Introduction
Meting van de electroretinogram (ERG) en visuele evoked potential (VEP) bruikbare kwantitatieve beoordeling van de integriteit van de visuele route. De ERG meet de elektrische respons van het netvlies lichtstimulatiebron, terwijl de VEP meet de overeenkomstige functionele integriteit van de visuele trajecten van de retina naar de primaire visuele cortex na hetzelfde licht event. Dit manuscript beschrijft een protocol voor de registratie en analyse van de ERG en VEP reacties in een algemeen gebruikt laboratorium model, de rat.
De ERG biedt een index van de functionele integriteit van een aantal belangrijke retinale cel klassen door het kwantificeren van de bruto elektrische reactie van de retina om een lichtflits. Een gecoördineerde reeks ionische fluxen gestart door het aanzetten van licht en offset, detecteerbare veranderingen in de spanning die kan worden gemeten met behulp van oppervlakte-elektroden buiten het oog geplaatst. De resulterende golfvorm vertegenwoordigt de combinatie van een SERies van goed gedefinieerde componenten, die verschillen in amplitude, timing en frequentie. Een aanzienlijke hoeveelheid onderzoek is gebleken dat deze onderdelen relatief goed geconserveerd zijn over vele gewervelde retina en de componenten kunnen worden gescheiden van elkaar. Door oordeelkundig selecteren van de stimulus (flash stimulus, achtergrond, interstimulus interval) voorwaarden en de keuze van de specifieke kenmerken van de samengestelde golfvorm te analyseren kan men overtuigd van het terugsturen van een maatregel van een specifieke groep van retinale cellen 1,2 zijn. Deze kenmerken ten grondslag aan de bruikbaarheid en daarmee de wijdverspreide toepassing van de ERG als een niet-invasief meten van retina functie. Dit handschrift is gericht op de methode voor het meten van de ERG en de analyse van de mogelijkheden ervan om informatie terug te keren over een aantal van de grote mobiele klassen in het netvlies, namelijk fotoreceptoren (de PIII component), bipolaire cellen (de PII component) en retinale ganglion cellen (de positieve scotopisch drempel reactie of pstr).
3. Bij knaagdieren, de meerderheid (90-95%) van de optische zenuwvezels van elk oog kruisvormige 4 en innerveren de contralaterale midden hersenen. In tegenstelling tot de ERG, is het nog niet mogelijk verschillende componenten van de VEP toeschrijven aan specifieke klassen cellen, 5 verandert dus overal langs de gezichtsbaan kunnen hebben voor de VEP golfvorm. Toch is de VEP een nuttige niet-invasief meten van visuele prestatie en gezichtsbaan integriteit. De VEP, bij gebruik in combinatie met de ERG, kan een volledige beoordeling van de visuele systeem (bijv retina / gezichtsbaan) verschaffen.
ERG en VEP opnamen kan worden uitgevoerd of in combinatie, afhankelijk van de toekation. De in dit document beschreven methode maakt gelijktijdige evaluatie van het netvlies en corticale visuele opgeroepen elektrofysiologie van beide ogen en beide halfronden in verdoofde ratten. Dit is een handige manier om de retinale functie en de upstream-effecten die veranderingen in de functie van de retina op de visuele opgeroepen corticale functie kan hebben meer uitvoerig te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Australische Code of Practice voor de zorg en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden, uitgevoerd door de National Health en Medical Research Council in Australië te stellen. Ethiek goedkeuring werd verkregen van de Universiteit van Melbourne, FNWI, Animal Ethics Committee (erkenningsnummer 0.911.322,1).
1. Pre-implantatie van chronische VEP elektroden
Opmerking: Als gelijktijdige ERG en VEP signalen worden verzameld dieren moeten operatief worden geïmplanteerd VEP elektroden ten minste 1 week vóór de winning signaal.
- Steriliseer de chirurgische bank vóór experimenten door reiniging met chloorhexidine (0,5% in 70% ethanol). Autoclaaf alle chirurgische apparatuur voor gebruik. Bedek het dier een gesteriliseerd chirurgische doek. Zorg ervoor dat alle onderzoekers dragen chirurgische maskers, jassen en gesteriliseerde handschoenen.
- Induceren anesthesie met 3-3,5% isofluraan met O2 met een stroomsnelheid van 3 l / min. Handhaaf anesthesia 1.5% en 2 l / min gedurende de operatie. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de poot pinch reflex.
- Toepassen 1% natriumcarboxymethylcellulose op het hoornvlies om uitdroging van de ogen te voorkomen.
- Scheren een 30 mm x 30 mm ruimte boven het voorhoofd, posterieur van de ogen en anterior aan de oren.
- Plaats dier op een warmte-pad (37 ° C) om de lichaamstemperatuur te handhaven en stabiliseren van het hoofd van de dieren met een stereotaxische frame.
- Ontsmet het geschoren gebied met 10% driemaal povidonjood. Vermijd het gebruik van alcohol op basis van ontsmettingsmiddelen voor in de buurt van het oog, die in overeenstemming met de Standard of Practice door de Vereniging van Chirurgische Technologen uiteengezet.
- Maak een mediaan-sagittale incisie op het hoofd met een scalpel en uit deze accijnzen een ~ 20 mm cirkel met een diameter van huidweefsel aan de schedelbot bloot te leggen.
- Verwijder onderliggende periost door schrapen en drogen met gaas om de coronale en sagittale schedelnaden bloot te leggen.
- Onsing een tandheelkundige braam bevestigd aan een boor, trepaneren twee gaten (0,7 mm diameter, diepte ~ 1 mm) door de schedel op beide hersenhelften aan de stereotaxische coördinaten: 7 mm caudaal bregma, 3 mm lateraal van middellijn.
- Schroef in roestvrij stalen schroeven (diameter 0,7 mm, lengte 3 mm, gesteriliseerd met chloorhexidine) in de twee vooraf gemaakte gaten tot een diepte van ~ 1 mm (2 mm schroef blootgesteld) om vaste verankering mogelijk. Dit contact met de dura zonder beschadiging van het onderliggende weefsel corticale.
- Bereid chirurgische gebied voor amalgaam door het drogen van het schedelbot met gaas, en het terugtrekken van losse huid met twee 3-0 hechtingen bij ~ 4 en 8:00.
- Verspreid amalgaamvullingen over de blootliggende schedel om de schroef elektroden (roestvrij stalen schroeven in stap 1.10 beschreven) vast te zetten. Zorg ervoor ~ 1.5 mm van de schroeven blootgesteld blijven voor opname.
- Verwijder het terugtrekken hechtingen.
- Injecteer 0,5% carprofen subcutaan (5 mg / kg) voor analgesie en zoutoplossing (0,9% natriumchloride, 10,5 ml) subcutaan voor vloeistof vervanging.
- Laat dier te herstellen in aparte kooien. Niet dier onbeheerd achter, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven.
- Do dier niet terug naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld van een operatie (minimaal 5 dagen).
- Blijven toedienen 0,5% carprofen subcutaan analgesie (5 mg / kg) eenmaal per dag gedurende 4 dagen.
- Record ERG en VEP 1 week na de operatie.
2. ERG en VEP Recording
- Het verzamelen van gegevens voorbereiding
- Gebruik de computer software om gelijktijdig triggeren stimulus en het verwerven van data 2 volgens de onderstaande instellingen aanbevolen.
- Versterken de signalen 3 (ERG: × 1000, VEP: X10.000) de versterking inwendig door een geïsoleerde voorversterker en versterker set, en met beide ogen gematched voor impedantie.
- Stel sampling rate voor de ERG tot 4 kHz over een 650msec opname venster (2560 punten), Om dit te doen, klikt u op het tabblad voor "time basis" in de data-acquisitie software (voor de naam en de versie van de software zie tabel voor Materiaalonderzoek), selecteer "2560" voor Samples, en "500 ms" voor de tijd die een 650 msec opname venster terug te keren.
- Gebruik dezelfde methode om de sampling rate van de VEP ingesteld op 10 kHz over een 250 msec tijdperk. Laat een 10 msec pre-stimulus uitgangswaarde voor zowel de ERG en VEP opnames. Om dit te doen, klikt u op het tabblad "Setup"; selecteer "Stimulator" om een nieuwe dialoog venster te brengen; in dat venster selecteren "puls" uit de keuzelijst voor "Mode"; en stel de waarde voor de "vertraging" tot "10 ms".
- Set ERG band-doorlaatfilter om 0,3 - 1000 Hz (- 3 dB). Dit wordt gedaan door te klikken op "Bio Amplifier" in de data-acquisitie software. Stel vervolgens de waarde voor "High Pass" naar "0.3Hz", en de waarde voor "low pass" naar "1 kHz".
- Met behulp van de hierboven genoemde methode 2.1.1.3, stelt VEP band-pass-instellingen om 0,1-100 Hz (- 3 dB) zoals aanbevolen door de International Society for Clinical Elektrofysiologie van Vision (ISCEV) voor menselijke VEP opnames 6.
- Gebruik de computer software om gelijktijdig triggeren stimulus en het verwerven van data 2 volgens de onderstaande instellingen aanbevolen.
- elektrode voorbereiding
- Op maat maken van de ERG actief / inactief en VEP actief / inactief elektroden door het aanbrengen van zilver draad of een alligator clip om een elektrode lood, respectievelijk 2. In de handel te verkrijgen aardelektrode.
- Voor de 4-maat gemaakte elektroden, snijd het mannelijke uiteinde van de elektrode lood extensie. Verwijder 1 cm van de buitenste isolerende laag polytetrafluorethyleen met een scalpel waarborgen van de binnenste draad niet beschadigd.
- Pre-mode de ERG inactieve elektroden door het snijden van een 70 mm lengte van zilverdraad (0,3 mm dikte) en een lus vormt ~ 8 mm in diameter tot de rat oog omringen. Bereid een uniform cirkel door het vormen van de lus op een 1 ml pipet tip.
- Pre-mode de ERG actieve elektroden door het snijden van een 30 mm lengte van zilverdraad en de vorming van een kleine lus om voorzichtig contact op met de rat cornea (~ 1-2 mm in diameter)
- Stevig hechten elektroden (2 ERG actief, 2 ERG inactief, 1 VEP actief) om de elektrode onder leiding van een mix van het zilver met de blootgestelde binnenste draad.
- Isoleer overmaat blootgestelde metalen met plakband aan fotovoltaïsche artefacten te verminderen.
- Op de ERG inactieve elektroden plakken een klein stukje van haak-en-lus sluiting (~ 5 mm x 20 mm) om de afplakband om een stabiele bevestiging aan het knaagdier nekband mogelijk te maken.
- Hechten alligator clip aan de binnenste draad van de elektrode leidt tot de VEP actieve elektroden te maken.
- Vóór opnamen, galvanisch de blootgestelde oppervlakken van de zilveren draden (dwz de inactieve ring en active tip) met chloride met een 9 V DC bron voor 20 sec om het signaal geleiding te verbeteren.
- Om dit te doen, dompel de zilveren punt van de ERG elektrodedraad (optredend als de anode van een primaire cel) in de normale zoutoplossing; sluit het andere uiteinde van deze elektrode draad aan op de positieve aansluiting van een 9 V batterij.
- Sluit de andere draad (de kathode) naar de negatieve pool van de accu, en dompel het andere uiteinde in een zoutoplossing ook. Koppel na 20 sec en observeer de lont topje van de ERG elektrodedraad gelijkmatig worden gecoat in de kleur wit.
Opmerking: Bereid nieuwe ERG elektroden voor elke experimentele sessie (~ tot 8 uur) om openheid van het chloride coating garanderen.
- Toebereiding van dieren
- Dark-passen de dieren 's nachts (≥ 8 uur) voorafgaand aan de opnames in een lichte strakke kamer. Zorgen voor maximale aanpassing aan het donker door het uitschakelen van de kamer lichten, sluiten alle deuren en rolluiken. Minimaliseren lichte lekkage door het plaatsen van licht-proof materiaal rondkruispunten van de deuren / ramen en plaatsing computerschermen buiten dikke zwarte gordijnen.
- Voeren dier preparaat in een donkere kamer met behulp van dim red-light emitting diode (LED; 17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm) op staaf gevoeligheid behouden.
- Verdoven rat door het injecteren van ketamine / xylazine (60: 5 mg / kg) intramusculair. Bevestig voldoende diepte van de anesthesie door het ontbreken van een poot snuifje reflex.
- Sedatie behouden toedienen Een hoeveelheid verdoving (50% van de aanvangsdosis) na 50 min indien nodig.
- Voor meer actueel verdoving toe te passen één daling van 0,5% proxymetacaïne naar elk oog, en knipperen overtollige vloeistof.
- Voor pupilverwijding gelden één druppel 0,5% tropicamide naar elk oog, dan droogt het overtollige vocht.
- ERG en VEP electrode positionering
- Plaats dier op het platform ERG voor de Ganzfeld kom zich in de kooi van Faraday. Vermijd het gebruik van een elektrische verwarming pad, zoals het cEen introduceren elektrische ruis in de elektrofysiologische opnames. Opmerking: Het platform wordt een gecirculeerd verwarmd water platform bevestigd aan lichaamstemperatuur te handhaven.
- Secure dier naar platform met een strook van haak-en-lus sluiting stevig maar niet geplaatst strak om de nek.
- Haak de inactieve VEP elektrode rond bodem snijtanden van verdoofde rat.
- Plaats de ERG inactieve elektroden door rond de sclerale ring non-invasief rond de evenaar van het oog. Stabiliseren dit door het aanbrengen van de elektroden aan de haak-en-lus sluiting strip rond de nek. Herhaal dit voor de contralaterale oog.
- Fasten VEP actieve elektroden door het aanbrengen van alligator clips roestvrij-stalen schroeven vooraf ingeplant op de schedel.
- Plaats een kleine druppel 1% natriumcarboxymethylcellulose op hoornvlies vóór plaatsing van de ERG actieve elektrode signaalkwaliteit verbeteren. Opmerking: De viscose vloeistof helpt ook te behouden hoornvlies hydratatie hele experimenteren met minimaliseren de vorming van verdroging-type cataract bij knaagdieren 7.
- Plaats een kleine daling van 1% natriumcarboxymethylcellulose op de onderste snijtanden om contact van de VEP inactieve elektrode te verbeteren en zo het signaal kwaliteit.
- Plaats de ERG actieve elektroden naar het centrale hoornvlies lichtjes aan te raken met behulp van een micromanipulator bevestigd aan een custom-built stereotaxische arm.
- Plaats 2-5 mm van de grond naald elektrode (roestvrij staal) subcutaan in de staart.
- Indien nodig drogen het overtollige vocht uit de onderste ooglid voorafgaand aan de opname om het signaal te verbeteren.
- Slide platform dichter bij de Ganzfeld bowl zorgen voor de ogen van het dier af te stemmen met de opening van de kom om gelijkmatige verlichting van beide netvliezen mogelijk te maken (zie stap 2.4.1).
- Sluit de kooi van Faraday om externe ruis te verminderen.
- Het verzamelen van gegevens
- Gebruik een dim-test-flash (- 0,52 log cd.sm -2) om te beoordelen of de elektrode placement is voldoende 2. Onder controle omstandigheden zou dit leiden tot een amplitude van ERG ~ 800 mV en een inter-oog variabiliteit van niet meer dan 10%. Indien nodig herpositioneren elektroden.
- Naar aanleiding van de test-flash toestaan dat dieren naar donker-aan te passen voor 10 min in volledige duisternis voorafgaand aan de opname.
- Present lichtflitsen stimuli met behulp van een Ganzfeld kom, terwijl het verzamelen van ERG en VEP signaleert tegelijkertijd over een ~ 500 msec time-venster. Voortgang van dimmer aan het licht niveaus helderder om voldoende dark-aanpassing voor bepaalde golfvormen te handhaven.
- Verzamel signalen over een reeks lichtgevende energie ontlokken STR, b-wave en a / b-golf golfvormen van de ERG. Gemiddeld meer signalen op de dimmer lichtniveaus (20 herhalingen) en minder bij de heldere lichtgevende energieën (1 herhaling). Geleidelijk aan het verlengen van de inter-stimulus interval 1-180 sec van zwakste naar de helderste lichtniveau. Zie tabel 1 voor een voorbeeld protocol.
- isolaat de ERG staafjes en kegeltjes reacties, maken gebruik van een gepaarde-flash paradigma 8. Initiëren vier knippert met 1,52 log cd.sm -2 met een 500 msec inter-stimulus interval 2 tussenin. Digitaal aftrekken van de conus golfvorm (3e of 4e flash) uit de gemengde golfvorm (1 st flash) naar de vermeende stang reactie af te leiden.
- Om VEP signalen, gemiddeld 20 herhalingen op te nemen met de heldere lichtgevende energieën (dat wil zeggen, - 0,52-1,52 log cd.sm -2, 5 sec inter-stimulus interval). Merk op dat de eerste flits in deze volgorde de conventionele donker aangepaste ERG respons terug.
- Toestaan 1-3 min om opnieuw na aanpassing (20) VEP veegt voordat de volgende helderder ERG stap, afhankelijk van de lichtenergie.
- Na voltooiing van het verzamelen van gegevens, euthanaseren de verdoofde dier met intracardiale injectie van pentobarbital natrium (325 mg / ml, 3 ml).
| waveform | Stimulus lichtenergie (log cd.sm -2) | Aantal herhalingen | interstimulus interval (sec) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5,6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Rod b-golf | -4,99 | 10 | 2 |
| Rod b-golf | -4,55 | 10 | 2 |
| Rod b-golf | -4,06 | 5 | 5 |
| Rod b-golf | -3,51 | 5 | 5 |
| Rod b-golf | -3,03 | 1 | 15 |
| Rod b-golf | -2,6 | 1 | 15 |
| Rod b-golf | -1,98 | 1 | 15 |
| Mixed a- / b-wave | -1,38 | 1 | 30 |
| Mixed a- / b-wave | -0,94 | 1 | 30 |
| Flash 1: Mixed a- / b-golf Gemiddelde van 20: VEP | -0,52 | 20 | 5 |
| (90 sec voor de volgende) | |||
| Flash 1: Mixed a- / b-golf Gemiddelde van 20: VEP | 0.04 | 20 | 5 |
| (120 sec voor de volgende) | |||
| Flash 1: Mixed a- / b-golf Gemiddelde van 20: VEP | 0.58 | 20 | 5 |
| (180 sec voor de volgende) | |||
| Flash 1: Mixed a- / b-golf Gemiddelde van 20: VEP | 1.2 | 20 | 5 |
| (180 sec voor de volgende) | |||
| Flash 1: Mixed a- / b-golf Gemiddelde van 20: VEP | 1.52 | 20 | 5 |
| (180 sec voor de volgende) | |||
| Cone a- / b-wave | 1.52 | 4 | 0.5 |
Tabel 1. ERG en VEP opnemen Protocol Met een bereik van Stimulus Energy. Stimulus presentaties voortgang van dim (boven) tot helder (onder) knippert, met voldoende inter-stimulus interval tot donker aanpassing te verzekeren. Eind protocol wordt herhaald vier flitsen met korte interval voorgelegd aan de kegel gemedieerde respons op te wekken.
3. Analyse van ERG Waveforms
Opmerking: ERG en VEP analyse is eerder in detail beschreven 3,9,10 The.volgende paragrafen geven een kort overzicht.
- Export signalen in digitale voltage-time formaat naar een spreadsheet-software voor data-analyse.
- Rod photoreceptoral functie
- Model de voorrand van een golf PIII met vertraagde Gaussische (Vergelijking 1) 11.
PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- i ∙ S (t - t d) 2)] voor t> t d (Vergelijking 1) - Optimaliseer de pasvorm over een ensemble van twee helderste lichtgevende energieën 12,13 (dat wil zeggen, 1,22 en 1,52 log cd.sm -2).
- Model tot 90% van de a-golf amplitude naar post-receptoral inbraken 14 vermijden.
Opmerking: Het model geeft de verzadigde amplitude (Rom PIII, mV), gevoeligheid (S, m 2 .cd -1 .s -3) en vertraging (t d, msec) van de photoreceptoral respons.
- Model de voorrand van een golf PIII met vertraagde Gaussische (Vergelijking 1) 11.
- Rod bipolaire cel function
- Digitaal trek de PIII model (zie hierboven) uit de gemengde golfvormen gemengde PII keren met overliggende oscillerende potentialen.
- Om de stang PII uit de gemengde PII halen, digitaal de conus respons (3e of 4e flash op 1,52 log cd.sm -2) van de gemengde PII aftrekken (1 st flash op 1,52 log cd.sm -2).
- Breng daarna een laagdoorlaatfilter de golfvorm (46,9 Hz, -3 dB, Blackman venster) om oscillerende potentialen verwijderen. De resterende stroom is de stang 10 PII respons.
- Pak de stang PII piekamplitude en plot tegen alle stimulus intensiteiten (hieronder -2 log cd.sm -2 en rod-geïsoleerd PII op 1,52 log cd.sm -2) 10.
- Modelleren deze gegevens met een hyperbolische functie (vergelijking 2), die een maat binnenste retinale celintegriteit biedt.
V (i) = Vmax (i n / (n iK + n)) (Vergelijking 2)
Opmerking: Deze vergelijking PII maximale respons (Vmax, uV), 1 / gevoeligheid geeft (k, log cd.sm-2) en de helling van de functie (n) 15.
- Kegel bipolaire celfunctie
Let op: Als de kegel reactie op een enkele intensiteit wordt genomen (1,52 log cd.sm -2) de amplitude en timing worden opnieuw ingesteld op dit lichtniveau.- Extract maximale kegel PII reactie 2,16.
- Extract impliciete tijd waarop deze maximale respons overeenkomt 2,16.
- Ganglion celfunctie
- Aangezien de STR is een klein signaal, breng dan een laagdoorlaatfilter met 50 Hz inkeping te golfvorm van hoogfrequente ruis en elimineren (46,9 Hz, -3 dB, Blackman venster).
- Extract maximale pstr reactie 3,17.
- Extract impliciete tijd waarop deze maximale respons overeenkomt 3,17.
4. Analysis van VEP Waveforms
- Extract maximale en minimale componenten van het VEP (P1, N1 en P2). Voor detail zie referenties 3,6.
- Express amplitudes als dal-tot-piek amplitudes uit hun vorige piek of dal (P1N1 en N1P2) 3,6.
- Extract impliciete keer (it) waarop deze maximale respons overeenkomt (P1 het, N1 is, P2 is) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ERG a-wave (> -1,38 log cd.sm -2), b-golven (> - 4,99 log cd.sm -2) STR's (<- 4,99 log cd.sm -2) en de VEP (> - 0,52 log cd.sm -2) gelijktijdig (figuur 1 en 3 opgenomen). Bij zeer zwak knippert, wordt een positieve STR (pstr) waargenomen bij ongeveer 110 msec na de flits, en een negatieve STR (NSTR) bij ongeveer 220 msec (figuren 1 en 2). Een ERG met een grote b-golf, pieken tussen 50 tot 100 msec na het begin van een matige flash wat kan worden geanalyseerd op PII reactie (figuren 1 en 2). Op dit stimulus energie, de negatieve een golf voordat de piek is te verwaarlozen. Bij helderder lichtgevende energie de negatieve deflectie een golf wordt prominenter die kan worden gekwantificeerd met PIII respons (Figuur 2). De scotopisch VEP golfvorm toont een negatief antwoord (P1N1; 15-70 msec venster), gevolgd door een positieve vervorming (N1P2; 30-100 msec) (figuren 3 en 4).
Figuur 1. Group Gemiddelde ERG Waveforms. De ERG verandert met toenemende stimulus intensiteit. Getallen links van de golfvorm geven lichtgevende belichting gebruikt om de golfvorm te wekken. Let op de verschillende amplitude en termijnen voor elk paneel. Bij dimmer lichtgevende energieën de positieve en negatieve componenten van de scotopische drempel respons kan worden opgewekt (pstr, NSTR). Als stimulans energieën helderder, kan de A- en B-wave respons worden getest, en een gepaarde-flash paradigma kan de conus respons te meten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Pbelasting / 54158 / 54158fig2.jpg "/>
Figuur 2. ERG analyse. (A) Rod fotoreceptor functie kan worden bepaald door een PIII het a-golfmodel. A-golven bij 1,22 en 1,52 log cd.sm -2 (ongevuld cirkels, ○) zijn fit als een ensemble met een PIII (grijze lijnen, vergelijking 1) tot 90% van het minimum dat Rm PIII terugkeert (verzadigd amplitude, mV) S (gevoeligheid, m 2 .cd -1 .s -3) en td (timing vertraging msec) parameters. (B) Rod bipolaire celfunctie (gemiddelde ± SEM) kan worden getest door het modelleren van de intensiteit reactie reeks van de staaf PII (ongevulde cirkels ○) met een Naka-Rushton functie (grijze lijn). Dit geeft V max (verzadigd amplitude, mV), k (1 / gevoeligheid, log cd sm -2) en n (helling). (C) Retinal ganglion cel functie wordt getest bij dim lichtgevende energieën en gekwantificeerd door pstr piek amplitude (pstr amp) en timing (pstr is (D) Cone bipolaire cel functie wordt opgewekt met een gekoppelde-flash paradigma gekwantificeerd door kegel PII piek amplitude (kegel PII amp) en timing (cone PII het). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Group Gemiddelde VEP Waveforms. De vorm van de VEP golfvorm verandert met toenemende stimulus energie. Getallen aan de linkerkant van de golfvorm geven de lichtgevende blootstelling gebruikt om de golfvorm te lokken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figure 4. VEP Analyse en Intensity Response Function. (A) Amplitude analyse van de VEP wordt genomen als piek tot dal (P1N1) en trog tot piek (N1P2) amplitudes. De impliciete keer (it) van deze reacties wordt ook geretourneerd (P1 het, N1 is, P2 is). (B) de VEP P1N1 amplitude (gemiddelde ± SEM) toe met toenemende stimulus energie. Klik hier om een grotere versie te bekijken dit figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ERG en VEP objectieve metingen van de visuele functie van het netvlies en de cortex, respectievelijk. Het voordeel van gelijktijdige opname is dat een meer uitgebreid overzicht van het gehele visuele route wordt geboden. Daarbij zouden de aanvullende informatie van de samenlopende beoordeling een duidelijker afbakening van de plaats van letsel te voorzien in de visuele banen (bijvoorbeeld bij aandoeningen met overlappende Nog ERG afzonderlijke VEP manifestaties 18, wanneer optische neuropathie kan samengaan met primaire cerebrale atrofie 19, 20, of wanneer VEP verlies kan worden verstoord door manifestatie van blessures op diverse locaties in de visuele traject 21,22). Door meting van de ERG en VEP tegelijkertijd een index van de versterking tussen netvlies en corticale respons worden verkregen. Dit kan een nuttig instrument zijn om subtiele pathologische veranderingen te detecteren. Het huidige protocol zorgt voor ERG en VEP metingen in veelgebruikte laboratoriumratten maar kan gemakkelijk worden adApted andere zoogdiersoorten 23-25. ERG en VEP golfvormen van knaagdieren een redelijke preklinische surrogaat voor reacties waargenomen in menselijke ogen 26-28.
Door het ontwerpen van een specifieke stimulus protocol, kan zowel ERG en VEP reactie worden verkregen tijdens een opnamesessie. Tabel 1 toont een progressie in lichtniveaus met de nodige aandacht van de hersteltijd tussen opeenvolgende flitsen. Dit protocol verschaft een evenwicht tussen de noodzaak om het signaal-ruis karakteristieken optimaliseren en opnametijd binnen de narcose openen vanuit een enkele dosis ketamine beperken: xylazine. Daarom kan deze techniek nuttig zijn voor een objectieve kwantitatieve meting van de visuele functie voor onderzoek naar elementaire fysiologie en ziekte.
Een uitgebreide evaluatie van het visuele systeem kan worden bereikt door gelijktijdig de beoordeling van bilaterale retinale reacties en visueel opgeroepen corticale reacties. Echter, elke techniek ook worden uitgevoerd in isolatie en monoculair in plaats van binoculair om de procedure te vereenvoudigen. Het huidige protocol beschrijft scotopische ERG en VEP signalen gekozen om de staaf-pad te isoleren omdat ratten hebben een-rod gedomineerde netvlies. Als licht aangepaste antwoorden van groter belang voor de studie, is het ook mogelijk om fotopisch ERG en VEP signalen uit door pre-aanpassing aan een achtergrondlicht.
Een belangrijke beperking van deze techniek is de noodzaak de procedure te voeren onder omstandigheden verdoofd stabiele plaatsing van de elektroden mogelijk. Toch is deze aanpak biedt krachtige signaal-ruis kenmerken waardoor detectie van subtiele veranderingen behandeling.
Vanwege de kleine amplitude van de STR en lichtgevoeligheid aanpassing moeten verschillende stappen nauwkeurig worden waargenomen opname op deze reactie. In de eerste plaats voldoende donker aanpassing moet worden uitgevoerd, waaronder's nachts donker aanpassing (≥ 8 uur), plaatsing van de elektroden onder gedimd rood licht (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm), en re-dark aanpassing na een dim-test-flash (10 min voor - 0,52 log cd. sm -2). Bovendien kan de signaal-ruis kenmerken van de STR worden verbeterd door het middelen over meerdere signalen (dat wil zeggen 20 signalen) verzameld met korte inter-stimulus intervallen (dus 2 sec). Een van de voordelen van deze uitgebreide beoordeling van beide ogen en cortex is vergeleken met de contralaterale opname 3 mogelijk. Als zodanig bijzondere zorg moeten worden genomen in de elektrode te maken (dat wil zeggen, dezelfde grootte en de vorm van de elektroden), minimale inter-eye en inter-corticale variabiliteit te garanderen.
Gezien de uitgebreide gebruik van zowel ERG en VEP technieken te voorzien in vivo metingen van het gezichtsbaan en ziekte processen, zou het nuttig zijn om andere route-specifieke p sorterenrotocols (bv, ON / OFF of cone subtype specifiek), en het uitvoeren van gelijktijdige ERG / VEP opnamen met verschillende stimulus modaliteiten (bv, flikkeren, patroon, zaagtand) de toepassing van deze techniek in de klinische diagnoses uit te breiden. Een andere logische stap van deze applicatie in de toekomst zou ook zijn om de ERG en VEP gelijktijdig opnemen van bewuste 29, vrij bewegende dieren verdoving invloeden op neurale fysiologie 30 vermijden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J.
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
