Introduction
전위도 (ERG) 및 시각 유발 전위 (VEP)의 측정은 시각 경로의 무결성의 유용한 정량적 평가를 제공합니다. VEP이 같은 빛 이벤트 다음 차 시각 피질에 망막에서 시각 경로의 해당 기능 무결성을 측정하면서 ERG는 빛 자극에 망막의 전기 반응을 측정한다. 이 원고는 일반적으로 사용되는 실험실 모델 쥐의 기록 및 ERG와 VEP 응답의 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.
르 빛의 플래시에 망막의 총 전기 반응을 정량화하여 키 망막 세포 클래스의 숫자의 기능 무결성의 인덱스를 제공합니다. 이온 플럭스의 조율 된 일련의 광 개시에 의해 시작 오프셋, 눈의 외부 표면에 배치 된 전극을 사용하여 측정 할 수있는 전압 검출 가능한 변화를 생성한다. 얻어진 파형은 자체의 조합을 나타내는진폭, 타이밍 및 주파수의 다른 잘 정의 된 컴포넌트 RIES. 연구의 실질적인 몸체는 이러한 성분이 비교적 많은 척추 동물 망막 통해 상기 구성 요소가 서로로부터 분리 될 수 있다는 것을 잘 보존되어 있는지 보여 주었다. 적절하게 자극 (플래시 자극, 배경, interstimulus 간격) 조건을 선택하고 분석하는 복합 파형의 특정 기능을 선택하여 하나의 망막 세포 1,2의 특정 그룹의 측정 값을 반환 확신 할 수 있습니다. 이러한 특성은 유틸리티 따라서 망막 기능의 비 침습적 척도로서 ERG의 광범위한 애플리케이션을 기초. 이 원고는 (긍정적를 ERG을 측정하고 망막의 주요 세포 종류, 즉 광 수용체합니다 (PIII 구성 요소), 양극성 세포 (개인 식별 구성 요소) 및 망막 신경절 세포의 일부에 대한 정보를 반환하는 데 그 특징을 분석하는 방법론에 초점을 맞추고 암순응 임계 응답 또는 pSTR).
3의 영역 V1에 시신경, 시신경 기관, 시상 (측면 geniculate 핵, LGN) 및 광섬유 방사선을 통해 직렬 통신. 설치류에서, 다수 - 각 눈 decussate 4에서 시신경 섬유 (90-95 %)과는 반대측의 중간 뇌에 분포. 르 달리 5 따라서 시각적 통로가 VEP 파형에 영향을 미칠 수있는 어느 곳 따라 변경 특정 세포 종류에 VEP의 다른 구성 요소를 돌리는 아직 가능하지 않다. 그럼에도 불구하고, VEP 시각적 성능 및 시각적 경로 무결성 유용한 비 - 침습적 측정은이다. VEP는 ERG와 함께 사용될 때, 시각 시스템 (즉, 망막 / 시각 경로)의보다 완전한 평가를 제공 할 수있다.
ERG 및 VEP 녹화는 애플리에 따라 단독으로 또는 조합하여 실시 할 수있다양이온. 이 문서에서 설명하는 방법은 망막과 대뇌 피질의 시각 유발 양쪽 눈에서 전기 생리학 및 마취 쥐의 두 반구의 동시 평가를 할 수 있습니다. 이것은 더 포괄적으로 망막 기능의 변화가 시각 유발 대뇌 피질의 기능에 미칠 수있는 망막 기능과 상류 효과를 평가하는 유용한 방법입니다.
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Protocol
모든 실험 절차는 호주 국립 보건 의료 연구위원회에 의해 규정 된 관리 및 과학적인 목적을위한 동물의 사용을위한 연습 호주 코드에 따라 실시 하였다. 윤리 통관은 멜버른 대학 과학 학부, 동물 윤리위원회 (승인 번호 0911322.1)로부터 얻은 것입니다.
만성 VEP 전극 1. 사전 주입
주 : 동시 ERG와 VEP 신호가 수술 VEP 이식해야한다 동물은 적어도 일주 컬렉션 신호 전에 전극 수집 할 경우.
- 클로르헥시딘 (70 % 에탄올 중의 0.5 %) 세정 실험에 의해 종래의 수술 벤치를 소독. 사용하기 전에 모든 수술 장비를 압력솥. 멸균 수술 드레이프와 동물을 커버. 모든 실험자 수술 마스크, 가운 및 멸균 장갑을 착용해야합니다.
- 3 L / min의 유량으로 2 O 3.5 %의 이소 플루 란 - 3 마취를 유도한다. 메탄 유지수술 전반에 걸쳐 1.5 %, 2 L / 분 sthesia. 발 핀치 반사의 부재에 의해 마취의 충분한 깊이를 확인합니다.
- 눈의 건조를 방지하기 위해 각막에 1 % 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨을 적용합니다.
- 눈에 이마를 통해 후방을 30mm의 X 30mm의 영역을 면도하고 귀에 전방.
- 체온을 유지하고, 고정대와 동물의 머리를 안정화하는 열 패드 (37 ℃)에 동물을 놓는다.
- 10 % 포비돈 - 요오드로 3 회 면도 영역 소독. 연습의 표준에 부합되고, 눈 주변 지역에 대한 알코올 계 소독제의 사용을 피 외과 기술자 협회에 의해 설정합니다.
- 두개골 뼈를 노출 메스와 피부 조직이 소비세 ~ 20mm 직경의 원형에서 머리에 중간 화살 절개를합니다.
- 긁어 및 관상 및 시상 두개골 봉합을 노출 거즈로 건조하여 기본 골막을 제거합니다.
- 우리7mm의 꼬리가 정수리에, 중간 선에 3mm 측면 다음 정위 좌표에서 두 반구의 두개골을 통해 두 개의 구멍 (0.7 mm 직경, 깊이 1 ~ mm)을 두개골을 잘라내는 톱, 드릴에 부착 된 치과 버를 보내고.
- 스테인레스 스틸 나사의 나사 (직경 0.7 mm는, 클로르헥시딘과 살균 길이 3mm) ~ 1mm (노출 나사 2 mm)의 깊이까지이 미리 만들어진 구멍에 확고한 고정을 허용합니다. 기본 대뇌 피질의 조직을 손상시키지 않고이 접촉 경질합니다.
- 4 ~ 8시에 0 봉합 - 거즈와 두개골 뼈를 건조, 2 개의 3 느슨한 피부를 수축에 의해 치과 아말감에 대한 수술 영역을 준비합니다.
- 대신에 (단계 1.10에 기재된 스테인리스 나사)의 나사 전극을 고정하기 위해 노출 된 두개골 위에 치과 아말감 확산. 나사 ~ 1.5 mm가 기록 노출 상태로 확인.
- 후퇴 봉합사를 제거합니다.
- 진통제와 식염수 (염화나트륨 0.9 %, 1 0.5 % 카프로 펜 피하 (5 ㎎ / ㎏)을 주입유체 교체 0.5 ml)을 피하.
- 동물은 별도의 케이지에 복구 할 수 있습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물 두지 마십시오.
- 완전히 수술 (최소 오일)에서 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 동물을 반환하지 않습니다.
- 4 일 동안 0.5 %에게 하루에 한 번 통증에 대한 카프로 펜 피하 (5 ㎎ / ㎏)을 관리하기 위해 계속합니다.
- 기록 ERG와 VEP 수술 후 일주.
2. ERG와 VEP 기록
- 데이터 수집 준비
- 동시에 자극을 유발 아래 권장 설정에 따라 데이터 2를 획득하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용합니다.
- 신호 3 증폭 (ERG을 : 1000, VEP × : 10,000 배) 내부에 고립 된 프리 앰프와 앰프에 의해 설정된 이득 및 임피던스 정합 두 눈.
- 650 이상 4 kHz로 ERG에 대한 설정 샘플링 속도밀리 초 기록 창 (2560 점),이 작업을 수행하려면, "500 밀리"샘플은 "2560"를 선택하고 (이름 및 재료에 대한 소프트웨어를 참조 테이블의 버전) 데이터 수집 소프트웨어의 "타임베이스"에 대한 탭을 클릭합니다 시간이 650 밀리 초 기록 창을 반환한다.
- 250 밀리 초 에폭 10 kHz로 VEP 대한 샘플링 속도를 설정하는 방법과 동일한 방법을 사용한다. 모두 ERG와 VEP 레코딩을위한 10 밀리 초 사전 자극 기준을 허용합니다. 이렇게하려면 "설정"탭을 클릭합니다; 새로운 대화 창을 불러옵니다 "자극"을 선택; 그 창에서 "모드"에 대한 드롭 다운 목록에서 "펄스"를 선택; 그리고 "10 밀리 초"를 "지연"에 대한 값을 설정합니다.
- 1,000 Hz에서 - (- 3dB) 0.3 필터링 설정 ERG의 대역 통과. 이 작업은 데이터 수집 소프트웨어에서 "바이오 앰프"를 클릭하면됩니다. 그런 다음에 "0.3Hz" "하이 패스"의 값과 "로우 패스"를 "1 kHz의 값을 설정".
- 100 Hz에서 - (- 3dB) 비전 (ISCEV)의 임상 전기 생리학에 대한 국제 학회에서 권장하는 인간의 VEP 녹음 6 2.1.1.3에 언급 된 방법을 사용하여, 0.1 VEP 대역 통과 설정을 설정합니다.
- 동시에 자극을 유발 아래 권장 설정에 따라 데이터 2를 획득하기 위해 컴퓨터 소프트웨어를 사용합니다.
- 전극 준비
- 각각 2, 전극 리드에 실버 와이어 또는 악어 클립을 부착하여 ERG 활성 / 비활성 및 VEP 활성 / 비활성 전극을 사용자 정의-합니다. 상업적으로 접지 전극을 구하십시오.
- 4 맞춤 전극의 경우, 전극 리드 확장의 남성 끝을 잘라. 내부 배선을 보장 메스 블레이드가 손상되지와 외부 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 절연 코팅의 1cm를 제거합니다.
- 사전 패션 쥐 눈을 둘러싸 직경 루프 ~ 8mm를 은선 (0.3 mm 두께)을 70 mm의 길이를 잘라내어 형성함으로써 ERG 비활성 전극. 1 ML의 피펫 팁에 루프를 형성하여 균일 원을 준비합니다.
- 사전 패션 실버 와이어의 30mm 길이를 절단하고 부드럽게 쥐의 각막에 문의 작은 루프를 형성하여 ERG 활성 전극 (~ 지름 1~2mm)
- 안전하게 노출 된 내부 와이어 실버 entwining에 의해 (2 ERG가 비활성화 활성화 ERG, 1 VEP 비활성) 전극 리드에 전극을 연결합니다.
- 태양 광 유물을 줄이기 위해 마스킹 테이프로 과잉 노출 된 금속을 절연.
- 르 비활성 전극 훅 앤 루프 패스너의 작은 조각 스틱에 (~ 20mm × 5mm) 마스킹 테이프는 설치류 넥 스트랩에 안정적으로 부착을 활성화합니다.
- 전극의 내부 배선에 악어 클립을 연결하면 VEP 활성 전극을 만들기 위해 리드.
- 이전에 녹음,은 배선의 노출 된 표면 (즉, 비활성 링 ACTI 전기 도금신호 전도를 개선하기 위해 20 초 9 V DC 소스를 사용하여 염화 팁)했습니다.
- 이를 위해서는 생리 식염수로 (일차 전지의 애노드로서 작용)을 ERG 전극선의은 끝 몰입; 9 V 배터리의 양극 단자에 상기 전극 와이어의 타 단부를 연결한다.
- 전지의 음극 단자에 다른 선 (음극)을 연결하고,뿐만 아니라 염에 다른 끝 몰입. 20 초 후 분리와 화이트 컬러에 균일하게 코팅 할 수있는 ERG 전극 와이어의 은색 팁을 관찰합니다.
참고 : 염화 코팅의 개방성을 보장하기 위해 (~ 최대 8 시간까지) 각 실험 세션에 대한 새로운 ERG 전극을 준비합니다.
- 동물 준비
- 가벼운 꽉 방에서 사전 녹음에 동물 하룻밤 (≥ 8 시간)을 어두운 적응. , 실내 조명을 끄고 모든 문 블라인드를 닫아 최대 어두운 적응을 확인합니다. 주변 광 절연 재료를 배치하여 빛 누설을 최소화두꺼운 검은 커튼 외부 문 / 창문 및 배치의 컴퓨터 화면의 접합.
- 어두운 적색 발광 다이오드의 도움으로 어두운 실내에서 동물의 준비를 실시 (LED; 17.4 cd.m -2, λ 최대 = 600 nm의)로드 감도를 유지 할 수 있습니다.
- 근육 (5 ㎎ / ㎏ 60) 케타민 / 자일 라진을 주사하여 쥐를 마취. 발을 핀치 반사의 부재에 의해 마취의 충분한 깊이를 확인합니다.
- 진정 작용을 유지할 필요 50 분 후 마취의 추가 용량 (초기 용량의 50 %)을 관리한다.
- 추가 국소 마취를 들어 각 눈에 0.5 % proxymetacaine 한 방울을 적용하고, 초과 유체를 깜박입니다.
- 동공 팽창을 위해 다음 각 눈에 0.5 % tropicamide 한 방울을 적용 초과 유체를 건조.
- ERG와 VEP 전극 위치
- 패러데이 케이지에 위치한 Ganzfeld 그릇 앞의 ERG 플랫폼에서 동물을 놓습니다. 그것은을 C로, 전기 가열 패드를 사용하지 마십시오전기 생리 녹음에 전기 노이즈를 소개합니다. 주 : 플랫폼은 체온을 유지하기 위해 순환 온수 플랫폼에 부착된다.
- 목덜미 주위에 단단히 단단히하지 배치 훅 앤 루프 패스너의 스트립 플랫폼에 대한 보안 동물.
- 마취 된 쥐의 아래 앞니 주변의 비활성 VEP 전극 후크.
- 눈의 적도 주위에 비 침습적 공막 고리를 포위하여 ERG 비활성 전극을 배치합니다. 목덜미 주위 벨크로 파스너 스트립에 전극을 부착하여이를 안정시킨다. 반대편 눈에 대해 반복합니다.
- 고정시킵니다 VEP 스테인리스 스틸 나사 두개골에 사전 주입에 악어 클립을 부착하여 활성 전극.
- 신호 품질을 개선하기 전에 ERG 활성 전극의 배치에 각막 1 % 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨의 작은 방울을 놓는다. 참고 : 비스코스 유체는 미니에 대한 실험을 통해 각막 수분을 유지하는 데 도움이설치류 7 탈수 형 백내장 형성 마이즈.
- VEP 비활성 전극의 접촉을 향상시키기 위해 하부 앞니에 1 % 카르복시 메틸 셀룰로오스 나트륨의 작은 방울을 배치함으로써 신호 품질을.
- 가볍게 맞춤형 정위 팔에 부착 된 미세 조작기를 이용하여 각막 표면을 만지지하기 ERG 활성 전극을 배치합니다.
- 피하 꼬리에 지상 바늘 전극 (스테인리스 스틸)의 5mm - 2를 삽입합니다.
- 필요한 경우 하부 눈꺼풀의 사전 신호 품질을 개선하기 위해 기록에 남는 유체를 건조.
- 가까운 동물의 눈은 모두 망막의도 조명을 사용하는 그릇의 개통에 맞춰 보장 Ganzfeld 그릇에 슬라이드 플랫폼 (단계 2.4.1 참조).
- 외부 소음을 줄이기 위해 패러데이 케이지를 닫습니다.
- 데이터 수집
- 전극 placem 여부를 평가하기 - (0.52 로그 cd.sm -2) 희미한 테스트 플래시를 사용천만에 2 만족입니다. 제어 조건이 ~ 800 μV의 ERG의 진폭 크지 10 % 이상 간 눈 변동을 초래할 것이다. 필요한 재배치 전극 경우.
- 테스트 플래시 다음과 동물 이전 기록에 완전한 어둠 속에서 10 분 동안 어두운-적용 할 수 있습니다.
- ERG와 VEP를 수집하는 동안 Ganzfeld 그릇을 사용하여 빛 자극의 현재 깜박은 ~ 500 밀리 초 시간 창을 통해 동시에 신호를 보낸다. 조광기에서 진행 특정 파형에 대한 충분한 어두운 적응을 유지하기 위해 빛의 수준을 밝아합니다.
- STR, B-파도와 ERG의 A / B 파 파형을 이끌어내는 발광 에너지의 범위에서 신호를 수집합니다. 밝은 발광 에너지 (1 반복)에서 디머 빛 수준 (20 반복) 이하에서 평균 이상의 신호. 점차적으로 1에서 가장 어두운 영역에서 가장 밝은 빛 레벨 180 초에 간 자극 간격을 연장. 예를 들어 프로토콜에 대한 표 1을 참조하십시오.
- 이소로늦게 ERG로드와 콘 응답, 페어링 플래시 패러다임 (8)을 사용한다. 1.52 로그 cd.sm 4 개의 점멸을 시작 -2 년 사이에 500 밀리 초 간 자극 간격 2. 디지털 추정로드 응답을 유도하기 위해 혼합 파형 (1 일 플래시)에서 콘 파형 (3 번째 또는 4 번째 플래시)를 뺍니다.
- 밝은 발광 에너지에서 VEP 신호, 평균 20 반복을 기록하기 위해 (즉, - 0.52 로그 cd.sm -2, 5 초 간 자극 간격 1.52까지). 이 시퀀스의 첫 번째 플래시가 기존의 어두운 적응 ERG 응답을 반환합니다.
- (20) VEP는 광량에 따라 다음 밝은 ERG 단계 전에 스윕 후 재 적응을위한 3 분 1 - 허용합니다.
- 데이터 수집의 완료 후에, 펜토 바르 비탈 나트륨 (325 ㎎ / ㎖, 3 ㎖)의 심장 내 주사로 마취 된 동물을 안락사.
| 파형 | 자극 빛 에너지 (cd.sm를 기록 -2) | 반복 수 | interstimulus 간격 (초) |
| STR | -6.24 | (20) | 이 |
| STR | -5.93 | (20) | 이 |
| STR | -5.6 | (20) | 이 |
| STR | -5.33 | (20) | 이 |
| 로드 B 파 | -4.99 | (10) | 이 |
| 로드 B 파 | -4.55 | (10) | 이 |
| 로드 B 파 | -4.06 | (5) | (5) |
| 로드 B 파 | -3.51 | (5) | (5) |
| 로드 B 파 | -3.03 | 1 | 1(5) |
| 로드 B 파 | -2.6 | 1 | (15) |
| 로드 B 파 | -1.98 | 1 | (15) |
| 혼합 A- / B 파 | -1.38 | 1 | (30) |
| 혼합 A- / B 파 | -0.94 | 1 | (30) |
| 플래시 1 : 20의 혼합 A- / B 파의 평균 : VEP | -0.52 | (20) | (5) |
| (다음 전에 90 초) | |||
| 플래시 1 : 20의 혼합 A- / B 파의 평균 : VEP | 0.04 | (20) | (5) |
| (다음 전 120 초) | |||
| 플래시 1 : 20의 혼합 A- / B 파의 평균 : VEP | 0.58 | (20) | (5) |
| (다음 전 180 초) | |||
| FLA는시간 1 : 20의 혼합 A- / B 파의 평균 : VEP | 1.2 | (20) | (5) |
| (다음 전 180 초) | |||
| 플래시 1 : 20의 혼합 A- / B 파의 평균 : VEP | 1.52 | (20) | (5) |
| (다음 전 180 초) | |||
| 콘 A- / B 파 | 1.52 | 4 | 0.5 |
자극 에너지의 범위를 사용하여 표 1 ERG와 VEP 기록 프로토콜. 충분한 간 자극 간격 밝은 (아래)이 깜박에 희미 (위)에서 자극 프리젠 테이션 진행 어두운 적응을 보장합니다. 프로토콜의 마지막에, 짧은 간격으로 반복 점멸 네 원뿔 매개 된 반응을 유도하기 위해 제공된다.
ERG 파형 3. 분석
참고 : ERG와 VEP 분석 이전에 상세하게 설명하고있다 3,9,10합니다.다음 섹션에서는 간단한 개요를 제공합니다.
- 데이터 분석을 위해 스프레드 시트 소프트웨어 디지털 전압 - 시간 형식으로 내보내기 신호.
- 로드 photoreceptoral 기능
- 지연 가우스 (식 1) (11)와 A-파 PIII의 첨단 모델.
PIII는 (내가, t)는 = Rm의 PIII는 ∙ [1 - 특급은 (- 내가 S (t ∙ - t의 d)를 2)]의 t> t D (식 1) - 두 개의 밝은 발광 에너지의 앙상블을 통해 12, 13 (즉, 1.22 및 1.52 로그 cd.sm -2) 착용감을 최적화합니다.
- ㄱ 파 진폭의 90 %에 모델까지 포스트 receptoral 침입 (14)을 방지 할 수 있습니다.
참고 :이 모델은 photoreceptoral 응답의 포화 진폭 (RM PIII, μV), 감도 (S, m 2 .CD -1 .S -3)과 지연 (t d를, 밀리 초)을 반환합니다.
- 지연 가우스 (식 1) (11)와 A-파 PIII의 첨단 모델.
- 막대 양극 세포 (SECURITY) 기능을 비활성화이온
- 디지털 상부 진동 전위와 혼합 PII를 반환하는 혼합 파형에서 PIII 모델 (위 참조) 뺍니다.
- 혼합 PII에서로드 PII를 추출하려면, 디지털 혼합 PII에서 콘 응답 (3 차 또는 1.52 로그 cd.sm에서 4 번째 플래시 -2) 빼기 (1.52 로그 cd.sm에서 1 차 플래시 -2).
- 이어서, 진동 전위를 제거하는 파형 (46.9 ㎐, -3 dB, 블랙맨 윈도우)에 저역 통과 필터를 적용한다. 나머지 파형로드 PII 응답 (10)이다.
- 로드 PII 피크 진폭을 추출하고 10 (1.52 로그 cd.sm -2에서 -2 로그 cd.sm -2 봉 고립 PII 이하) 모든 자극 강도에 대해 그것을 음모.
- 내부 망막 세포의 무결성 측정 값을 제공하는 쌍곡선 함수 (수학 식 2)를 사용하여 이러한 데이터 모델.
V (i)는 V의 최대 = (I N / (I N+ 케이 N)) (식 2)
참고 :이 방정식은 최대 PII 응답 (V 맥스, μV), 1 / 감도 반환하고 기능 (N) (15)의 기울기 (K를, cd.sm-2를 기록).
- 콘 양극 세포의 기능
참고 : 콘 응답이 하나의 강도로 촬영 한 바와 같이 (1.52 로그 cd.sm -2) 진폭과 타이밍이 빛 수준에서 재곡된다.- 최대 콘 PII 응답 2.16 압축을 풉니 다.
- 이 최대 응답이 2.16에 해당되는 암시 적 시간의 압축을 풉니 다.
- 신경절 세포 기능
- 이 STR 작은 신호이기 때문에, 고주파 및 라인 노이즈 제거 파형 50 Hz의 노치와 저역 통과 필터를 적용 (46.9 Hz에서, -3 dB, 블랙맨 윈도우).
- 최대 pSTR 응답, 17의 압축을 풉니 다.
- 이 최대 응답이, 17에 해당되는 암시 적 시간의 압축을 풉니 다.
4. 아나VEP 파형의 용해
- VEP (P1, N1 및 P2)의 최대 및 최소 구성 요소의 압축을 풉니 다. 세부 사항 참조의 3,6을 참조하십시오.
- 그 앞의 피크 또는 트로프 (P1N1 및 N1P2) 3,6에서 골 - 투 - 피크 진폭으로 고속 진폭.
- 암시 적 시간 (IT) 추출에있는이 최대 응답 대응 (P1 그것은, N1 그것은, P2 그것은) 3,6-.
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Representative Results
르 A-파 (> -1.38 로그 cd.sm -2), B-파도 (> - 4.99 로그 cd.sm -2) STRs (<- 4.99 로그 cd.sm -2)와 VEPs (> - 0.52 cd.sm를 기록 -2)를 동시에 (그림 1 및 기록 하였다 3). 아주 희미한 깜박에서 긍정적 STR (pSTR)는 110 밀리 초 플래시 후 약 보지하고, 약 220 밀리 초에서 제외 STR (nSTR) (도 1 및도 2). 큰 B 파장을 가진 ERG 그 PII 응답을 분석 할 수있는 적당한 플래시의 개시 후 50 내지 100 밀리 초 사이의 피크 (도 1 및도 2). 이 자극 에너지에서, 피크 전에 네거티브 파장은 무시할 수있다. 밝게 빛나는 에너지에 부정적인 편향은 파장은 PIII 응답 (그림 2)으로 정량화 할 수있는 더 눈에 띄는된다. 다음 - 상기 암순응 VEP의 파형은 부정 응답 (70 밀리 초 윈도우 P1N1 15)를 도시 양 편향 (N1P2; 30-100 밀리) (도 3 및도 4).
그림 1. 그룹 평균 ERG 파형. ERG는 자극의 강도가 증가함에 따라 변경합니다. 파형의 왼쪽 숫자는 파형을 유도하기 위해 사용 된 노광량을 나타낸다. 각 패널에 대해 서로 다른 진폭과 시간 스케일을합니다. 디머 발광 에너지에서 암순응 임계 응답의 양 및 음의 성분 (pSTR, nSTR) 유도 될 수있다. 자극 에너지가 밝아 때, a와 b 파 응답을 분석 할 수 있으며, 쌍을 이루는 플래시 패러다임 콘 응답을 측정 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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도 2 ERG 분석. (A)의로드 시각 기능 ㄱ 전파를 모델링하는 PIII를 사용하여 분석 될 수있다. 1.22와 1.52 로그 cd.sm에서 A-파도 -2 (채워지지 않은 원, ○) Rm의 PIII를 반환 최소 90 %에 PIII와 앙상블 (회색 선, 수학 식 1)로 적합 (포화 진폭, μV) S (감도, m이 .CD -1 .S -3) 및 TD (타이밍 지연을 밀리 초) 파라미터. (B)로드 바이폴라 셀 함수 (SEM 평균 ±)로드 PII 강도 응답 일련 모델링함으로써 분석 할 수있다 나카 Rushton 기능 (회색 선)와 (채워지지 않은 원 ○). 이 V 최대 (포화 진폭, μV), K (1 / 감도, 로그의 CD SM -2)와 N (기울기)을 반환합니다. (C) 망막 신경절 세포의 기능이 희미 발광 에너지에서 분석 및 pSTR 피크 진폭에 의해 정량화 (pSTR를 A) 및 타이밍 (그 pSTR (D) 콘 양극 세포의 기능이 콘 PII 피크 진폭 (콘 PII 앰프) 및 타이밍 (콘 PII를)에 의해 정량화 페어링 플래시 패러다임으로 유도된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 그룹의 평균 VEP 파형. VEP 파형의 형상 자극의 에너지가 증가함에 따라 변경한다. 파형의 왼쪽에있는 숫자는 파형을 유도하는 데 사용되는 발광 노출을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figu4. VEP 분석 재 및 강도 응답 함수. (A)를 VEP의 진폭 분석 (P1N1)를 구유에 피크로 간주하고 (N1P2) 진폭을 피크 물마루된다. 이러한 응답의 암시 적 시간 (IT)도 반환됩니다 (P1 그것은, N1 그것은, P2 IT). (나) VEP P1N1 진폭 (± SEM을 의미) 자극 에너지 증가와 함께 증가한다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
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Discussion
르와 VEP는 각각 망막 및 피질에서 시각 기능의 객관적 측정합니다. 동시 기록의 장점은 전체 시각적 경로의보다 포괄적 인보기가 수득된다는 점이다. 특히, 자신의 동시 평가에서 보완적인 정보는 예를 들어, 시신경 병증 차 뇌 위축 (19)와 공존 할 수 ERG 아직 뚜렷한 VEP 18 발현 중복과 장애에 대한 (시각 경로에 부상의 사이트의 명확한 묘사를 제공 할 수있다, 20, 또는 VEP 손실) 시각 통로 (21, 22)의 여러 위치에서 부상의 증상으로 혼동 할 수있는 경우. 동시에 ERG 및 VEP을 측정함으로써 망막 피질 응답 간의 게인의 지표도 유도 될 수있다. 이것은 미묘한 병리학 적 변화를 검출하기에 유용한 도구를 제공 할 수있다. 현재의 프로토콜은 일반적으로 사용되는 실험실 쥐에 ERG와 VEP 측정이 가능하지만, 쉽게 광고 할 수있다다른 포유 동물 종의 23 ~ 25에 apted. 설치류에서 ERG와 VEP 파형은 인간의 눈 26-28에서 관찰 응답을위한 합리적인 전임상 대리를 제공합니다.
특정 자극 프로토콜을 설계함으로써, 두 ERG 및 VEP 응답은 하나의 기록 세션 동안 획득 될 수있다. 표 1은 연속 점멸의 복구 시간을 적절히 고려하여 조도의 진행을 나타낸다. 자일 라진 :이 프로토콜은 신호 대 잡음 특성을 극대화하고 케타민의 단일 투여에 의해 제공 마취 기간 내에 녹화 시간을 제한 할 필요성 사이에서 균형을 제공한다. 따라서,이 기술은 기본 생리 및 질병에 대한 연구에 대한 시각 기능의 객관적인 정량적 측정에 유용 할 수있다.
시각 시스템의 종합 평가는 동시에 양자 망막 반응과 시각 피질 유발 반응을 평가함으로써 달성 될 수있다. 그러나, 각각의 기술은 단독으로 수행하고 절차를 단순화하는 대신 양안의 monocularly 수있다. 현재의 프로토콜은 쥐가로드 지배 망막을 가지고 주어진로드 경로를 분리하기 위해 선택 암순응 ERG와 VEP 신호를 설명합니다. 광 적응 응답은 연구에 큰 관심이있는 경우, 배경 광에 미리 적응하여 포토 픽 ERG 및 VEP 신호들을 수행하는 것도 가능하다.
이러한 기술의 하나의 주요 제한은 안정적인 전극의 배치를 가능하게 마취 상태에서 절차를 수행 할 필요가있다. 그럼에도 불구하고,이 방법은 미세한 처리 변화의 검출을 가능하게 강력한 신호 대 잡음 특성을 제공한다.
때문에 STR 빛 적응에 감도의 작은 크기에, 몇 가지 단계가 밀접하게이 응답을 성공적으로 녹화를 보장하기 위해 관찰 할 필요가있다. 우선, 충분한 다크 적응 포함하는 구현되어야0.52 로그 CD - 희미한 테스트 플래시 (10 분 동안 다음 하룻밤 어두운 어두운 붉은 조명 아래에서 적응 (≥ 8 시간), 전극 배치 (17.4 cd.m -2, λ 최대 = 600 ㎚), 다시 어두운 적응. SM -2). 또한, STR의 신호 대 잡음 특성이 복수의 신호를 평균화함으로써 개선 될 수있다 (즉, 신호들 (20)) 단기 자극 간 간격 (예를 들어, 2 초)을 수집 하였다. 눈 및 피질 모두 포괄적 평가의 장점 중 하나는 반대측 기록 3 비교를 가능하게하는 것이다. 같은 특별한주의가 전극 제작 (즉, 같은 크기와 모양의 전극)에주의해야한다 바와 같이, 최소한의 간 눈과 간 대뇌 피질의 다양성을 보장합니다.
시각 통로 및 질병 관련 프로세스의 생체 측정에서 제공하는 두 ERG와 VEP 기술의 광범위한 사용을 감안할 때, 다른 경로 특정 페이지를 대조하는 데 유용 할 것이다rotocols (예를 들면, ON / OFF 또는 콘 하위 유형 별), 임상 진단에이 기술의 응용 프로그램을 확장하기 위해 다른 자극 양식 (예를 들어, 플리커, 패턴, 톱니) 동시 ERG / VEP 녹음을 수행합니다. 앞으로이 응용 프로그램의 또 다른 논리적 인 단계는 신경 생리학 (30)에 마취제의 영향을 피하기 위해 동물을 자유롭게 이동, 의식 (29)에서 동시에 ERG와 VEP를 기록하는 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
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