di adesione è molto debole come PDMS si irrigidisce e perde la sua proprietà adesiva e NFS non fosse attaccata su di esso. Quando i PDMS è stata scaldata foR 10 min, il PDMS ha mostrato una forte forza di adesione e NFS sono stati attaccati con forza. Dai risultati, si è concluso che il tempo ottimale per il pre-indurimento PDMS per forte attaccamento è 10 min.
Dopo il montaggio del disco, l'immunodosaggio è stato condotto sulla TiO 2 NF mat disco integrato seguendo una serie di processi operativi disco come elencato nella Tabella 1. Per la determinazione delle concentrazioni di CRP e cTnI in campioni sconosciuti, grafici di taratura per ciascuna sono state fatte tracciando le unità relative di luce (RLU) contro la CRP o concentrazione di cTnI (Figura 3). Nella Figura 3A e 3B, i risultati del saggio su disco sono stati confrontati con ELISA convenzionale su una piastra a 96 pozzetti rispettivamente CRP e cTnI. I saggi esposti un'ampia gamma dinamica lineare con un limite di rilevazione di 0,8 pg / ml (~ 6 FM) per CRP e 37 pg / ml (1,5 pM) per cTnI su un disco, cheè circa 300 volte più elevato per CRP e 20 volte superiore per cTnI rispetto ai loro rispettivi risultati convenzionali ELISA (286 pg / ml, 2.3 PM per il CRP; 824 pg / ml, 32 pm per la cTnI).
Figura 1. Ottimizzazione delle condizioni electrospinning. Immagini SEM ogni condizione mostrano la morfologia del NFs formate. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura test 2. Tack dello strato adesivo PDMS e immagini SEM della TiO 2 NF mat trasferito. (A) forza di adesione dell'adesivoStrato PDMS, pre-stagionato per diversi periodi di tempo, (B) immagini SEM di nanofibre attaccati sul PDMS curati per periodi di tempo diversi. Questa cifra è stata modificata da Rif. 21. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. grafici di calibrazione per il rilevamento di CRP e cTnI utilizzando lab-on-a-disco e piastra da 96 pozzetti. Rilevamento di CRP nel siero spillo libera-CRP (A) e cTnI spillo nel sangue intero (B) sono stati condotti. Le barre di errore indicano la deviazione standard di almeno tre misurazioni indipendenti. Il limite di rilevazione (LOD) è stato calcolato 3 volte la deviazione standard dei dati sui controlli negativi misurati con siero privo di CRP o sangue intero senza cTnI chiodare perCRP e cTnI, rispettivamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Spin No. | Velocità (rpm) | Codice valvola | Tempo (sec) | operazione | |||
| 1 | 3.600 | 60 | separazione del sangue | ||||
| 2 | 2.400 | 1 | 3 | Aprire la valvola di trasferire il plasma nella camera contenente 8 ml di ricerca degli anticorpi coniugati con HRP | |||
| 3 | 15 Hz, 15 ° | 5 | mescolare al plasma e gli anticorpi di rilevamento | ||||
| 4 </ Td> | 2.400 | 2 | 3 | Aprire la valvola di trasferire il composto in camera di reazione di legame | |||
| 5 | 60 Hz, 2 ° | 1.200 | mescolare anticorpi di cattura sul TiO2 NF mat e gli anticorpi plasmatici di rilevamento miscela | ||||
| 6 | 2.400 | 3 | 10 | aperta la valvola per rimuovere la miscela | |||
| 7 | 2.400 | 4 | 4 | Aprire la valvola di trasferire tampone di lavaggio | |||
| 8 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mescolare tampone di lavaggio e lavare TiO2 NF mat | ||||
| 9 | 2.400 | 4 | tampone di lavaggio trasferimento | ||||
| 10 | 30 Hz, 30 ° | 120 | 2 mat NF | ||||
| 11 | 2.400 | 4 | tampone di lavaggio trasferimento | ||||
| 12 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mescolare tampone di lavaggio e lavare TiO2 NF mat | ||||
| 13 | 2.400 | 4 | tampone di lavaggio trasferimento | ||||
| 14 | 30 Hz, 30 ° | 120 | mescolare tampone di lavaggio e lavare TiO2 NF mat | ||||
| 15 | 2.400 | 20 | rimuovere il tampone di lavaggio residuo | ||||
| 16 | 5 | chiudere la valvola | |||||
| 17 | 2.400 | 6 | 10 | Open vAlve e trasferire il substrato chemiluminescente | |||
| 18 | 30 Hz, 2 ° | 60 | mescolare substrato e le immunoreagenti su Tio 2 NF mat | ||||
| 19 | 2.400 | 7 | 10 | aprire la valvola e trasferire il substrato reagito alla camera di rilevamento | |||
| Tempo totale | ~ 30 min | ||||||
Tabella 1. Programma di Attività per il saggio immunologico in un disco. Questa tabella è stata modificata da Rif. 21.
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Discussion
Il saggio su TiO 2 NF disco integrato è una tecnica rapida, economica e conveniente per la rilevazione ultrasensibile di basse proteine abbondanti presenti in molto basso volume di sangue. Questa tecnica ha il vantaggio di utilizzare piccoli volumi di campione (10 microlitri) ed è suscettibile di analisi di campioni multipli simultaneamente. Questo fornisce un grande potenziale come dispositivo di multiplexing immunologico. Il dispositivo ha il vantaggio che non richiede Campione fasi di pretrattamento come la separazione del plasma, che sono tenuti in ELISA convenzionali. Inoltre, il dispositivo è in grado di eseguire le procedure di immunodosaggio interi (ad esempio, la miscelazione, il lavaggio, rilegatura, ecc) automaticamente a causa di camere di pre-progettati, canali e valvole. Inoltre, utilizzando metodi di fabbricazione di dischi commercializzati (es, stampaggio ad iniezione, UV / ultrasuoni / termosaldatura) invece di fresatura e montaggio manuale con adesivi, l'intera procedura dalla fabbricazione del dispositivo di analisi può essereautomatizzato.
Inoltre, il metodo di trasferimento di stampa qui presentato mostra un trasferimento semplice e facile di elettrofilate NF dal donatore al bersaglio substrato utilizzando un sottile strato adesivo PDMS. In generale, NFS TiO 2 ottenuti dopo il processo di calcinazione sono fragili e facilmente staccare dal substrato a massa a causa di adesione debole. 25 Per la sua fragilità caratteristica, integrando le TiO 2 tappetini NF con altri dispositivi è difficile. Per risolvere questo problema, sono stati riportati molti metodi. Ad esempio, hot-press 26 e solvente a vapori di 27 tecniche hanno dimostrato la valorizzazione del adesione tra TiO2 NFs tappeto e superficie di destinazione prima del processo di calcinazione. Anche se questi metodi aumentato l'adesione, le TiO 2 tappetini NF non erano intatte causa dell'alta pressione meccanica o solvente applicate durante le rispettive tecniche. Inoltre, a causa della fase di calcinazione, l'integrazione dei TiO 2 </ Sub> stuoie NF che utilizzano questi metodi può essere applicato solo per le superfici di riferimento limitato.
Per quanto a nostra conoscenza, questa è la prima tecnica che mostra l'trasferire-stampa di tappetini NF su un dispositivo costituito da materiali termoplastici, mantenendo le proprietà innovative di NFs anche dopo il trasferimento. Per migliorare le prestazioni del dispositivo, la fabbricazione di alta qualità, NFS e ottimizzazione delle condizioni di pre-polimerizzazione sono desiderati. Come indicato nel protocollo, il tempo richiesto per il pre-trattamento possono variare a seconda delle condizioni ambientali; Pertanto, le condizioni di pre-indurimento devono essere ottimizzati misurando la forza di adesione con un tack-test.
Inoltre, il protocollo qui presentato, fornisce guide abili per il processo ELISA completamente automatizzato su un disco. Il protocollo non introduce soltanto fabbricazione del disco, ma anche l'automazione di tutti i processi necessari per ELISA, compresa la separazione del sangue intero, dosaggio, miscelazione, lavaggio e rilevamento.Ogni passo è ottimizzato con velocità di rotazione, la frequenza di miscelazione, e il tempo di funzionamento. Sulla base di questa guida operativa, i reagenti caricati sui dischi possono essere trasferiti utilizzando un unico motore. Poiché il dispositivo eseguito un'eccellente sensibilità di rilevamento con volume molto basso di sangue, fornisce un grande potenziale per applicazioni diagnostiche di screening di biomarcatori in una fase precoce della malattia. Il dispositivo dovrebbe essere attivato per rilevare eventuali biomarker seconda della disponibilità dei suoi anticorpi specifici.
Sebbene il dispositivo di stuoie TiO 2 NF ottenuti in altamente arricchito sensibilità a causa della grande superficie delle stuoie, una delle sfide rimanente di questa tecnica potrebbe essere nella produzione di massa di stuoie uniformi NF. Poiché la sensibilità del ELISA è fortemente influenzato dalla superficie del tappetino nanofibre, è fondamentale per ottenere non solo una elevata area superficiale, ma anche una superficie riproducibile ed uniforme in diversi lotti di produzione di massa. In conclusione, abbiamo dimostrato un metodo semplice integrare una stuoia fragili NF in un dispositivo funzionale per il rilevamento di proteine ultrasensibile. I vantaggi di questo metodo sono i seguenti: 1) precedentemente elettrofilate TiO 2 NFs potrebbero essere preparati solo su superfici conduttrici e termicamente stabile; Qui, abbiamo dimostrato che possono essere trasferite su qualsiasi substrato includente materiali non conduttivi e plastica; 2) i tappetini TiO2 NF in grado di sopportare la pressione e rimanere stabile durante fasi di lavaggio a causa della elevata forza di adesione dello strato PDMS; 3) fornisce una superficie relativamente maggiore per saggi biologici; e 4) gli anticorpi possono essere covalentemente associate alle TiO 2 NFS per le proprietà superficiali intatte su NFS. Questa tecnica ha un grande potenziale per essere utilizzato per l'integrazione di materiali nanofibrous in dispositivi per applicazioni diverse.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la Ricerca Nazionale di Corea (NRF) sovvenzioni (2013R1A2A2A05004314, 2012R1A1A2043747), una sovvenzione da parte della Corea Salute Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (A121994) e IBS-R020-D1 finanziata dal governo coreano.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Si wafer | LG SILTRON | Polished Wafer, test grade | Dia. (mm) = 150, orientation = <100>, dopant = boron, RES(Ohm-cm) = 1 - 30, thickness (μm) = 650 - 700 |
| Polycarbonate (PC) | Daedong Plastic | PCS#6900 | Thickness (mm) = 1 and 5 |
| Titanium tetraisopropoxide, 98%, | Sigma-Aldrich | 205273 | |
| Polyvinylpyrrolidone, Mw = 1,300,000 | Sigma-Aldrich | 437190 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| Anhydrous ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
| Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane | Sigma-Aldrich | 448931 | |
| PDMS and curing agent | Dow Corning | SYLGARD 184 | |
| GPDES | Gelest Inc | SIG5832.0 | |
| Ethanol | J T Baker | ||
| FE-SEM | FEI | Nova NanoSEM | |
| X-ray photoelectron spectroscopy | ThermoFisher | K-alpha | |
| 3D modeling machine | M&I CNC Lab, Korea | CNC milling machine | |
| Wax-dispensing machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Double-sided adhesive tape | FLEXcon, USA | DFM 200 clear 150 POLY H-9 V-95 | |
| Cutting plotter | Graphtec Corporation, Japan | Graphtec CE3000-60 MK2 | |
| Spin coater | MIDAS | SPIN-3000D | |
| Furnace (calcination) | R. D. WEBB COMPANY | WEBB 99 | |
| Rheometer (Tack test) | Thermo Scientific | Haake MARS III - ORM Package | |
| Oxygen plasma system | FEMTO | CUTE | |
| Monoclonal mouse antihuman hsCRP | Hytest Ltd., Finland | 4C28 | (clone # C5) |
| Monoclonal mouse anti-cTnI | Hytest Ltd., Finland | 4T21 | (clone # 19C7) |
| HRP conjugated goat polyclonal anti-hsCRP | Abcam plc., MA | ab19175 | |
| HRP conjugated mouse monoclonal anti-cTnI | Abcam plc., MA | ab24460 | (clone # 16A11) |
| hsCRP | Abcam plc., MA | ab111647 | |
| cTnI | Fitzgerald, MA | 30-AT43 | |
| Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| PBS | Amresco Inc | E404 | |
| Blood collection tubes | BD vacutainer | 367844 | K2 EDTA 7.2 mg plus blood collection tubes |
| SuperSignal ELISA femto | Invitrogen | 37074 | |
| Modular multilabel plate reader | Perkin Elmer | Envision 2104 | |
| Disc operating machine | Hanra Precision Eng. Co. Ltd., Korea | Customized | |
| Photomultiplier tube (PMT) | Hamamatsu Photonics | H1189-210 | |
| AutoCAD | AutoDesk | Version 2012 | Design software |
| SolidWorks 3D CAD software | SOLIDWORKS Corp. | Version 2013 | 3D Design software, |
| Edgecam | Vero software | version 2009.01.06928 | Code generating software |
| DeskCNC | Carken Co. | version 2.0.2.18 | CNC milling machine software |
References
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