Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيل وقت واحد من تخطيط كهربية الشبكية والإمكانيات البصرية مستدعى في الفئران تخدير

Published: July 1, 2016 doi: 10.3791/54158
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne

Introduction

قياس مخطط كهربية (أرج) والبصرية إمكانات أثار (VEP) تقديم تقييمات كمية مفيدة من سلامة المسار البصري. وأرج يقيس الاستجابات الكهربائية للشبكية لتحفيز الضوء، في حين يقيس VEP سلامة الوظيفية المقابلة من المسارات البصرية من شبكية العين إلى القشرة البصرية الأولية التالية لنفس الحدث الضوء. توضح هذه المخطوطة بروتوكول لتسجيل وتحليل استجابات أرج وVEP في نموذج معملي يشيع استخدامها، والفئران.

يوفر أرج مؤشر على سلامة وظيفية لعدد من فئات رئيسية خلايا شبكية عن طريق قياس استجابة الكهربائية الإجمالية الشبكية لومضة من الضوء. سلسلة منسقة من التدفقات الأيونية تبدأ من بداية الخفيفة وتعويض، تنتج التغييرات التي يمكن اكتشافها في التيار الكهربائي التي يمكن قياسها باستخدام أقطاب سطح وضعت خارج العين. يمثل الموجي الناتج مزيج من حد ذاتها ريس من عناصر محددة جيدا، واختلاف في السعة، والتوقيت والتردد. وقد أظهرت مجموعة كبيرة من الأبحاث أن هذه المكونات يتم حفظها بشكل جيد نسبيا في العديد من شبكية الفقاريات وأن المكونات يمكن فصلها عن بعضها البعض. عن طريق اختيار بحكمة شروط التحفيز (التحفيز فلاش، الخلفية، الفاصل الزمني interstimulus) واختيار الخصائص المحددة للالموجي المركب لتحليل يمكن للمرء أن يكون واثقا من عودته قدرا من مجموعة معينة من خلايا الشبكية 1،2. هذه الخصائص تكمن وراء فائدة، وبالتالي التطبيقات واسعة النطاق من أرج كإجراء غير الغازية وظيفة شبكية العين. وتركز هذه المخطوطة على منهجية لقياس أرج وتحليل معالمه لإرجاع معلومات حول بعض فئات رئيسية الخلايا في شبكية العين، وهي خلايا مستقبلة للضوء (المكون PIII)، وخلايا القطبين (المكون PII) وخلايا الشبكية العقدة (الإيجابية استجابة عتبة ظلامية أو pSTR).

= "jove_content"> وVEP يوفر فحص للاستجابة القشرية إلى النور؛ منشؤها الأول من شبكية العين وترسل بعد ذلك بشكل متسلسل عن طريق العصب البصري والجهاز البصري، المهاد (الافقي الركبي النواة، LGN) والأشعة الضوئية لمنطقة V1 من القشرة 3. في القوارض، فإن الغالبية (90-95٪) من الألياف العصبية البصرية من كل متقاطع العين 4 ويعصب المقابل منتصف الدماغ. وخلافا للأرج، فمن حتى الآن لا يمكن أن تنسب مكونات مختلفة من VEP لفئات معينة من الخلايا، و 5 وبالتالي يتغير في أي مكان على طول المسار البصري يمكن أن تؤثر على الموجي VEP. ومع ذلك، فإن VEP هو مقياس مفيد غير الغازية من الأداء البصري وسلامة مسار البصرية. وVEP، عندما تستخدم بالاقتران مع أرج، يمكن أن توفر تقييما أكثر اكتمالا من النظام البصري (أي الشبكية / مسار بصري).

ويمكن إجراء أرج وVEP التسجيلات في عزلة أو في تركيبة، اعتمادا على تطبيق صحيفةالأيونات الموجبة. المنهجية الواردة في هذه الورقة تتيح تقييم في وقت واحد في شبكية العين والقشرية الكهربية أثار المرئية من كلتا العينين ونصفي الكرة الأرضية في الفئران تخدير. هذا هو وسيلة مفيدة لتقييم أكثر شمولا وظيفة الشبكية والآثار المنبع أن التغيرات في وظيفة الشبكية يمكن أن يكون على وظيفة البصرية القشرية أثار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للقانون الاسترالي من الممارسة لرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض العلمية، التي وضعها مجلس البحوث الصحية والطبية الوطنية في أستراليا. تم الحصول على موافقة الأخلاق من جامعة ملبورن، كلية العلوم، لجنة أخلاقيات الحيوان (موافقة عدد 0911322.1).

1. ما قبل الزرع المزمن VEP أقطاب

ملاحظة: إذا المتزامنة إشارات أرج وVEP هي التي يتعين جمعها الحيوانات يجب أن يكون مزروع جراحيا مع VEP الأقطاب لا يقل عن 1 قبل أسبوع للإشارة إلى المجموعة.

  1. تعقيم مقاعد البدلاء الجراحي قبل التجريب عن طريق تنظيف مع الكلورهيكسيدين (0.5٪ في 70٪ من الإيثانول). الأوتوكلاف جميع المعدات الجراحية قبل الاستخدام. تغطية حيوان مع ثنى الجراحية المعقمة. ضمان جميع المجربون ارتداء أقنعة جراحية، العباءات وقفازات معقمة.
  2. لحث التخدير مع 3-3،5٪ الأيزوفلورين مع O 2 بمعدل تدفق من 3 لتر / دقيقة. الحفاظ على انوsthesia بنسبة 1.5٪ و 2 لتر / دقيقة طوال الجراحة. ضمان عمق كاف من التخدير بسبب عدم وجود رد فعل مخلب قرصة.
  3. تطبيق 1٪ من الصوديوم كاربوكسي ميتيل سللوز على القرنية لمنع جفاف العينين.
  4. حلاقة منطقة × 30 ملم 30 ملم على جبهته، الخلفي للعين والأمامي للآذان.
  5. وضع الحيوان على وسادة الحرارة (37 مئوية) للحفاظ على درجة حرارة الجسم وتحقيق الاستقرار في الرأس الحيوانات مع إطار التجسيمي.
  6. تطهير منطقة حلق مع بوفيدون اليود 10٪ ثلاث مرات. تجنب استخدام المطهرات التي تحتوي على الكحول لمنطقة قريبة من العين، كونها تتفق مع معيار الممارسة التي وضعتها رابطة التكنولوجيين الجراحية.
  7. جعل شق-متوسط ​​سهمي على رأسه مع مشرط ومن هذه المكوس و~ 20 مم دائرة أنسجة الجلد للكشف عن عظم الجمجمة.
  8. إزالة السمحاق الأساسي عن طريق كشط وتجفيف بشاش لفضح خيوط الجمجمة الاكليلية والسهمي.
  9. لناجي لدغ الأسنان تعلق على الحفر، ينقب اثنين من الثقوب (0.7 مم، عمق ~ 1 مم) من خلال الجمجمة في نصفي الكرة الأرضية في التجسيمي تنسق: 7 ملم الذيلية إلى bregma، 3 مم الوحشي على خط الوسط.
  10. برغي في مسامير الصلب غير القابل للصدأ (قطر 0.7 ملم، وطول 3 ملم، تعقيمها مع الكلورهيكسيدين) في اثنين من الثقوب مسبقة الصنع تصل إلى عمق ~ 1 مم (2 ملم من المسمار يتعرض) للسماح مرسى ثابت. هذه الاتصالات الجافية دون الإضرار الأنسجة القشرية الكامنة.
  11. إعداد المنطقة الجراحية لالملغم السني من خلال تجفيف عظم الجمجمة مع الشاش، والتراجع الجلد فضفاض مع اثنين من 3-0 الغرز في ~ 4 و 8:00.
  12. نشر الملغم السني على الجمجمة يتعرض لتأمين الأقطاب المسمار (مسامير الصلب غير القابل للصدأ هو موضح في الخطوة 1.10) في المكان. ضمان ~ 1.5 ملم من المسامير لا تزال تتعرض للتسجيل.
  13. إزالة الغرز التراجع.
  14. ضخ 0.5٪ تحت الجلد كاربروفين (5 ملغ / كلغ) لتسكين الألم والمالحة (كلوريد الصوديوم 0.9٪، 10.5 مل) تحت الجلد لاستبدال السوائل.
  15. السماح للحيوان للتعافي في أقفاص منفصلة. لا تترك الحيوانات غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
  16. لا عودة الحيوان إلى الشركة من الحيوانات الأخرى حتى أنه قد تعافى تماما من عملية جراحية (لا تقل عن 5 أيام).
  17. تواصل إدارة 0.5٪ تحت الجلد كاربروفين لتسكين الألم (5 ملغ / كلغ) مرة واحدة يوميا لمدة 4 أيام.
  18. سجل أرج وVEP 1 أسبوع بعد الجراحة.

2. أرج وVEP تسجيل

  1. إعداد جمع البيانات
    1. استخدام برامج الكمبيوتر لتحريك وقت واحد الحوافز والحصول على البيانات 2 وفقا لالإعدادات الموصى بها أدناه.
      1. تضخيم الإشارات 3 (أرج: × 1000، VEP: x10،000) مع الربح المقرر داخليا من قبل ما قبل مكبر للصوت معزولة ومكبر للصوت، ومع كلتا العينين مطابقة للمقاومة.
      2. تعيين معدل أخذ العينات لأرج إلى 4 كيلو هرتز أكثر من 650ميللي ثانية مسجلا نافذة (2560 نقطة)، للقيام بذلك، انقر فوق علامة التبويب ل "القاعدة الزمن" في برنامج الحصول على البيانات (على اسم ونسخة من الجدول البرمجيات انظر لمواد)، حدد "2560" للعينات، و "500 مللي" للمرة التي سيعود نافذة تسجيل 650 ميللي ثانية.
        1. استخدام نفس الأسلوب لضبط معدل أخذ العينات لVEP إلى 10 كيلو هرتز أكثر من 250 مللي ثانية الحقبة. السماح ل10 مللي ثانية خط الأساس قبل التحفيز لكل من أرج وVEP التسجيلات. للقيام بذلك، انقر فوق "إعداد" علامة التبويب. حدد "محفز" لإحضار نافذة حوار جديد. في هذا الإطار حدد "نبض" من الهبوط قائمة ل "وضع" أسفل؛ وتعيين قيمة "تأخير" إلى "10 مللي ثانية".
      3. 1000 هرتز (- - 3 ديسيبل) تعيين أرج تصفية إلى 0.3 الفرقة تمرير. يتم ذلك عن طريق النقر على "بيو مكبر للصوت" في برنامج الحصول على البيانات. قم بتعيين قيمة ل "السامي ممر" إلى "0.3Hz"، وقيمة ل "تمرير منخفض" إلى "1 كيلو هرتز".
      4. باستخدام طريقة المذكور في 2.1.1.3، تعيين VEP إعدادات الفرقة تمرير إلى 0.1 - 100 هرتز (- 3 ديسيبل) على النحو الموصى به من قبل الجمعية الدولية للالكهربية السريرية لرؤية (ISCEV) للتسجيلات VEP الإنسان 6.
  2. إعداد الكهربائي
    1. العرف جعل وأرج نشطة / نشطة وVEP أقطاب نشطة / نشطة عن طريق ربط أسلاك الفضة أو مقطع التمساح إلى قيادة القطب على التوالي 2. تجاريا حصول على القطب الأرض.
    2. لالأقطاب حسب الطلب 4، وقطع نهاية الذكور من التمديد الكهربائي الرصاص. إزالة 1 سم للطلاء العزل تترافلوروإيثيلين الخارجي بشفرة مشرط ضمان السلك الداخلي غير معطوب.
    3. قبل الموضة أرج أقطاب خاملة بقطع طول 70 مم من الأسلاك الفضة (0.3 ملم سمك) وتشكيل حلقة ~ 8 ملم في القطر لتطويق العين الفئران. إعداد دائرة موحدة من خلال وضع حلقة على 1 مل ماصة.
    4. قبل الأزياء الأقطاب أرج النشطة عن طريق قطع طول 30 مم من الأسلاك الفضة وتشكيل حلقة صغيرة في الاتصال بلطف القرنية الفئران (~ 1-2 ملم في القطر)
    5. تعلق بشكل آمن الأقطاب الكهربائية (2 أرج النشط، 2 أرج غير نشط، 1 VEP غير نشط) لزمام المبادرة الكهربائي بواسطة الضفر الفضة مع السلك الداخلي عرضة للخطر.
    6. عزل المعدنية المكشوفة الزائد مع اخفاء الشريط للحد من الأعمال الفنية الضوئية.
    7. على أقطاب خاملة أرج عصا قطعة صغيرة من قفل هوك وحلقة (~ 5 مم × 20 مم) لاخفاء الشريط لتمكين مرفق مستقر للحزام القوارض الرقبة.
    8. نعلق مقطع التمساح إلى السلك الداخلي من القطب يؤدي إلى جعل أقطاب VEP النشطة.
    9. قبل التسجيلات، بالكهرباء السطوح المكشوفة من الأسلاك الفضة (أي حلقة الخاملة وتشغيل إشاراتلقد غيض) مع كلوريد باستخدام مصدر DC 9 V لمدة 20 ثانية لتحسين إشارة التوصيل.
      1. للقيام بذلك، تزج غيض الفضة من سلك كهربائي أرج (بوصفها أنود خلية الأولية) في محلول ملحي. ربط الطرف الآخر من هذا السلك الكهربائي إلى الطرف الموجب للبطارية 9 فولت.
      2. قم بتوصيل سلك آخر (الكاثود) إلى الطرف السالب للبطارية، وتزج الطرف الآخر في المياه المالحة كذلك. قطع الاتصال بعد 20 ثانية، ومراقبة رأس شظية من سلك كهربائي أرج لتكون مغلفة بالتساوي في اللون الأبيض.
        ملاحظة: إعداد الأقطاب أرج جديدة لكل دورة تجريبية (~ ما يصل إلى 8 ساعة) لضمان المباح للطلاء كلوريد.
  3. إعداد الحيوان
    1. داكنة تكيف الحيوانات بين عشية وضحاها (≥ 8 ساعة) قبل التسجيلات في غرفة ضيقة الخفيفة. ضمان التكيف مع الظلام الاقصى في إطفاء الأنوار الغرفة، وإغلاق جميع الأبواب والستائر. تقليل تسرب الضوء من خلال وضع مواد واقية من الضوء حولتقاطعات الأبواب / النوافذ وشاشات الكمبيوتر وضع خارج ستائر سوداء سميكة.
    2. إجراء إعداد الحيوان في غرفة مظلمة مع المعونة من خافت ينبعث منها ضوء أحمر الصمام الثنائي (LED؛ 17.4 cd.m -2، λ الحد الأقصى = 600 نانومتر) للحفاظ على حساسية قضيب.
    3. تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين / زيلازين (60: 5 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن العضلي. تأكيد عمق كاف من التخدير بسبب عدم وجود رد فعل مخلب قرصة.
    4. للحفاظ على التخدير وإدارة جرعة أخرى من التخدير (50٪ من الجرعة الأولى) بعد 50 دقيقة إذا لزم الأمر.
    5. للتخدير الموضعي إضافية تطبيق قطرة واحدة من 0.5٪ proxymetacaine إلى كل عين، وميض من السوائل الزائدة.
    6. لاتساع حدقة العين تطبيق قطرة واحدة من 0.5٪ تروبيكاميد إلى كل عين، ثم تجف من السوائل الزائدة.
  4. أرج وVEP القطب المواقع
    1. وضع الحيوان على منصة أرج أمام وعاء فريق Ganzfeld تقع في قفص فاراداي. تجنب استخدام وسادة التدفئة الكهربائية، كما جلإدخال الضجيج الكهربائي في التسجيلات الكهربية. ملاحظة: يتم إلحاق منصة الى منصة المياه تعميم ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم.
    2. حيوان آمن إلى منصة مع شريط من قفل هوك وحلقة صبت ​​لكن ليس بإحكام حول مؤخر.
    3. ربط الكهربائي VEP نشط حول القواطع السفلية من الفئران تخدير.
    4. وضع أقطاب خاملة أرج من تطويق حلقة الصلبة غير جراحية حول خط الاستواء العين. استقرار هذا عن طريق ربط كهربائي إلى قطاع قفل هوك وحلقة حول مؤخر. أكرر للعين المقابل.
    5. ربط VEP الأقطاب النشطة عن طريق ربط مقاطع التمساح إلى مسامير الفولاذ المقاوم للصدأ قبل زرعها في الجمجمة.
    6. وضع قطرة صغيرة من 1٪ من الصوديوم كاربوكسي ميتيل سللوز على القرنية قبل وضع القطب الكهربائي أرج نشط لتحسين جودة الإشارة. ملاحظة: السوائل اللزجة يساعد أيضا في الحفاظ على ترطيب القرنية في جميع أنحاء التجريب لالمصغرةاآلثار تشكيل جفاف من نوع الساد في القوارض 7.
    7. وضع قطرة صغيرة من 1٪ كربوكسي ميثيل سلولوز الصوديوم على القواطع السفلية لتحسين الاتصال من القطب غير نشط VEP وبالتالي إشارة الجودة.
    8. وضع الأقطاب أرج نشطة لمسة خفيفة على سطح القرنية المركزي باستخدام micromanipulator تعلق على الذراع التجسيمي مبنية خصيصا.
    9. إدراج 2-5 ملم من القطب إبرة الأرض (الفولاذ المقاوم للصدأ) تحت الجلد في الذيل.
    10. إذا لزم الأمر تجف أي السوائل الزائدة من الجفن السفلي قبل تسجيل لتحسين جودة الإشارة.
    11. منصة الانزلاق أقرب إلى وعاء فريق Ganzfeld ضمان عيون الحيوان محاذاة مع افتتاح وعاء لتمكين حتى يضيء كل من شبكية العين (راجع الخطوة 2.4.1).
    12. إغلاق قفص فاراداي للحد من الضوضاء الدخيلة.
  5. جمع البيانات
    1. استخدام قاتمة اختبار فلاش (- 0.52 سجل cd.sm -2) لتقييم ما إذا placem الكهربائيوالأنف والحنجرة مرض 2. في ظل ظروف مراقبة هذا من شأنه أن يؤدي إلى اتساع أرج من ~ 800 μV والتباين بين عين لا يزيد عن 10٪. إذا أقطاب تغيير موضع المطلوبة.
    2. بعد اختبار فلاش سماح للحيوانات إلى dark-التكيف لمدة 10 دقيقة في الظلام الدامس قبل التسجيل.
    3. ومضات الحالية من المحفزات الضوئية باستخدام وعاء فريق Ganzfeld في حين جمع أرج وVEP اشارات وقت واحد في مللي ثانية الوقت النافذة ~ 500. التقدم من باهتة إلى أكثر إشراقا ضوء المستويات من أجل الحفاظ على ما يكفي من الظلام التكيف مع الطول الموجي معينة.
    4. جمع إشارات على مجموعة من الطاقات مضيئة للحصول STR، ب الموجة و/ الطول الموجي ب-موجة من أرج. متوسط ​​المزيد من الاشارات على الصعيدين باهتة الخفيفة (20 تكرار) وأقل في الطاقة أكثر إشراقا مضيئة (1 تكرار). تدريجيا إطالة الفاصل الزمني بين التحفيز 1-180 ثانية من الأكثر خفوت لألمع مستوى الضوء. انظر الجدول رقم 1 لبروتوكول المثال.
    5. لايزو في وقت متأخر من قضيب ومخروط الردود أرج، والاستفادة من النموذج يقترن فلاش 8. الشروع في أربع ومضات في 1.52 سجل cd.sm -2 مع فاصل زمني 500 مللي ثانية بين التحفيز 2 في ما بينهما. رقميا طرح الموجي مخروط (3 الثالثة أو عشر فلاش 4) من الموجي المختلط (1 الحادي وفلاش) للتوصل إلى استجابة قضيب المفترضة.
    6. لتسجيل إشارات VEP، متوسط ​​20 يكرر في الطاقات إشراقا مضيئة (أي - 0،52-1،52 سجل cd.sm -2، 5 ثانية الفاصلة بين التحفيز). لاحظ أن فلاش الأول في هذه السلسلة إرجاع استجابة الظلام تكييفها التقليدية أرج.
    7. السماح 1-3 دقيقة لإعادة التكيف بعد الاحتلالات (20) VEP قبل أكثر إشراقا أرج الخطوة التالية، اعتمادا على الطاقة مضيئة.
    8. بعد الانتهاء من جمع البيانات، والموت ببطء الحيوان تخدير مع حقن داخل القلب من الصوديوم بنتوباربيتال (325 ملغ / مل، 3 مل).
المحافظة على مع next.within صفحة = "دائما">
الموجي الطاقة ضوء التحفيز (تسجيل cd.sm -2) عدد التكرارات فترة interstimulus (ثانية)
STR -6.24 20 2
STR -5.93 20 2
STR -5.6 20 2
STR -5.33 20 2
قضيب ب الموجة -4.99 10 2
قضيب ب الموجة -4.55 10 2
قضيب ب الموجة -4.06 5 5
قضيب ب الموجة -3.51 5 5
قضيب ب الموجة -3.03 1 15
قضيب ب الموجة -2.6 1 15
قضيب ب الموجة -1.98 1 15
أ- مختلطة / ب الموجة -1.38 1 30
أ- مختلطة / ب الموجة -0.94 1 30
فلاش 1: مختلط متوسط ​​أ / ب الموجة من 20: VEP -0.52 20 5
(90 ثانية قبل التالي)
فلاش 1: مختلط متوسط ​​أ / ب الموجة من 20: VEP 0.04 20 5
(120 ثانية قبل التالي)
فلاش 1: مختلط متوسط ​​أ / ب الموجة من 20: VEP 0.58 20 5
(180 ثانية قبل التالي)
إف إل أي إسح 1: مختلط متوسط ​​أ / ب الموجة من 20: VEP 1.2 20 5
(180 ثانية قبل التالي)
فلاش 1: مختلط متوسط ​​أ / ب الموجة من 20: VEP 1.52 20 5
(180 ثانية قبل التالي)
مخروط أ / ب الموجة 1.52 4 0.5

الجدول 1. أرج وبروتوكول تسجيل VEP باستخدام مجموعة من الحوافز للطاقة. العروض التحفيز التقدم من خافت (أعلى) إلى (أسفل) ومضات مشرقة، مع ما يكفي من الفاصل الزمني بين التحفيز لضمان التكيف الظلام. في نهاية المراسم، ويرد تكرار أربع ومضات مع فترة قصيرة للحصول على استجابة مخروط بوساطة.

3. تحليل أرج الطول الموجي

ملاحظة: وقد وصفت أرج وVEP تحليل بالتفصيل سابقا 3،9،10 و.توفر الأقسام التالية لمحة موجزة.

  1. إشارات التصدير في شكل لمرة والجهد الرقمي لبرنامج جداول البيانات لتحليل البيانات.
  2. قضيب وظيفة photoreceptoral
    1. نموذج من الحافة الأمامية من على بعد موجة PIII مع تأخر التمويه (المعادلة 1) 11.
      PIII (ط، ر) = رو PIII ∙ [1 - إكسب (- ط • وS (ر - ر د) 2)] لر> ر د (المعادلة 1)
    2. تحسين تناسب أكثر من فرقة اثنين من الطاقات ألمع مضيئة 12،13 (أي 1.22 و 1.52 سجل cd.sm -2).
    3. نموذج تصل إلى 90٪ من السعة على بعد موجة لتجنب الاختراقات بعد receptoral 14.
      ملاحظة: النموذج إرجاع السعة المشبعة (روم PIII، μV)، حساسية (S، M 2 .cd -1 .S -3) وتأخير (ر د، ميللي ثانية) للاستجابة photoreceptoral.
  3. قضيب القطبين وظي خليةأيون
    1. رقميا طرح نموذج PIII (انظر أعلاه) من الطول الموجي مختلطة لإعادة PII مختلطة مع إمكانات متذبذبة الفوقية.
    2. لاستخراج PII قضيب من PII المختلط، رقميا طرح استجابة مخروط (3 الثالثة أو فلاش عشر 4 في 1.52 سجل cd.sm -2) من مختلطة PII (1 ش فلاش في cd.sm 1.52 سجل -2).
    3. ثم، وتطبيق مرشح تمرير منخفض إلى الموجي (46.9 هرتز، -3 ديسيبل، بلاكمان نافذة) لإزالة إمكانات متذبذبة. الموجي المتبقي هو استجابة PII قضيب 10.
    4. استخراج قضيب PII الذروة السعة ومؤامرة ضد كل شدة التحفيز (أقل من -2 PII سجل cd.sm -2 وقضيب معزولة في 1.52 سجل cd.sm -2) 10.
    5. نموذج هذه البيانات باستخدام وظيفة القطعي (المعادلة 2)، الذي يوفر قدرا من الداخلية سلامة خلايا شبكية.
      V (ط) = V ماكس (ط ن / (ط ن+ ك ن)) (المعادلة 2)
      ملاحظة: هذه المعادلة ترجع استجابة PII القصوى (V كحد أقصى، μV)، 1 / الحساسية (ك، تسجيل cd.sm-2) والمنحدر من وظيفة (ن) 15.
  4. مخروط وظيفة الخلية القطبين
    ملاحظة: كما يتم أخذ استجابة مخروط في كثافة واحدة (1.52 سجل cd.sm -2) وعاد السعة وتوقيت على هذا المستوى الضوء.
    1. استخراج مخروط القصوى استجابة PII 2،16.
    2. استخراج الوقت الضمني الذي هذه الاستجابة القصوى يتوافق 2،16.
  5. وظيفة الخلايا العقدية
    1. وبما أن STR هو إشارة صغيرة، وتطبيق مرشح تمرير منخفض مع درجة 50 هرتز إلى الموجي للقضاء على الترددات العالية والضوضاء خط (46.9 هرتز، -3 ديسيبل، بلاكمان الإطار).
    2. استخراج استجابة pSTR القصوى 3،17.
    3. استخراج الوقت الضمني الذي هذه الاستجابة القصوى يتوافق 3،17.

4. آناتحلل من VEP الطول الموجي

  1. استخراج مكونات القصوى والدنيا للVEP (P1، P2 N1 و). لمزيد من التفاصيل انظر المراجع 3،6.
  2. سعة صريحة كما حوض إلى الذروة سعة من ذروتها السابقة أو الحوض الصغير (P1N1 وN1P2) 3،6.
  3. استخراج الوقت الضمني (هو) الذي يتوافق مع هذه الاستجابة القصوى (P1 ذلك، N1 ذلك، P2 عليه) 3،6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وأرج على الموجة (> -1.38 سجل cd.sm -2)، ب-موجات (> - 4.99 سجل cd.sm -2) تقارير المعاملات المشبوهة (<- 4.99 سجل cd.sm -2) وVEPs (> - 0.52 تسجيل cd.sm -2) سجلت في وقت واحد (الشكل 1 و 3). في ومضات خافتة جدا، وشهدت STR الإيجابي (pSTR) في حوالي 110 ميللي ثانية بعد ومضة، وSTR سلبي (nSTR) في حوالي 220 ميللي ثانية (الشكلان 1 و 2). وأرج مع كبير B-موجة، قمم بين 50 إلى 100 ​​مللي ثانية بعد ظهور وميض المعتدل والتي يمكن تحليلها لاستجابة PII التابعة (الشكلان 1 و 2). في هذه الطاقة التحفيز، والسلبية على الموجة قبل الذروة لا يكاد يذكر. في الطاقات إشراقا مضيئة انحراف سلبي على بعد موجة تصبح أكثر بروزا والتي يمكن قياسها كميا مع استجابة PIII (الشكل 2). يظهر الموجي الرؤية الليلية VEP ردا سلبيا (P1N1، 15-70 نافذة مللي ثانية)، يليه انحراف إيجابي (N1P2، 30-100 ميللي ثانية) (الشكلان 3 و 4).

شكل 1
الشكل 1. المجموعة متوسط ​​أرج الطول الموجي. يغير وأرج مع زيادة كثافة التحفيز. الأرقام إلى يسار الموجي تشير إلى تعرض مضيئة تستخدم لانتزاع الموجي. لاحظ اتساع وزمنية مختلفة المقاييس لكل لوحة. في الطاقات مضيئة باهتة المكونات الإيجابية والسلبية للاستجابة عتبة ظلامية يمكن استنباط (pSTR، nSTR). كما الطاقات التحفيز الحصول على أكثر إشراقا، يمكن يعاير الاستجابة أ و ب الموجة، ونموذج يقترن فلاش يسمح للاستجابة مخروط إلى أن تقاس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

pload / 54158 / 54158fig2.jpg "/>
الشكل 2. أرج التحليل. (A) رود وظيفة مستقبلة للضوء يمكن يعاير باستخدام PIII لنموذج الموجة أ. A-موجات في cd.sm 1.22 و 1.52 سجل -2 (دوائر شاغرة، ○) وتناسب باعتبارها الفرقة مع PIII (خطوط رمادية، المعادلة 1) إلى 90٪ من الحد الأدنى الذي يعود رو PIII (السعة المشبعة، μV) S (حساسية، م 2 .cd -1 .S -3) والمعلمات الدفتيريا (توقيت تأخير، ميللي ثانية). (ب) رود وظيفة خلايا القطبين (يعني ± SEM) يمكن يعاير عبر الاقتداء استجابة سلسلة شدة PII قضيب (دوائر شاغرة ○) مع وظيفة ناكا-راشتون (خط رمادي). وهذا يعود V ماكس (السعة المشبعة، μV)، ك (1 / حساسية، سجل مؤتمر نزع السلاح خ -2) و n (المنحدر). ويعاير (C) الشبكية وظيفة الخلايا العقدية في الطاقات مضيئة قاتمة وكميا بواسطة pSTR السعة القصوى (pSTR أمبير) والتوقيت (pSTR ذلك (وأثارت D) المخروط وظيفة الخلية القطبين مع نموذج يقترن فلاش كميا بواسطة مخروط PII السعة القصوى (مخروط PII أمبير) والتوقيت (مخروط PII ذلك). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. المجموعة متوسط ​​VEP الطول الموجي. شكل الموجي VEP يغير مع زيادة الطاقة التحفيز. الأرقام إلى يسار الموجي تشير إلى تعرض مضيئة تستخدم لانتزاع الموجي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
فيقوإعادة 4. تحليل VEP وظيفة الاستجابة كثافة. (أ) تحليل السعة من VEP واعتباره القمة إلى القاع (P1N1) والحوض الصغير إلى الذروة (N1P2) سعة. الأوقات الضمنية (ذلك) من هذه الردود كما عاد (P1 ذلك، N1 ذلك، P2 ذلك). (ب) من السعة VEP P1N1 (يعني ± SEM) يزيد مع زيادة الطاقة التحفيز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وأرج وVEP هي مقاييس موضوعية من وظيفة البصرية من شبكية العين والقشرة، على التوالي. ميزة تسجيل في وقت واحد هو أن تتاح له نظرة أشمل للمسار البصري بأكمله. على وجه التحديد، يمكن للمعلومات تكميلية من تقييمهم المتزامنة توفر تحديد أوضح للموقع الإصابة في المسار البصري (على سبيل المثال، لاضطرابات مع تداخل أرج بعد متميزة VEP مظاهره 18، عندما الاعتلال العصبي البصري قد تتعايش مع ضمور الدماغ الأساسي 19، 20، أو عندما يمكن مرتبك فقدان VEP من مظاهر إصابات في عدة مواقع في المسار البصري 21،22). عن طريق قياس أرج وVEP في وقت واحد، وهو مؤشر الربح بين استجابة شبكية العين والقشرية ويمكن أيضا أن تستمد. قد توفر هذه أداة مفيدة للكشف عن التغيرات المرضية خفية. يسمح البروتوكول الحالي لقياس أرج وVEP في الفئران المختبرية المستخدمة عادة ولكن يمكن أن يكون بسهولة الإعلانيةapted إلى أنواع الثدييات الأخرى 23-25. أرج وVEP الطول الموجي من القوارض توفر بديل قبل السريرية معقول للاستجابة لوحظ في العين البشرية 26-28.

من خلال تصميم بروتوكول التحفيز محددة، ويمكن الحصول على كل من أرج وVEP استجابة خلال جلسة تسجيل واحدة. ويبين الجدول 1 تطورا في ضوء المستويات مع الاعتبار المناسب من الانتعاش مرة بين ومضات متتالية. يوفر هذا البروتوكول توازن بين الحاجة إلى تحقيق أقصى قدر من الخصائص إشارة إلى الضجيج والحد من وقت التسجيل ضمن إطار مخدر المقدمة من جرعة واحدة من الكيتامين: زيلازين. لذلك، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا لمقياس كمي موضوعي وظيفة البصرية للبحث في علم وظائف الأعضاء الأساسية والمرض.

تقييم شامل من النظام البصري يمكن أن يتحقق من خلال تقييم بالتزامن الردود الشبكية الثنائية والاستجابات القشرية أثار بصريا. ومع ذلك، يمكن أيضا أن تتم كل تقنية في عزلة وmonocularly بدلا من binocularly إلى تبسيط الإجراءات. يصف البروتوكول الحالي ظلامية أرج وVEP إشارات اختارت عزل قضيب مسار بالنظر إلى أن الفئران لها شبكية العين التي يسيطر عليها قضيب. إذا ضوء تكيف الاستجابات ذات أهمية أكبر للدراسة، فمن الممكن أيضا أن إجراء إشارات أرج وVEP فوتوبيك من قبل التأقلم مع ضوء الخلفية.

أحد أوجه القصور الرئيسية لهذا الأسلوب هو الحاجة إلى إجراء الإجراء في ظل ظروف مخدرة لتمكين مستقر وضع قطب كهربائي. ومع ذلك فإن هذا النهج خصائص قوية إشارة إلى الضوضاء تمكين الكشف عن التغيرات العلاج خفية.

نظرا لاتساع صغيرة من STR وحساسيتها للتكيف الضوء، يجب التقيد بشكل وثيق لضمان نجاح تسجيل هذه الاستجابة عدة خطوات. أولا، يحتاج كافية التكيف مع الظلام التي سيتم تنفيذها، والتي تشملبين عشية وضحاها التكيف مع الظلام (≥ 8 ساعات)، القطب ضعها تحت الحمراء الإضاءة الخافتة (17.4 cd.m -2، λ الحد الأقصى = 600 نانومتر)، والتكيف إعادة الظلام بعد قاتمة اختبار فلاش (10 دقيقة لل- 0.52 سجل مؤتمر نزع السلاح. ن خ -2). وعلاوة على ذلك، وخصائص إشارة إلى ضوضاء STR يمكن تحسينها عن طريق حساب متوسط ​​على إشارات متعددة (أي 20 الإشارات) التي تم جمعها مع فترات بين التحفيز قصيرة (أي 2 ثانية). واحدة من مزايا هذا التقييم الشامل لكلتا العينين والقشور هو تمكين بالمقارنة مع تسجيل المقابل 3. كما ينبغي أن تؤخذ هذه، عناية خاصة في صنع القطب (أي نفس الأقطاب الحجم والشكل)، لضمان الحد الأدنى المشترك بين العين وتقلبه بين القشرية.

وبالنظر إلى التوسع في استخدام التقنيات على حد سواء أرج وVEP أن تقدم في التدابير المجراة من مسار البصرية والعمليات المتعلقة بأمراض لها، سيكون من المفيد مقارنة الآخر مسار محدد عrotocols (على سبيل المثال، ON / OFF أو مخروط شبه نوع معين)، وأداء في وقت واحد تسجيلات أرج / VEP مع طرائق التحفيز المختلفة (على سبيل المثال، وميض، ونمط سن المنشار) لتوسيع نطاق تطبيق هذه التقنية في التشخيص السريري. سيكون خطوة منطقية أخرى من هذا التطبيق في المستقبل سيكون أيضا لتسجيل أرج وVEP في نفس الوقت من واعيا 29، تتحرك بحرية الحيوانات لتجنب التأثيرات المخدرة على فسيولوجيا العصبية 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alligator clip generic brand HM3022 Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables
Bioamplifier ADInstruments ML 135 For amplifying ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Allergan CAS 0009000-11-7 Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode
Carprofen 0.5% Pfizer Animal Health Group CAS 53716-49-7 Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline
Chlorhexadine 0.5% Orion Laboratories 27411, 80085 For disinfecting surgical instruments
Circulating water bath Lauda-Königshoffen MGW Lauda For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings
Dental amalgam DeguDent GmbH 64020024 For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust
Dental burr Storz Instruments, Bausch and Lomb #E0824A A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill Bosch Dremel 300 series An automatic drill for trepanning
Electrode lead Grass Telefactor  F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier
Faraday Cage custom-made Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio
Gauze swabs Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100B For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery
Ganzfeld integrating sphere Photometric Solutions International Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Velcro VELCRO Australia Pty Ltd VELCRO Brand Reusable Wrap Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform
Isoflurane 99.9% Abbott Australasia Pty Ltd CAS 26675-46-7 Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Ketamine  Troy Laboratories Ilium Ketamil Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording
Luxeon LEDs Phillips Lighting Co. For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the ERG active electrode during recordings
Needle electrode Grass Telefactor  F-E2-30 Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP
Phenylephrine 2.5% minims  Bausch and Lomb CAS 61-76-7 Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording
Povidone iodine 10% Sanofi-Aventis CAS 25655-41-8 Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML 785 Controls the LEDs
Proxymetacaine 0.5% Alcon Laboratories  CAS 5875-06-9 For corneal anaesthesia during ERG recordings
Saline solution Gelflex Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode
Stainless streel screws  MicroFasterners 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes
Stereotaxic frame David Kopf Model 900 A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates
Surgical blade Swann-Morton Ltd. 0206 For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes
Suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery
Tobramycine eye ointment 0.3% Alcon Laboratories  CAS 32986-56-4 Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery
Tropicamide 0.5% Alcon Laboratories  CAS 1508-75-4 Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording
Xylazine Troy Laboratories Ilium Xylazil-100 Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording
Pipette tip Eppendorf Pty Ltd 0030 073.169 Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 spreadsheet software for data analysis
Lethabarb Euthanazia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd LETHA450 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
  2. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
  3. Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
  4. Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
  5. Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
  6. Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
  7. Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
  8. Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
  9. Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
  10. Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
  11. Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
  12. Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
  13. Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
  14. Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
  15. Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
  16. Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
  18. Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
  19. Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
  20. Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
  21. Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
  22. Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
  23. Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
  24. Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
  25. Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
  26. Robson, J. G., Frishman, L. J. Dissecting the dark-adapted electroretinogram. Doc Ophthalmol. 95, 187-215 (1998).
  27. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
  28. Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
  29. Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
  30. Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).

Tags

علم الأعصاب، العدد 113، مخطط كهربية، البصرية إمكانات أثار، تخطيط كهربية الشبكية، الكهربية، استجابة أثار البصرية، وظيفة شبكية العين، وظيفة العصب البصري
تسجيل وقت واحد من تخطيط كهربية الشبكية والإمكانيات البصرية مستدعى في الفئران تخدير
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, C. T., Tsai, T. I., He, Z.,… More

Nguyen, C. T., Tsai, T. I., He, Z., Vingrys, A. J., Lee, P. Y., Bui, B. V. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp. (113), e54158, doi:10.3791/54158 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter