Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן

Published: August 16, 2016 doi: 10.3791/54149
* These authors contributed equally

Introduction

המחקר של איברים מבודדים מאפשר שליטת תנאים פיסיולוגיים מעבר למה שאפשרי vivo. הכנות לב-גופיים תוארו לראשונה על ידי אוטו Langendorff, 1 שתאר מודל מבודד עם זלוף המדרדר. בהמשך לכך, אחרים תיארו את מודל "עבודה שבלב", שבו שריר הלב מבצעת גם עבודה לחץ ונפח. 2 ההכנות כזה כבר סייעה הבהרת מנגנוני הפעולה של שריר הלב, 3 מטבוליזם בשריר הלב, 4-6 ואפקטים של תרופות cardiotonic. 7- 9

השימוש בתרופות משפר התכווצות שריר לב שכיח בחולים אנושים. עם זאת, כמה נתונים זמינים השוואת ההשפעה היחסית של תרופות אלה על התכווצות וצריכת החמצן של שריר הלב, נתונים אשר עשויים להיות שימושיים בטיפול בחולים עם סימנים קליניים של אי ספיקת לב של בקביעת לאחר הניתוח. 10 עם זאת, כי רוב תרופות cardiotonic משפיעות לא רק על שריר לב, אלא גם התנגדות arteriolar, קיבול ורידי 11, וכן את קצב חילוף החומרים של מטופל, 12 לשעבר vivo מודלי לב מבודדים להישאר האמצעים האופטימליים שבאמצעותו כדי לחקור את ההשפעות של תרופות כאלה על שריר לב נכון.

אנו מתארים את השימוש של מודל vivo לשעבר לחקר עצמאי מטעני תרופות אינוטרופיות על תפקוד שריר לב וצריכת חמצן. לבבות של חולדות ספראג Dawley היו cannulated באמצעות חדר שמאלי עובד מודל לב perfused באמצעות perfusate קרבס Henseleit שונה. לחצי פרוזדורי אב עורקים ושמאל נשלטו. לחץ-נפח צנתרים עכבה הונחו לתוך החדר השמאלי באמצעות לנקב apical לניטור רציף של תפקוד סיסטולי ודיאסטולי. צריכת החמצן נמדדה ברציפות כהפרש הצמוד תכולת החמצן בין perfus פרוזדורים שמאלאכול קולחי עורק הריאה. תרופות להיבדק היו חדורות לבלוק פרוזדורי השמאל, ושינויים ביצועים לב ואת חילוף חומרים של חמצן נמדדו ולעומת בסיס שקדם מייד.

Protocol

פרוטוקול זה מתבצע תחת פרוטוקול נוכחי תחת והעדה לטיפול ולשימוש חיה של המוסד.

1. הכנה לחקר

  1. הפעל באמבט מים כדי לחמם את חיץ קרבס-Henseleit המאגר (KHB) (מוגדר 42 ° C).
  2. כן 16 ליטר של KHB המכיל (מ"מ) 128 NaCl, 5.7 KCl, 1.3 MgSO 4, 25 NaHCO 3, 2.7 CaCl 2, 0.53 EDTA, 0.54 NAC 3 H 3 O 3, ו -10.8 דקסטרוז. 13 המוני המצע הם כדלקמן : 27.584 גרם NaCl, KCl 1.58 גרם, 0.578 גרם MgSO 4, 8.401 גרם NaHCO 3, 1.47 גרם CaCl 2, EDTA 0.744 גרם, 0.22 גרם NAC 3 H 3 O 3, ו דקסטרוז 7.208 גרם.
    הערה: רכיבים אלה ניתן לאחסן צינורות חרוטים בצורת אבקה לחוקה ביום הניסויים.
    1. סנן 4 ליטר של מים ללא יונים דרך פילטר 0.22 מיקרון.
    2. להוסיף 3.7 ליטר של מים זה על 4 Lכּוֹס. הוסף את כל המרכיבים למעט CaCl 2 אל המים.
    3. ממיסים את CaCl 2 ב -300 מ"ל הנותרים של מים באמצעות מבחנה נפרדת.
    4. חמצן הפתרון עם 95% O 2/5% CO 2 ב 1 ליטר / דקה (LPM) במשך 5 דקות. זה מתקן את ה- pH ל 7.40 ומשפר פירוק CaCl 2.
    5. מוסיפים את CaCl 2 עד לשארית KHB.
    6. מוסיפים את KHB השלימה למאגר ויפיץ דרך כל צינורות למשך 30 דקות. ודא כי המערכת אינה ללא בועות מקרוסקופית. חמצן עם 95% O 2/5% CO 2 ב 0.5 LPM.
      הערה: KHB ניתן לאחסן לילה במקרר לתקופה שלא תעלה על 1 - 2 ימים, החזירו לטמפרטורת החדר מסונן מחדש לשימוש. אל תעשה שימוש חוזר KHB בין הניסויים.
    7. הכן 2 x 50 מ"ל כוסות נקיות עם KHB קר קרח ומניחים אותם בתוך דלי קרח ליד תחנת לנתיחה. ודא כי KHB קר כקרח (ולא מצונן) לפני לשעבר נטיעה בלב.
    8. מניחים את הלחץ בנפח מיקרו (PV) קטטר בתוך מזרק 10 מ"ל מלא KHB מסוננים למשך 30 דקות לפני כיול, לפי הוראות היצרן.
      הערה: הטמפרטורה של KHB נהגה להשרות את הקטטר PV צריך להיות קרוב ל -37 מעלות צלזיוס ככל האפשר.
  3. הכן את ההרדמה ותחנת לנתח עבור החיה.
    1. ודא isoflurane נאותה בתוך המאגר. צייר את 500 U של הפרין מזרק 1 מ"ל; במקום 26 מד (1/2 ") מחט על המזרק הזה. כן מסכה עבור הרדמת החיה.
  4. הגדר את הלחץ זלוף לחסום אבי העורקים עד 80 מ"מ כספית ואת פרוזדורים שמאל לחץ זלוף בלוק (LA) עד 10 מ"מ כספית. הן פתחו את הבלוק אבי העורקים ולחסום LA לאפשר חם KHB לטפטף החוצה. כאשר מוכן לנתח את החיה, לפתוח את הבלוק אבי העורקים כדי לאפשר טפטוף איטי ויציב של KHB החוצה.
  5. כייל את הקטטר PV פי הוראות היצרנים.
"> 2. הכנת בעלי חיים ו Dissection

הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להבטיח חיה היא בין 300 ל -500 גרם; מצאנו כי משקל חיה בין 425 כדי 450 גרם הוא אידיאלי עבור המערכת שלנו.

  1. להרדים את החיה isoflurane באמצעות קאמרית (1 - 2%) עד שהחיה הוא מחוסר הכרה. מעביר את החיה לתחנה לנתיחה ולמקם את מסכת ההרדמה עם isoflurane וחמצן על החיה. בצע קמצוץ הבוהן כדי להעריך את רמת הרגעה. החל משח וטרינר על עיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
  2. להזריק הפרין, 500 יחידות intraperitoneal בתוך חלל הבטן. אפשר 10 דקות עבור הפרין להיקלט. אבטח את הגפיים של החיה עם קלטת כדי לשפר להדמיה של בית החזה.
  3. Dissection של הלב.
    1. לאחר הבטיח שאין בתגובת קמצוץ בוהן, להרים את העור הרחק חלל הבטן עם מלקחיים ולאחר מכן להשתמש במספריים לחתוך את חלל הצפק, בעקבות עיקול tהוא ממברנות בחזרה לזווית האחורית של הצלעות.
    2. לאחר הסרעפת גלויה, באמצעות מספריים קטנים, לחתוך לאורך פני השטח הקדמיים של הסרעפת בעקבות לכיוון הקיצוצים לפני מאפשר כניסה לתוך בית החזה. רחב כל חתך לאורך קו בית השחי בילטרלי כדי השחי.
      הערה: השלבים הבאים צריכות להתבצע ביעילות מאז האוורור יהיה בסכנה ברגע הסרעפת היא חרותה.
    3. לחזור בו החזה anteriorly מתהליך xiphoid באמצעות מלקחיים. לחתוך את קרום הלב הצדר.
    4. זהה את הווריד הנבוב הנח (IVC) ואב העורקים בדיוק מעל הסרעפת לחזור אליהם כמקשה אחת קדמית באמצעות מלקחיים בוטים.
    5. בעזרת מספריים גדולים, מעוקל, עושים חתך במהירות ברחבי IVC לבין אבי העורקים, מושך את הלב והריאות מתוך החזה כמקשה אחת. חותכים את הוושט, קנה הנשימה, עורקים וורידים brachiocephalic cephalad להסיר את הלב והריאות מהחזה. ובלו עמךרקמת מיקרופון עם בלוק זה של רקמות. יש להיזהר שלא לחתוך את החלק הפרוקסימלי של האאורטה עולה.
    6. מיד לטבול את הלב והריאות ב KHB קר כקרח ולעבור המנגנון Langendorff, בעבר להקים כמתואר בשלב 1.

3. אבי העורקים Cannulation

  1. מניחים את מורכבות לב-ריאה בצלחת שטוחה לכוון את הלב עם התימוס וכלי נהדר מול הנסיין וההיבט האחורי של הריאות מול השולחן. משוך לגזרים את שתי האונות של בלוטת התימוס ולזהות את ההמראה של העורקים brachiocephalic מאבי העורקים.
    1. לעטוף את אבי העורקים אל מעבר לקצה של המנה ואת transect האאורטה באמצעות מספריים קטנים כ 5 מ"מ מעל שסתום אבי העורקים, רק הפרוקסימלי ההמראה של העורק הימני subclavian.
      הערה: החתך צריך להניב עיגול נקי - האאורטה בחתך. אם זה מלוכסן (כלומר, סגלגל רחב)או לא שלם, לחזור על החתך כדי להשיג את התוצאה הרצויה. זה יקל cannulation אבי העורקים יעיל.
  2. שימוש 2 זוגות מלקחיים מעוקלים צידיו של האאורטה, להנחות את אב העורקים על צינורית אב העורקים (שאמור להיות מטפטף באיטיות עם KHB). שסתום אב העורקים צריך לשבת 1 - 2 מ"מ מתחת לקצה של הצינורית.
    1. לאחר cannulation אבי העורקים, למקם את מלקחיים בניצב ברחבי האאורטה להחזיק את אבי העורקים במקום. לחלופין, למקם מלחציים קטנים ברחבי האאורטה להחזיק במתחם ריאות לב במקום, מה שמאפשר הנסיין יחיד להשלים את המודל הזה.
  3. יש עוזרים לעבור תפר משי 4-0 ממש מתחת המלקחיים ולקשור למקומו, מלפף סביב הצינורית וקשירת מספר פעמים הן מול ומאחורי הלב. פתח את הצינורית ומזומן להתחיל זרימת אב עורקי מדרדר מלאה. שימו לב היכו נמרצות.
    הערה: אם הלב אינו מתחיל לפעום במהירות (~ 200 BPM) ו במרץ, אתלקשור או צינורית עשויה להיות גורם לחסימה אחד או שניהם של העורקים הכליליים. אם זה חשוד, מסיר את העניבה ואת החזרה משם זה מן העורקים הכליליים. אם הלב distends ואינו לנצח, צינורית עשויה להיות מעבר שסתום אבי העורקים. אם ההדלפות עורקים כליליים (תרסיסים KHB מן שורש האאורטה), לקדם את הצינורית קרוב יותר מסתם אאורטלי (תופעה זו יכולה להתרחש אם עורק brachiocephalic הוא cannulate במקום של האאורטה עולה).

4. ספיגת ריאתי וריד והכנה של עורק הריאה עבור Cannulation

הערה: מטרת שלב זה היא ליצור מערכת פרוזדורי שמאל סגורה על מנת להבטיח כי כל נפח הלחץ מגוש הפרוזדורים השמאלי מועברים למבני הלב השמאליים. אי לחסום את הוורידים ריאתי לחלוטין עלול לגרום למחסור preload ועשוי לזייף תוצאות או ליצור הכנת לב עובדת יציבה.

  1. הסר את התימוס כדי לשפר את החשיפה של הדואר עורק הריאה (PA).
  2. באופן ידני לסובב את צינורית אב העורקים כך ההיבט האחורי של הלב פונה מפעיל. לנתח את הכלי המוביל לריאה הימנית. להשעות את רקמת הריאה הימנית באמצעות מלקחיים נוספים מסמנים הכלים האלה. באמצעות מהדקים כירורגיים בינוני-גדול (או תפר), לחסום את עורק הריאה הימני וריד הסמפונות עם קליפ יחיד. לכרות דיסטלי ריאות זכות קליפ.
    הערה: בשל קושי לנתח את עורק ריאה חינם, והתרגול שלנו הוא לחסום את הוורידים ריאתי להתנפח עורק הריאה, מה שמקל לחתוך מבלי לפצוע את המבנים הסמוכים במודל לב פועם.
  3. חזור על שלב 4.2 על הריאה השמאלית.
    הערה: בעיות פוטנציאליות ופתרון בעיות: לאחר עורקי הריאה שניהם האפילו, אטריום ימין יהיה לראות בעין להתנפח ואת הלב עשוי להיות bradycardic. הסיבה לכך היא כי החדר הימני הופך דחוס. אם זה לא קורה, סביר להניח כי pulmורידים onary אינם האפילו לחלוטין, וכי preload יהיה מספיק לעבודה במצב הלב. אם הלב אינו מסוגל לשמור על תפוקת לב לאחר פרוזדורים שמאלה (LA) cannulation ומעבר ניסיתי לעבוד לב (ראה להלן), לשקול הצבת קליפים נוספים או קשירה על גדמי עורק הריאה כדי לחסום כל דליפה שיורית. לאחר עוזר האישיים הן האפילו, עם זאת, שלב 5 צריך להתבצע באופן מיידי כדי למזער איסכמיה לבבית. שים לב כמה חוקרים לחתוך עורק הריאה לפני קשירת הורידים ריאתי להימנע שמירת לחץ קבוע של החדר הימני.
  4. חתך עורקי ריאתי
    1. סובב את צינורית אב העורקים כך ההיבט הקדמי של הלב פונה מפעיל. זהה את עורק הריאה. שוב, עורק זה ניתן התנפח. בעזרת מספריים קטנים לעשות חתך רוחבי כ -3 מ"מ מעל שסתום ריאתי.
      הערה: זה יהיה מיד לשחרר את הלחץ ואת קצב הלב עלול להגביר. לִהיוֹתצינורית לגרום זה קל לעקור, cannulate עורק הריאה לאחר cannulation פרוזדורי שמאל הושלם.

5. השמאל פרוזדורי Cannulation

  1. סובב את צינורית אבי העורקים כך הפרוזדור השמאלי ניצבת בפני המפעיל. בעזרת מספריים קטנים, לבצע 2 - חתך מ"מ 3 בגוף העליון של הפרוזדור השמאלי, כ 3 מ"מ מעל החריץ החדרים והעליות.
    1. מקם את הצינורית פרוזדורים שמאל בניצב למישור של המסתם המיטרלי והצביעה לעבר מחצה פרוזדורים.
    2. פתח את הצינורית אנג'לס עד KHB זורם. ודא כי KHB הוא חם למגע (שיתקרר במהירות כשיושבים כל צינורות שאינם במעיל) על מנת למנוע בעיות בתפקוד שריר הלב עקב היפותרמיה הבאים המעבר לעבודה במצב. מעבר לשער טפטוף במהלך cannulation.
  2. בעזרת מלקחיים להחזיק נגד מתיחה, הכנס את צינורית הפרוזדורים לתוך הגוף של הפרוזדור השמאלי, נזהר שלא להשתמש excessive כוח, אשר יכול לקרוע את אטריום.
    הערה: צינורית LA צריכה להיות ממוקמת כך שהוא יושב באמצע אטריום בלי כל מתח על קיר הפרוזדורים.
  3. לעבור תפר משי 4-0 סביב גוף של אטריום שמאלה לקשור קשר כדי ליצור חותם של אטריום סביב הצינורית. תשמור על מנת להבטיח כי ההיבט האחורי של אטריום שמאל כלול התפר. להוסיף תפרים נוספים לפי צורך. לאחר אטום, למשוך את הצינורית בחזרה 1 - 2 מ"מ, כך שהוא יושב באמצע אטריום ולא נגד מחצה פרוזדורים.
    הערה: הסיבה הנפוצה ביותר כי הלב הופך malperfused על מעבר לעבודה במצב לב כי צינורית LA במגע מחץ הפרוזדורים, אשר חוסמת יבוא פרוזדורי שמאל. עקיבת LA קרובה משנה להפגין ראוי גל גל נ כאשר הקנייה היא בתנוחה נכונה (ראה 2E איור).
  4. פתח את שסתום צינורית LA לחלוטין לנהל את עומס מלא אטריום שמאל. לפקח עלקצב טפטוף מהלב (שמקורה בשפכים כלילית). להבטיח שמירה על קצב הטפטוף אינו משתנה כאשר צינורית LA פתוחה. אם כן, לקשור אטריום סביב הצינורית כמתוארת בשלב 6.4, מאחר שהיא מייצגת את דליפה במערכת.

6. Cannulation ואימוץ עורק ריאה למצב לב עבודה

  1. אם מדידת צריכת החמצן של שריר הלב (או חומרים אחרים השפכים כלילית, כגון רמות התרופה או ציטוקינים), הכנס 1/32 "צינור גמיש לתוך החתך לפני בעורק הריאה.
    הערה: צריכת חמצן נמדדת כהפרש בתוכן חמצן בין perfusate פרוזדורי שמאל שפכים עורקים ריאה 2.
    1. למדידה רציפה של צריכת חמצן של שריר לב, השתמש אלקטרודה חמצן אונליין להשוות פרוזדורים שמאלה שפכים סינוס כליליים.
    2. אסוף שפכי סינוס כליליים (משני עורק הריאה ונוטף מהלב) בתוך צילינדר בוגראינדר כימות מתוזמן של זרימה כלילית.
    3. חשב את צריכת החמצן של שריר הלב כפי שתואר לעיל. 2
  2. מעבר לעבודה במצב לב על-ידי כיבוי משאבת אב עורקים המדרדרת.
    הערה: כאשר זה נעשה, לחץ LA הופך את הלחץ טרום עומס הנגד אשר ספק התנגדות בעבר למשאבה המדרדרת Langendorff מצב חברה מקנה עמידות תפוקת לב, יצירת לחץ דם ממוצע. אם לחץ דם הממוצע יורד מתחת ~ 80 מ"מ כספי, הגורם קשור סביר או preload או פונקצית שריר לב. הבעיה הסבירה ביותר היא צינורית פרוזדורי השמאל, אשר צריך להיות מותאמת לאחר ההפעלה מחדש של המשאבה המדרדרת.

קלטי 7. של צנתר לנפח בלחץ השמאל חדרית

הערה: קטטר PV ניתן להציב גם מדרדר (דרך שסתום אבי העורקים) או באמצעות לנקב apical. היתרון של מדרדר הוא ש- position הוא עקבי יותר היא מאיינת את הצורך לנקב פסגה ואת הסיכונים הקשורים של פגיעה כלילית או אובדן preload. עם זאת, מיקום מדרדר לפעמים יכול להיות מאתגר מאוד, כך אנו מתארים שתי הטכניקות בזאת.

  1. צרף קטטר 1.4 צרפתית לחץ-נפח למערכת לולאה לנפח בלחץ. כייל את המערכת החמה KHB פי הוראות היצרן. ודא את צורת הגל גלויה בזמן אמת. תביא את הקטטר וכבלים קרוב לפני השטח של LV כדי שלא לעקור לה עקב מיקום.
  2. עבור מיקום מדרדר, פתח את שסתום מתכווננת להאכיל את הקטטר PV בעדינות על פני שסתום אב העורקים עד צורת גל לחץ ונפח יציב מזוהות. הימנע משימוש מופרז בכוח אשר עלולה לגרום נזק שסתום אבי העורקים או לנקב את איפקס חדרית.
    הערה: מצאנו כי חשוב למזער את משך צינורות מספר הסיבובים כי קטטר PV חייב לנווט להתקרב AV. זהעשוי להיות מועיל כדי לצמצם את הצינורות אשר מגיע עם המערכת.
  3. עבור מיקום הפסגה, להשתמש-קטטר angio 24 G ליצור לנקב הפסגה של LV. הקפד להימנע השמאלי הקדמי היורד לב כלילית. כוון את המחט לכיוון מסתם אאורטלי מן הקודקוד חדרית. לקדם את הקטטר לחץ-נפח לתוך הגוף של LV. תפסיק לקדם את הקטטר בהקדם צורת הגל לחץ ונפח LV מזוהה.
  4. לאחר קטטר לחץ-נפח הוא במקום, הזז את ז'קט מים למצב סביב הלב. Secure את הקטטר אל הקיר של ז'קט מים עם חתיכה קטנה של סרט.
  5. ודא לפחות תקופה של 30 דק 'של יציבות לפני תחילת כל המידות או התערבויות.

8. עירוי של תרופות

  1. (אופציונאלי) להשרות תרופות (למשל, דופמין) לבלוק פרוזדורי השמאל באמצעות משאבת תרופות סטנדרטית.
    הערה: אין לנו תרופות במינון פי וולדואר משקל חית גוף מאז מקבילת תזרים על תפוקת לב כולו עובר דרך גלגלת פרוזדורים; רק חלק קטן של זה עובר דרך מערכת הדם הכליליים, כפי שהיא עושה in vivo. לחלופין, סט של perfusate שני ניתן ליצור עם ריכוז קבוע מראש של תרופות ומשמש perfuse בלב.
    הערה: בפרוטוקול שלנו, אנו להחדיר תרופות במשך 12 דקות, איסוף נתונים פיסיולוגיים במהלך 10 הדקות הסופיות של כל עירוי והשוואתו אל שקדם מייד 10 דקות בסיס.

9. מניפולציות פיסיולוגיות

  1. קצב לב
    1. (אופציונאלי) תפר שני חוטי צעדה על קיר פרוזדורים ימין לצרף מכשיר צעדה זמני.
      הערה: זו מאפשרת שליטה מדויקת של קצב הלב (מעל לשיעור סינוס המקורי) וכן הבנה של הקשר בין קצב לב contractility העצמאית של תרופת cardiotonic.
  2. preload
    1. שנו אתpreload (מוגדר נפח דיאסטולי בסוף החדר שמאלי) על ידי שינוי גובה עמודת האכלת בלוק פרוזדורי השמאל.
  3. לחץ דם
    1. לתפעל את לחץ הדם (הקובע העיקרי של afterload במודל זה) באמצעות שסתומי לחץ על IH-51.
  4. תכולת חמצן כלילית
    1. להשיג דרגות שונות של היפוקסיה שריר לב על ידי המרוסס את הלב עם KHB הרווי בתערובות גז שונות. עושה זאת על ידי שימוש במאגרים במקטורן נפרד (כל אחת עם תערובת גז משלה) כדי להבטיח שיווי משקל בין הגז KHB.
    2. להשיג איסכמיה כלילית ב תפר ligating עורק כלילי דיסטלי.
      הערה: קשירת העורקים הכליליים הפרוקסימלי במצב הלב עובד יכול לגרום בעיות בתפקוד שריר הלב קטלני.
    3. להשרות איסכמיה גלובלית כלילית ב להפריע או לעכב זלוף מדרדר לתקופה מוגדרת של זמן.

Representative Results

סכימטי של לב המאובזרת באופן מלא זלוף מדרדר (איור 1 א) ו בלב עובד של החדר השמאלי (איור 1B). אבי העורקים אופיינית, פרוזדורים ימין ועל הלחץ של החדר השמאלי, השרטוטים נפח מוצגים באיור 2A -. D הלחץ הדיאסטולי סוף הטיפוסי הוא כ 3 - 5 מ"מ כספית במודל זה, ואת הלחץ הסיסטולי השיא הוא כ 100 מ"מ כספית איור 2E מדגים את השינוי. וביד שמאל העקיבה פרוזדורים כאשר צינורית LA הוא התרחק מחצה פרוזדורים במהלך ההשמה ומיצוב של צינורית. בניסויים אלה, הלחץ אבי העורקים נקבע ל 90 מ"מ כספית, ולחץ LA נקבע ל -10 מ"מ כספית.

כדי לבדוק את ההשפעות של קטכולאמינים, כל פרמטר פיזיולוגי (נבעה בעיקר קטטר לחץ-נפח התוכנה הנלווית) הושווה שקדמו תקופת המחקר. בדוגמה המוצגת, דופמין היה חדור ב 15 מיקרוגרם / ק"ג / דקה לבלוק פרוזדורים שמאל. למרות הלחץ בסוף הדיאסטולי הוא זהה בשני תנאים (לנוכח לחץ הפרוזדורים הקבוע במודל זה), נפח דיאסטולי בסוף החדר השמאלי יורד ב -2.5%, ואת הנפח סיסטולי סוף חדר השמאל יורד ב -4.9% והניב נפח פעימה גדל (איור 3 א). בהשוואה חליטות פלצבו, העבודה חדרית שבץ שמאל, המזוהה כאזור בתוך העקומה לחץ-נפח, עלה ב -32% במהלך הטיפול עם דופאמין (איור 3B, P <0.001, מבחן t, n = 10 בכל קבוצה). זה היה קשור עם עליה גדולה יותר ביחס צריכת החמצן של שריר הלב כדי חליטות פלצבו (איור 3 ג). בדרך זו, את עלויות עצמה ואנרגיה היחסיות של תרופות ומינונים cardiotonic שונות ניתן להשוות אחד עצמאית אחרת השפיעו על תנאי טעינה.

התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 "> איור 1
איור 1: תרשים של זרימה בתוך לב instrumented מלא ב מדרדר זלוף ועבודת לב מצב (לוח א ': מצב Langendorff; לוח ב':.. מצב לב עובד במצב מדרדר, KHB הוא החדיר בלחץ זלוף סט לתוך שורש האאורטה. מצב זה מנוצל כדי לשחזר את שריר הלב לאחר זמן איסכמי ובמהלך המכשור. בעבודת מצב לב, perfusate זורם דרך הלב השמאלי לפני המרוססת במחזור כלילית. במצב זה, שריר הלב חייב ליצור לחץ זלוף משלה. אנא לחץ כאן לצפייה גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
F igure 2: לחץ ונפח נציג העתקים שהושגו במהלך המדידות Baseline. (א) לחץ שורש אבי העורקים, (ב) עזב לחץ פרוזדורים, (C) לחץ חדרית שמאלה (D) עזב העתקים נפח חדרית במהלך המדידה הבסיסית מוצגים. נפח פעימה, עבודת שבץ, תפוקת לב, טאו, ופרמטרים נוספים ניתן לחשב באופן אוטומטי ומוצגים בזמן אמת על ידי התוכנה. מעקב אחר פרוזדורי שמאל קהה (E) קשור תפוקת לב עניה במצב לב עובד יכול להיות רמז כי הצינורית malpositioned ב אטריום השמאל. ראוי לציין, כי הגל נ הבולט עקיבת לחץ הפרוזדורים שמאל ממוקמת היטב נפוץ, ככל הנראה תוצאה של ציות פרוזדורים שמאל ירד חית instrumented המלא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

"Jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3:. השפעת הדופמין על לחץ-נפח Curve תוצאות עירוי הדופמין תזוזה שמאלה בעקום PV (א), לרבות נפח הפעימה גדל, ירד בסופו של נפח הסיסטולי, לעומת מדידות הבסיס. ראוי לציין, כי הצורה של כמה מרכיבים של עקומות PV אלה שונים מאלה בדרך כלל נמדדים vivo (ראה איור 4) בשל העדר של עורקי elastance ורידים. (ב) ביחס קו בסיס שקדם מייד, עבודת השבץ גדלה באופן משמעותי יותר במהלך חליטות הדופמין בהשוואה לפלצבו (**, P = 0.0017, t-test), וכך גם צריכת החמצן של שריר הלב (*, P = 0.013, t-test, C). באמצעות מודל זה, צריכת החמצן של שריר הלב הממוצע בתחילת המחקר היה 0.22 ± 0.02 מילימול O 2 / גרם רקמה / דקה, באמצעות dissolv מוערךתכולת חמצן ed של 165 μmol / L מלוח ב 40 ° C. ניתן להשתמש מדידות כאלה להשוות את צריכת החמצן של שריר הלב של תרופות שונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: ניתוח של לולאות לנפח בלחץ. The Loop לחץ-הנפח התיאורטי מוצג מתאר את מחזור הלב הרגיל בעקבות מסתם אאורטלי (AV) סגר (1), התכווצות isovolemic מתרחשת (1 - 2). כמו לחץ חדרית יורד מתחת ללחץ פרוזדורים. משך שלב זה מיוצג על ידי טאו. שסתום צניפי (MV) ואז פותח בעת ובעונה אחת עם התכווצות פרוזדורים, ממלא את החדר (2 - 3). התכווצות ואז מתחילה עם contracti isovolemicעל (3 - 4) עד שהלחץ חדרית עולה לחץ הדם הדיאסטולי, שאז AV נפתח. נפח פעימת ההבדל בין קווי 1 - 2 ו -3 -. 4 עבודת שבץ היא האזור בתוך 1 - 2 - 3 -. עקום 4 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

מודל הלב עובד זה מאפשר הערכה של ביצועי חדרית עם שליטה מלאה של חדרית preload ו afterload, מתח החמצן של perfusate, כמו גם קצב הלב. בין יתר, הוא מתיר הערכה של השפעות שריר לב הפנימיות של תרופות אינוטרופיות עצמאיות של afterload ו preload, אשר בדרכים שאינן אפשריים באמצעות מודל vivo. בגלל המודל הזה מנצל perfusate גְבִישָׁן, הוא מתיר הערכה שריר הלב בלי התערבות המוגלובין, לפשט ניתוח ספקטרוסקופיות של מדינות אנרגיה שריר הלב, למשל. 14 במודל זה, אטריום ימין אינה cannulated כחלק המכשור שלנו, למרות שזה אפשרי כדי לעשות זאת. אנחנו בכוונה בוחרים שלא לעשות זאת על מנת להקל על הדגימה של זרימת סינוס כלילית להערכת צריכת חמצן של שריר לב. חשוב לציין, כי, בלב התקין עדיין מבצע עבודות לחצו ונפח במודל זה כפי שהוא שואב את השיתוףסינוס ronary לזרום לתוך צינורית עורק הריאה. מתן כמה preload החדר הימני משפר מיצוב של מחיצת האף חדרית ומשפר את ביצועי החדר השמאלי, והוא מהווה מרכיב חשוב של מודל זה. 15

ישנן מספר מלכודות ניסיון לדבר. הראשון הוא cannulation המדרדר הראשוני, שאמורה להתבצע דחופה (כלומר, תוך פחות מ -2 דקות) כדי למזער את תקופת איסכמיה. המיומנות החשובה ביותר כדי להתמחות הוא בידוד יעיל, הכנה וטיפול של האאורטה עולה. חשוב כי הגדם אבי העורקים לא יקוצצו קצר מדי, משאיר מקום מספיק עבור cannulation מעל שסתום אבי העורקים. עם זאת, חשוב גם כי גדם אב העורקים לא יהיה ארוך מדי, דבר שיכול לגרום torqueing של אב העורקים סביב הצינורית. כמו כן, חשוב כי צינורית האאורטה שורש האאורטה להיות כראוי גודל בהתאמה. אבי העורקים גדול יתר על המידה על צינורית קטנה יכולה גםלהוביל torqueing של שורש האאורטה על הצינורית. העורק הימני subclavian בדרך כלל לוקח מן האאורטה עולה כ 7 מ"מ מעל שסתום אבי העורקים. זיהוי כלי brachiocephalic (כ 1 מ"מ קוטר) במהלך דיסקציה הזמירה של האאורטה לשרת ציוני דרך חשובה ובאשר חתך-רוחב אב העורקים. זמירת האאורטה ממש מתחת ההמראה של העורק brachiocephalic הראשון רצויה. הכללה של כלי זה שורש האאורטה גזוז בדרך כלל מוביל לדליפת KHB, ואובדן לחץ שורש האאורטה במעברם למצב הלב עובד.

היבט נוסף מאתגר מבחינה הטכנית של cannulation הוא cannulation פרוזדורי השמאל. למרות שזה אינו ריאלי cannulate תוספת פרוזדורי השמאל, מצאנו כי הצינורית לעתים קרובות נתקעה בתוך התוספת, לא עוברת בקלות לתוך הגוף של הפרוזדור השמאלי. לפיכך, אנו מעדיפים לבצע את החתך בגוף של הפרוזדור השמאלי, כ2 מ"מ ינעל חריץ החדרים והעליות. חשוב למקם את צינורית פרוזדורי השמאל במישור של ממש לפני כניסה כדי למנוע קריעה של אטריום דקות קיר כאשר הבטיח הצינורית.

מצאנו כי הגודל האידיאלי של חתך אטריום שמאל היה כ -3 מ"מ. יצירה קטנה מדי של חתך עלולה גם להפוך את המיקום של צינורית פרוזדורים שמאל יותר קשה, ועלולה להוביל קריעה של הפרוזדור השמאלי. אנו משתמשים מ"מ ישר, 8, חתיכת משופעים של צינורות חמצן-חדיר (מ"מ פנימי בקוטר 2.9) על בלוק פרוזדורי השמאל. מצאנו כי באמצעות זה, ולא צינורית עם קצה משופע, מוביל cannulation פרוזדורים העקבי ביותר ומקל את התהליך הבטיח לחסום פרוזדורי השמאל. לא משנה של הצינור בשימוש, חשוב להבטיח כי בסופו של הצינור אינו האפיל על ידי מחצה הפרוזדורים או שסתום צניפי (כפי שהוא מתואר לעיל, מצאנו כי עקיבת לחץ פרוזדורי השמאל הייתה מועילה REGA זהrd), כמו גם בתנועה עדינה של צינורית פרוזדורים יכול לשנות preload החדר השמאלי משמעותית ומדידות המודינמי שהתקבל. מאותה הסיבה, חשוב להבטיח כי הפרוזדור השמאלי לא להדליף בא לאחר פתיחת בלוק פרוזדורי השמאל. חשוב ללא תלות בסוג של צינורות בשימוש על מנת להבטיח כי הצינורות בתוך מערכת זו הוא חמצן בלתי חדיר על מנת להבטיח אספקת חמצן נאותה ללב.

היבט נוסף מאתגר מבחינה טכנית של ההליך היה המיקום של קטטר בנפח הלחץ (PV). אנחנו בתחילה מועדף הנפקה מדרדרת של הקטטר דרך בלוק אב העורקים. למרות שהדבר אפשרי מבחינה טכנית, מצאנו אותו להיות הרבה יותר פשוט ומועיל למקם את הקטטר PV באמצעות לנקב transapical. יש להקפיד לפקח על המיקום של קטטר לאורך כל תקופת הניסוי, כמו בזמנים הקטטר עשוי לנוע פנימה או החוצה של החדר השמאלי. ניתן לעשות זאת על ידי ניטור pressuמחדש, שרטוטים נפחו לאורך זמן.

לבסוף, יש להקפיד על מנת להבטיח כי פתרון KHB נוצר טרי עבור כל ניסוי. אפשר לשקול את המרכיבים של KHB ולאחסן אותם צינורות חרוטים בצורת אבקה מראש. ביום של ניסויים, עשויים להיות מעורבים אלה עם מים סטריליים, מסוננים, דו תחמוצת הפחמן / חמצן, ולאחר מכן סידן הוסיף לתערובת. כמו כן, חשוב לשטוף את המערכת עם חומר ניקוי אבקה פעיל אנזים כגון Tergazyme (או דומה) ולהחליף את מסנן perfusate בקביעות.

מספר מגבלות של הכנה ניסיוני זה יצוין. ראשית, בדומה לכל הכנות Langendorff-perfused גְבִישָׁן, KHB ו perfusates asanguinous האחר יש חמצן נושאת ביחס קיבולת פחתה משמעותית לדם. אמנם זה הוא מתוגמל באופן חלקי באמצעות התרחבות כלילית ותזרים כלילית supraphysiologic, ההכנה היא לא לגמרי physiologiג מסיבה זו. שנית, בגלל התאימות כמעט האינסופית של חדר Windkessel בשימוש בכלי זה, לחצי סיסטולי ודיאסטולי הם רק מופרדים מינימאליים (ראה איור 2 א) וכך לחץ זלוף כלילית הוא הלא פיסיולוגי. זה תהא ניתנת לסתירה דגמים עתידיים על ידי שילוב מרכיב elastance לבלוק afterload. שלישית, כמו עם כל הכנות הלב המבודדות, בלב עובר תקופה מוגדרת (2 - 3 דקות) של איסכמיה חמה אשר עשוי ליצור פציעה או חוסר תפקוד שריר לב. מזעור פגיעה זו באמצעות תרגול של הטכניקה הוא בעל חשיבות עליונה לתוצאות נציג. יתר על כן, למרות צורך על צער בעלי חיים, הרדמה נשאפת עשויה לשמש מדכא שריר לב בשלב מוקדם של תהליך רה-פרפוזיה, למרות שזה צפוי כי האפקט הזה הוא בוטל מהר ככל הלב reperfused עם KHB.

מערכת הלב עובד תיאר מאפשרת מגוון רחב של Physiolחקירות ogic רלוונטיות טיפול, מחקר והוראה חולים. עם כמה שינויים נוספים, המערכת יכולה לשמש גם כדי לדמות פיזיולוגיה חשובה רלוונטית מחלת לב מולדת, כוללים יתר לחץ דם ריאתי ופיזיולוגית חדר יחיד. ההגבלות כוללות שזה הכנה vivo לשעבר, כי הלב מתבצעת perfused ידי חיץ במקום דם תוכן גבוה-חמצן.

Acknowledgments

ציוד הניסויים שתוארו כאן מומנו על ידי המחלקה לקרדיולוגיה בבית החולים לילדים בבוסטון ובבית ידי תרומות פילנתרופיות ממשפחת Haseotes. אנו מודים בני הזוג. פרנק מק'גוון Huamei הוא לספק לנו חוויות מוקדמות עם המודל הזה, וכדי לינדזי תומסון לסיוע עם יצירות אמנות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 8.401 g/4 L
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E6758 0.744 g/4 L
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333 1.580 g/4 L
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 0.578 g/4 L
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256 0.220 g/ 4 L
Sodium chloride Sigma-Aldrich S3014 27.584 g/4 L
Dextrose Sigma-Aldrich D9434 7.208 g/4 L
Calcium chloride dihydrate Sigma-Aldrich C7902 1.470 g/4 L
Biventricular working heart model Harvard Apparatus IH-51
Pressure volume catheter Millar, Inc SPR-944-1 6 mm spacing catheter used
LabChart Pro 8 AD Instruments Version 8.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Langendorff, O. Untersuchungen am uberlebenden saugethierherzen [investigations on the surviving mammalian heart. Arch Ges Physiol. 61, 291-332 (1895).
  2. Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart. Am J Physiol. 212, (4), 804-814 (1967).
  3. Friehs, I., Cao-Danh, H., et al. Adenosine prevents protein kinase C activation during hypothermic ischemia. Circ. 96, (9 Suppl), 221-226 (1997).
  4. Aoyagi, T., Higa, J. K., Aoyagi, H., Yorichika, N., Shimada, B. K., Matsui, T. Cardiac mTOR rescues the detrimental effects of diet-induced obesity in the heart after ischemia-reperfusion. Am J Physio. Heart Circ Physiol. 308, (12), H1530-H1539 (2015).
  5. Kitahori, K., He, H., et al. Development of left ventricular diastolic dysfunction with preservation of ejection fraction during progression of infant right ventricular hypertrophy. Circ Heart Fail. 2, (6), 599-607 (2009).
  6. Cowan, D. B., Noria, S., et al. Lipopolysaccharide internalization activates endotoxin-dependent signal transduction in cardiomyocytes. Circ Res. 88, (5), 491-498 (2001).
  7. Broadley, K. J. An analysis of the coronary vascular responses to catecholamines, using a modified Langendorff heart preparation. Br J Pharmacol. 40, (4), 617-629 (1970).
  8. Schmidt, H. D., Hoppe, H., Heidenreich, L. Direct effects of dopamine, orciprenaline and norepinephrine on the right and left ventricle of isolated canine hearts. Cardiol. 64, (3), 133-148 (1979).
  9. Fawaz, G., Tutunjini, B. The effect of adrenaline and noradrenaline on the metabolism and performance of the isolated dog heart. Br J Pharm Chemother. 15, 389-395 (1960).
  10. Allen, L. A., Fonarow, G. C., et al. Hospital variation in intravenous inotrope use for patients hospitalized with heart failure: insights from Get With The Guidelines. Circ Heart Fail. 7, (2), 251-260 (2014).
  11. Furnival, C. M., Linden, R. J., Snow, H. M. The inotropic and chronotropic effects of catecholamines on the dog heart. J Physiol. 214, (1), 15-28 (1971).
  12. Li, J., Li, J., et al. Adverse effects of dopamine on systemic hemodynamic status and oxygen transport in neonates after the Norwood procedure. J Am Coll Cardiol. 48, (9), 1859-1864 (2006).
  13. Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart. Am J Physiol. 271, (2 Pt 2), H784-H789 (1996).
  14. Asfour, H., Wengrowski, A. M., Jaimes, R., Swift, L. M., Kay, M. W. NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts. J Vis Exp. (65), (2012).
  15. Demmy, T. L., Magovern, G. J., Kao, R. L. Isolated biventricular working rat heart preparation. Ann Thor Surg. 54, (5), 915-920 (1992).
מכרסם עבודת לב דגם לחקר ביצועי שריר לב ואת צריכת חמצן
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DeWitt, E. S., Black, K. J., Kheir, J. N. Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption. J. Vis. Exp. (114), e54149, doi:10.3791/54149 (2016).More

DeWitt, E. S., Black, K. J., Kheir, J. N. Rodent Working Heart Model for the Study of Myocardial Performance and Oxygen Consumption. J. Vis. Exp. (114), e54149, doi:10.3791/54149 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter