Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו

Published: July 1, 2016 doi: 10.3791/54158
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Optometry and Vision Sciences, University of Melbourne

Introduction

מדידה של electroretinogram (ERG) ופוטנציאל חזותי עורר (VEP) לספק הערכות כמותיות שימושיות של השלמות של המסלול ויזואלי. ERG מודד את התגובות החשמליות של הרשתית לגירוי אור, בעוד VEP מודד את השלמות התפקודית המקבילה של מסלולים החזותיים מהרשתית אל קליפת הראייה העיקרית הבאה באותו אירוע האור. כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור ההקלטה והניתוח של תגובות ERG ו VEP במודל מעבדה נפוצה, החולדה.

ERG מספק אינדקס של השלמות התפקודית של מספר כיתות תא מפתח רשתית על ידי כימותי התגובה החשמלית הברוטו של רשתית בזק של אור. סדרה מתואמת של ונתיבים יוניים ביוזמת התפרצות אור אופסט, לייצר שינויים לזיהוי מתח כי ניתן למדוד באמצעות אלקטרודות משטח להציב מחוץ לעין. צורת הגל שנוצר מייצג את השילוב של se ריס של רכיבים מוגדרים היטב, הנבדלים משרעת, עיתוי ותדירות. כמות ממשית של מחקרים הוכיחה כי המרכיבים הללו שמורים יחסית היטב ברחבי רשתיות החולייתנים רבות וכי הרכיבים ניתן להפריד אחד מהשני. על ידי בשיקול בחירת הגירוי (גירוי פלאש, רקע, מרווח interstimulus) תנאים ובחירת תכונות ספציפיות של צורת גל מהרוכב לנתח אחד יכול להיות סמוך ובטוח של חוזרי מידה של קבוצה ספציפית של תאים ברשתית 1,2. מאפיינים אלה ביסוד השירות ומכאן היישומים הנפוצים של ERG כאמצעי בלתי פולשני של תפקוד רשתית. כתב יד זה מתמקדת מתודולוגיה למדידת ERG וניתוח בתכונות שלה כדי להחזיר פרטים על כמה משיעורי התאים העיקריים ברשתית, כלומר קולטני אור (רכיב PIII), תאים דו קוטביים (רכיב PII) ותאי הגנגליון ברשתית (בחיובים בתגובה סף scotopic או pSTR).

= "Jove_content"> The VEP מספק assay התגובה קליפת המוח לאור; ראשון שמקורם ברשתית ואילך מתקשר סדר דרך עצב הראייה, בדרכים אופטיות, התלמוס (גרעין ברך הצדי, LGN) ו אופטי קרינה לאזור V1 של הקליפה 3. במכרסמים, רובם (90 - 95%) של סיבי עצב הראייה כל עין decussate 4 ו המעצבבים אמצע המוח הנגדי. בניגוד ERG, זה עדיין לא ניתן לייחס מרכיבים שונים של VEP לשיעורי תאים ספציפיים, 5 ובכך משנים מקום לאורך מסלול ויזואלי יכול להשפיע על צורת גל VEP. עם זאת, VEP הינו מדד שאינו פולשני שימושי של ביצועים חזותיים ויושרה מסלול ויזואלי. VEP, הפועל בשיתוף עם ERG, יכול לספק הערכה מלאה יותר של מערכת הראייה (כלומר, רשתית / מסלול ויזואלי).

הקלטות ERG ו VEP יכול להתנהל במנותק או בשילוב, תלוי appliקטיון. המתודולוגיה המתוארת במאמר זה מאפשר הערכה סימולטני של אלקטרופיזיולוגיה עורר חזותי ברשתית קליפת המוח משני העיניים שתי אונות אצל חולדות מורדמים. זוהי דרך יעילה יותר מקיף להעריך תפקוד הרשתית ואת ההשפעות הזרם כי שינויים בתפקוד הרשתית יכול להיות על תפקוד הראייה עורר קליפת המוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הפרוצדורות בוצעו על פי הקוד האוסטרלי עיסוק לטיפול והשימוש בחיות למטרות מדעיות, שנקבע על ידי ביטוח הבריאות הממלכתית ו המועצה למחקר רפואי באוסטרליה. אישור אתיקה הושג מאוניברסיטת מלבורן, הפקולטה למדעי בוועדת האתיקה בעלי חיים (מספר אישור 0,911,322.1).

1. השתלה טרום של אלקטרודות VEP הכרונית

הערה: אם אותות ERG ו VEP במקביל הם ייאספו החיות חייבות להיות מושתל בניתוח עם VEP אלקטרודות לפחות 1 שבוע לפני לאותת אוסף.

  1. לעקר את הספסל כירורגית לפני ניסויים על ידי ניקוי עם כלורהקסידין (0.5% באתנול 70%). חיטוי כל הציוד כירורגי לפני השימוש. כסה את בעל החיים עם וילון כירורגי מעוקרים. ודא כי כל הנסיינים לובשים מסכות כירורגיות, חלוקים וכפפות מעוקרות.
  2. להשרות הרדמה עם 3 - 3.5% isoflurane באות O 2 בקצב זרימה של 3 ליטר / דקה. לשמור Anesthesia ב -1.5% ו -2 L / min לאורך כל הניתוח. ודא עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס קמצוץ כפה.
  3. החל 1% נתרן חומצה גליקולית תאי על הקרנית כדי למנוע התייבשות של העיניים.
  4. לגלח אזור 30 מ"מ x 30 מ"מ מעל המצח, האחוריים לעיניים קדמית האוזניים.
  5. מניחי חיה על כרית חום (37 ג) כדי לשמור על טמפרטורת גוף ולייצב הראש של חיות עם מסגרת stereotaxic.
  6. לחטא את האזור המגולח עם 10% שלוש פעמים יוד povidone. יש להימנע משימוש חיטוי על בסיס אלכוהול לאזור ליד העין, להיות עקבי עם התקן העיסוק שנקבע על ידי האיגוד וטכנולוגים כירורגי.
  7. ביצוע חתך החציוני-sagittal על הראש עם אזמל מתוך בלו זה ~ 20 מ"מ קוטר המעגל של רקמות עורי לחשוף את עצם הגולגולת.
  8. הסר periosteum הבסיסית על ידי גירוד וייבוש עם גזה לחשוף את התפרים הגולגולת העטרה ועל sagittal.
  9. לָנוּing קוץ שיניים המצורפת מקדחה, לנקב שני חורים (0.7 מ"מ קוטר, עומק ~ 1 מ"מ) דרך הגולגולת על שתי אונות בבית הקואורדינטות stereotaxic: 7 מ"מ הזנב גבחת, 3 מ"מ לרוחב קו האמצע.
  10. בורג ברגי נירוסטה (בקוטר 0.7 מ"מ, מ"מ אורך 3, מעוקר עם כלורהקסידין) לשני החורים שהוכנו מראש עד לעומק של ~ 1 מ"מ (2 מ"מ של בורג החשוף) כדי לאפשר עגינה חזקה. זה קשר ההדור מבלי לפגוע ברקמת קליפת המוח הבסיסית.
  11. הכן אזור הניתוח עבור תערובת שיניים על ידי ייבוש העצם גולגולתי עם גזה, חוזרת בה עור רפוי עם שני 0 - 3 תפרים ב ~ 4 ו -8 בערב.
  12. מורחי תערובת שיניים על הגולגולת החשופה כדי לאבטח את האלקטרודות הבורג (ברגי נירוסטה מתוארות בשלב 1.10) במקום. ודא ~ 1.5 מ"מ של ברגים נשארים חשופים להקלטה.
  13. הסר את תפרי ההכחשה.
  14. להזריק 0.5% מתחת לעור carprofen (5 מ"ג / ק"ג) על כאבים ו מלוחים (נתרן כלורי 0.9%, 1.5 מ"ל) תת עורי עבור החלפת נוזל.
  15. אפשר חי להתאושש בכלובים נפרדים. אל תשאירו חיה ללא השגחה עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal.
  16. אל תחזור חיה לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין מהניתוח (5 ימים מינימום).
  17. המשך לנהל 0.5% מתחת לעור carprofen על שיכוך כאבים (5 מ"ג / ק"ג) פעם ביום למשך 4 ימים.
  18. שיא ERG ו VEP 1 שבוע לאחר הניתוח.

2. ERG הקלטה VEP

  1. הכנה איסוף נתונים
    1. השתמש בתוכנת מחשב כדי לעורר גירוי בו זמנית ולרכוש נתונים 2 בהתאם להגדרות מומלצות להלן.
      1. להגביר את האותות 3 (ERG: × 1,000, VEP: x10,000) עם הרווח פנימי שקבע מגבר-קדם-מגבר ומבודד, ועם שני העיניים המתאימות עבור עכבה.
      2. קצב הדגימה נקבע על ERG עד 4 קילוהרץ מעל 650חלון הקלטת msec (2,560 נקודות), לשם כך, לחץ על הכרטיסייה של "בסיס זמן" בתוכנת רכישת נתונים (עבור שם וגרסה של ראה טבלת תוכנה עבור חומרים), בחר "2,560" עבור דוגמאות, ו "500 ms" זמן אשר יחזיר חלון הקלטה 650 msec.
        1. השתמש באותה שיטה כדי להגדיר את קצב הדגימה של VEP עד 10 kHz דרך עידן 250 msec. אפשר 10 בסיס טרום גירוי msec עבור שתי הקלטות ERG ו VEP. לשם כך, לחץ על הכרטיסייה "הגדרות"; בחר "ממריץ" כדי להעלות את חלון דיאלוג חדש; בחלון זה לבחור "דופק" מן הרשימה הנפתחת עבור "מצב"; ולהגדיר את הערך של "עיכוב" ל "10 ms".
      3. הלהקה עוברים הגדר ERG סינון 0.3 - 1,000 הרץ (- 3 dB). הדבר נעשה על ידי לחיצה על "המגבר ביו" בתוכנת רכישת נתונים. ואז להגדיר את הערך של "פס גבוה" כדי "0.3Hz", ואת הערך של "מעביר נמוכים" ל "1 kHz".
      4. באמצעות השיטה הנ"ל ב 2.1.1.3, להגדיר הגדרות הלהקה עוברים VEP 0.1 - 100 הרץ (- 3 dB) כפי שהומלץ על ידי האגודה הבינלאומית Electrophysiology Clinical של חזון (ISCEV) להקלטות VEP אדם 6.
  2. הכנת אלקטרודה
    1. Custom-להפוך את האלקטרודות פעיל / פעיל ERG פעיל / פעיל VEP ידי הצמדת חוט כסף או קליפ תנין ליתרון אלקטרודה, בהתאמה 2. מסחרי להשיג אלקטרודה קרקע.
    2. עבור אלקטרודות מחוייט 4, לחתוך את קצה זכר מהתוסף להוביל אלקטרודה. הסר 1 ס"מ של ציפוי בידוד polytetrafluoroethylene החיצוני באמצעות להב סקלפל להבטיח את החוט הפנימי אינו פגום.
    3. טרום אופנת האלקטרודות הפעילה ERG ידי חיתוך אורך 70 מ"מ של חוט כסף (עובי 0.3 מ"מ) יוצר לולאה ~ 8 מ"מ קוטר להקיף עין העכברוש. כן מעגל אחיד בעיצוב הלולאה על קצה פיפטה 1 מיליליטר.
    4. אופנה קדם האלקטרודות ERG הפעילה על ידי חיתוך אורך 30 מ"מימ של חוט כסף ויוצר לולאה קטנה לפנות קרנית העכברוש בעדינות (~ 1-2 מ"מ קוטר)
    5. מאובטח לצרף אלקטרודות (2 ERG פעיל, 2 ERG פעיל, 1 VEP פעילה) כדי להוביל את האלקטרודה ידי ושוזר את הכסף עם חוט פנימי חשוף.
    6. לבודד עודף מתכת חשופה בנייר דבק כדי להפחית לכלוכי פוטו.
    7. על האלקטרודות פעיל ERG מקל חתיכה קטנה של אטב וו-ו-לולאה (~ 5 מ"מ × 20 מ"מ) על קלטת מסוך כדי לאפשר התקשרות יציבה אל רצועת נשיאה מכרסמים.
    8. צרף קליפ תנין אל החוט הפנימי של האלקטרודה מוביל על מנת להפוך את האלקטרודות VEP הפעילה.
    9. לפני הקלטות, Electroplate המשטחים החשופים של חוטי הכסף (כלומר, את הטבעת acti הפעילהve טיפ) עם כלוריד באמצעות מקור 9 וולט DC במשך 20 שניות כדי לשפר הולכת אות.
      1. לשם כך, לטבול את הקצה הכסוף של חוט האלקטרודה ERG (מתנהג כמו האנודה של תא ראשוני) לתוך מלח רגיל; חבר את הקצה השני של חוט האלקטרודה זה להדק החיובי של הסוללה V 9.
      2. חבר חוט אחר (הקתודה) למסוף השלילי של הסוללה, לטבול את הקצה השני לתוך מלוח גם כן. נתק לאחר 20 שניות ולבחון את קצה רסיס של חוט האלקטרודה ERG להיות מצופה באופן שווה בצבע לבן.
        הערה: כן אלקטרודות ERG חדש עבור כל הפעלה ניסיונית (~ עד 8 שעות) על מנת להבטיח patency של הציפוי כלוריד.
  3. בעלי חיים כנים
    1. Dark-להתאים את חיות לילה (≥ 8 שעות) לפני ההקלטות שוכבים בחדר קטן אור. ודא הסתגלות כהה מקסימלי ידי כיבוי אורות בחדר, לסגור את כל הדלתות והתריסים. למזעור זליגת אור על ידי נחת ציפוי רכבות אור מסביבצמתים של דלתות / חלונות מסכי מחשב הצבת מחוץ וילונות שחורים עבים.
    2. לנהל הכנת החיה בחדר חשוך בעזרת דיודה אור אדום עמום (LED; 17.4 cd.m -2, λ מקסימום = 600 ננומטר) כדי לקיים רגישות מוט.
    3. להרדים עכברוש ידי הזרקת קטמין / xylazine: לשריר (60 5 מ"ג / ק"ג). אשר עומק מספיק של הרדמה על ידי היעדר רפלקס קמצוץ כפה.
    4. כדי לשמור על הרגעה, לנהל מנה נוספת של הרדמה (50% של המינון ההתחלתי) לאחר 50 דקות במידת הצורך.
    5. עבור הרדמה מקומית נוספת חל טיפה אחת של 0.5% proxymetacaine לכל עין, ולמצמץ את נוזלים עודפים.
    6. עבור הרחבת אישון להחיל טיפה אחת של tropicamide 0.5% לכל עין, אז להתנגב נוזלים עודפים.
  4. מיצוב אלקטרודה ERG ו VEP
    1. הניח חיה על פלטפורמת ERG מול קערת Ganzfeld ממוקמת כלוב פאראדיי. הימנע משימוש כרית חימום חשמלי, כפי שהוא גלהציג רעש חשמלי לתוך הקלטות אלקטרו. הערה: הפלטפורמה מחוברת למשטח מים מחומם שהופץ כדי לשמור על טמפרטורת גוף.
    2. בעלי חיים מאובטחים לפלטפורמה עם פס של אטב וו-ו-לולאה להציב בחוזקה אך לא בחוזקה סביב עורפו.
    3. הוק האלקטרודה VEP הפעילה סביב חותכות תחתונות של עכברוש הרדים.
    4. מקם את האלקטרודות ERG הפעילה על ידי המקיף את טבעת scleral הלא פולשני סביב הקו המשווה של העין. ייצב זה על ידי הצמדת אלקטרודות אל רצועת אטב וו-ו-לולאה סביב עורפו. חזור על פעולה עבור העין הנגדית.
    5. הדק VEP אלקטרודות הפעילה על ידי הצמדת קליפים תנין כדי ברגי נירוסטה-מושתל מראש על הגולגולת.
    6. מקום טיפה קטנה של נתרן חומצה גליקולית תאית 1% על קרנית לפני המיקום של האלקטרודה הפעילה ERG כדי לשפר את איכות אות. הערה: נוזל ויסקוזה גם עוזר לשמור על לחות הקרנית ברחבי ניסויים למינימייז היווצרות של קטרקט התייבשות מסוג במכרסמים 7.
    7. מקום טיפה קטנה של נתרן חומצה גליקולית תאית 1% על החותכות הנמוכות לשפר את קשר של האלקטרודה הפעילה VEP ובכך לאותת איכות.
    8. מקם את האלקטרודות ERG הפעילה לגעת פני הקרנית המרכזית בקלילות באמצעות micromanipulator מצורף זרוע שהותקן stereotaxic.
    9. הכנס 2 - 5 מ"מ של האלקטרודה מחט הקרקע (נירוסטה) מתחת לעור לתוך הזנב.
    10. במידת צורך לייבש כל נוזלי עודפים מן העפעף הנח לפני ההקלטה כדי לשפר את איכות אות.
    11. פלטפורמת שקופיות קרובה לקערת Ganzfeld הבטחת העיניים של החיה ליישר עם פתיחת הקערה כדי לאפשר אפילו הארת הרשתית היא (ראה שלב 2.4.1).
    12. סגור את כלוב פאראדיי כדי להפחית רעש מיותר.
  5. איסוף נתונים
    1. השתמש מבחן פלאש עמום (- 0.52 יומן cd.sm -2) כדי להעריך אם האלקטרודה placemאף אוזן גרון הוא משביע רצון 2. בתנאים שליטה זו תביא אמפליטודה ERG של מיקרו-וולט ~ 800 ו השתנות בין-עין של לא יותר מ -10%. אם אלקטרודות למקם הנדרשות.
    2. בעקבות-פלאש הבדיקה לאפשר חיות אל dark-להסתגל במשך 10 דקות בחושך מוחלט לפני ההקלטה.
    3. הבזקים נוכחיים של גירויי אור באמצעות קערת Ganzfeld תוך איסוף ERG ו VEP מאותתים בו זמנית על פני ~ 500-חלון זמן msec. התקדמות מ דימר כדי בהירה רמות אור על מנת לשמור כהה הסתגלות מספיק גל מסוים.
    4. אסוף אותות על פני טווח של אנרגיות המאירה לעורר STR, ב-גל וכן גל / b-גל של ERG. אותות ממוצעים יותר ברמות אור דימר (20 חזרות) ופחות על האנרגיות זורחות הבהיר (1 החוזרת). בהדרגה להאריך את המרווח בין הגירוי מ 1 עד 180 שניות מ dimmest לרמת האור החזקה. ראה טבלה מס '1 עבור פרוטוקול למשל.
    5. ל ISO מאוחר תגובות מוט חרוט ERG, לנצל פרדיגמה פלאש לזווג 8. ליזום ארבעה גלים ב 1.52 יומן cd.sm -2 עם מרווח 500 msec בין גירוי 2 ב-בין. דיגיטלי להפחית את צורת גל קונוס (3 rd או 4 פלאש ה) מן צורת הגל המעורב (1 הבהוב st) לגזור את תגובת המוט המשוערת.
    6. כדי להקליט אותות VEP, 20 חזרות ממוצעות על האנרגיות זורחות הבהיר (כלומר, - 0.52 כדי 1.52 יומן cd.sm -2, 5 שניות מרווח בין גירוי). ראוי לציין, כי פלאש הראשון ברצף זו מחזיר את תגובת ERG הכהה מותאם הקונבנציונלית.
    7. אפשר 1 - 3 דקות מחדש הסתגלות לאחר (20) VEP מטאטא לפני צעד ERG הבהיר הבא, תלוי האנרגיה המאירה.
    8. לאחר השלמת איסוף הנתונים, להרדימו בהרדמה עם הזרקת intracardiac של נתרן pentobarbital (325 מ"ג / מ"ל, 3 מ"ל).
לשמור-עם-next.within-page = "תמיד">
צורת גל אנרגיה Stimulus אור (יומן cd.sm -2) מספר החזרות מרווח interstimulus (sec)
STR -6.24 20 2
STR -5.93 20 2
STR -5.6 20 2
STR -5.33 20 2
רוד ב-גל -4.99 10 2
רוד ב-גל -4.55 10 2
רוד ב-גל -4.06 5 5
רוד ב-גל -3.51 5 5
רוד ב-גל -3.03 1 15
רוד ב-גל -2.6 1 15
רוד ב-גל -1.98 1 15
a- מעורב / b-גל -1.38 1 30
a- מעורב / b-גל -0.94 1 30
פלאש 1: ממוצע a- / b-גל מעורב של 20: VEP -0.52 20 5
(90 שניות לפני הבא)
פלאש 1: ממוצע a- / b-גל מעורב של 20: VEP 0.04 20 5
(120 שניות לפני הבא)
פלאש 1: ממוצע a- / b-גל מעורב של 20: VEP 0.58 20 5
(180 שניות לפני הבא)
flasח 1: ממוצע a- / b-גל מעורב של 20: VEP 1.2 20 5
(180 שניות לפני הבא)
פלאש 1: ממוצע a- / b-גל מעורב של 20: VEP 1.52 20 5
(180 שניות לפני הבא)
קונוס a- / b-גל 1.52 4 0.5

טבלת 1. ERG ו VEP הקלטת פרוטוקול תוך שימוש במגוון של Stimulus אנרגיה. התקדמות מצגות Stimulus מ עמום (למעלה) כדי הבזקים קצרים ועזים (למטה), עם מרווח בין גירוי מספיק כדי להבטיח התאמה כהה. בסוף הפרוטוקול, חזרה על ארבעה הבזקים עם הפסקה קצרה מוצג לעורר את התגובה בתיווך החרוטה.

3. ניתוח של צורות גל ERG

הערה: ניתוח ERG ו VEP תואר בפירוט בעבר 3,9,10.הסעיפים הבאים מספקים סקירה קצרה.

  1. אותות ייצוא בפורמט מתח- זמן דיגיטלי תוכנת גיליון אלקטרוני לניתוח נתונים.
  2. רוד פונקציה photoreceptoral
    1. עצב את הקצה המוביל של PIII א-גל עם 11 גאוס מתעכב (משוואה 1).
      PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- i ∙ S (t - t ד) 2)] עבור t> t ד (משוואה 1)
    2. מטב את ההתאמה על אנסמבל של שתי אנרגיות זוהרות הבהיר 12,13 (כלומר, 1.22 ו 1.52 יומן cd.sm -2).
    3. דגם עד 90% של משרעת א-הגל להימנע חדיר שלאחר receptoral 14.
      הערה: המודל מחזירה את משרעת רווי (Rm PIII, מיקרו-וולט), רגישות (S, M 2 .cd -1 .s -3) ועיכוב (t ד, msec) של התגובה photoreceptoral.
  3. רוד דו קוטבי תא functיוֹן
    1. דיגיטלי לחסר מודל PIII (ראה לעיל) מן הגל המעורב להחזיר את PII מעורבב עם פוטנציאלים תנודתית שמעליה.
    2. כדי לחלץ את PII המוט מן PII המעורבת, באופן דיגיטלי להפחית את תגובת קונוס (3 rd או 4 פלאש ה ב 1.52 יומן cd.sm -2) מן המעורב PII (פלאש 1 st ב 1.52 יומן cd.sm -2).
    3. לאחר מכן, החל מסנן נמוך לעבור אל הגל (46.9 הרץ, -3 dB, חלון בלקמן) להסיר פוטנציאלים תנודתית. צורת הגל הנותרת היא תגובת מוט PII 10.
    4. חלץ את המשרעת שיא מוט PII ואת העלילה עליה מפני כל עוצמות הגירוי (להלן cd.sm יומן -2 -2 ו PII-מבודדים מוט 1.52 יומן cd.sm -2) 10.
    5. מודל הנתונים הללו באמצעות פונקציות היפרבוליות (משוואה 2), אשר מספקת מדד של שלמות תאים ברשתית פנימית.
      V (i) = MAX V (i n / (i n+ K n)) (משוואה 2)
      הערה: משוואה זו מחזיר תגובה PII מקסימלי (max V, מיקרו-וולט), 1 / רגישות (k, להתחבר cd.sm-2) ואת השיפוע של פונקציה (n) 15.
  4. תפקוד תא דו קוטבי קונוס
    הערה: ככל בתגובה החרוטה נלקחת בעצימות יחידות (1.52 יומן cd.sm -2) משרעת והעיתוי הם retuned ברמת האור הזה.
    1. חלץ בתגובה PII חרוט מקסימלי 2,16.
    2. חלץ מרומז זמן שבו תגובה מקסימלי זה מתאים 2,16.
  5. תפקוד תא גנגליון
    1. ככל STR היא אות קטנה, למרוח מסנן מעביר נמוך עם חריץ 50 הרץ עד waveform לחסל תדירות גבוהה ורעש קו (46.9 הרץ, -3 dB, חלון בלקמן).
    2. חלץ pSTR המקסימאלי תגובת 3,17.
    3. חלץ מרומז זמן שבו תגובה מקסימלי זה מתאים 3,17.

4. אנהתמוגה של Waveforms VEP

  1. חלץ רכיבים מינימום ומקסימום של VEP (P1, N1 ו- P2). לפרטים ראה 3,6 אזכור.
  2. אמפליטודות אקספרס אמפליטודות שוקת-לשיא מהשיא או שוקת הקודם שלהם (P1N1 ו N1P2) 3,6.
  3. חלץ זמן מרומז (זה) כדי המתכתבת תגובה מקסימלי זה (P1 זה, ​​N1 זה, ​​P2 זה) 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ERG א-גל (> -1.38 יומן cd.sm -2), ב-גלי (> - 4.99 יומן cd.sm -2) STRs (<- 4.99 יומן cd.sm -2) ואת VEPs (> - 0.52 יומן cd.sm -2) נרשמו בו זמנית (איור 1 ו -3). בשעת הבזקים מאוד עמומים, STR חיובית (pSTR) נתפסה על כ 110 msec לאחר פלאש, וכן STR שלילית (nSTR) בכ 220 msec (איורים 1 ו -2). ERG עם ב-גל גדול, פסגות בין 50 עד 100 מילי-שניות לאחר תחילת הבזק מתון אשר ניתן לנתח לתגובתו PII (איורים 1 ו -2). בשעת אנרגית הגירוי הזה, א-גל השלילי לפני השיא הוא זניח. באנרגיות זוהרות בהיר הסטייה השלילית-גל הופכת בולטת יותר אשר ניתן לכמת עם תגובת PIII (איור 2). צורת הגל VEP scotopic מראה (P1N1; 15 - 70 חלון msec) תשובה שלילית ואחריו סטייה חיובית (N1P2, 30 - 100 msec) (איורים 3 ו -4).

איור 1
איור 1. הקבוצה הממוצעת ERG Waveforms. ERG משנה עם הגדלת עוצמת גירוי. מספרים משמאל waveform לציין את החשיפה המאירה נהג לעורר את צורת הגל. הערת המאזניים משרעת זמן השונים עבור כל לוח. באנרגיות מאירות דימר המרכיבים החיוביים ושליליים של תגובת סף scotopic אפשר לחלץ (pSTR, nSTR). כמו אנרגיות גירוי לקבל בהירות, א והתגובה ב-גל ניתן assayed, ואת פרדיגמה לזווג פלאש מאפשרת התגובה החרוטה כדי להימדד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

pload / 54,158 / 54158fig2.jpg "/>
איור 2. ניתוח ERG. (א) רוד פונקציה photoreceptor ניתן assayed באמצעות PIII מודל א-גל. A-גלי cd.sm יומן 1.22 ו 1.52 -2 (עיגולים ללא מילוי, ○) הם בכושר כמו אנסמבל עם PIII (קווים אפורים, משוואה 1) עד 90% של מינימום אשר מחזירה Rm PIII (משרעת רווי, מיקרו-וולט) S (רגישות, מ 2 .cd -1 .s -3) ו- TD (עיכוב עיתוי, msec) פרמטרים. (ב) רוד תפקוד תא דו קוטבי (ממוצע ± SEM) ניתן assayed ידי דוגמנות הסדרה בתגובה העוצמת PII המוט (עיגולים ללא מילוי ○) עם פונקצית Naka-ראשטון (קו אפור). זה מחזיר מקסימום V (משרעת רווי, מיקרו-וולט), k (1 / רגישות, להיכנס SM cd -2) ו n (שיפוע). (ג) פונקציה תא גנגליון רשתית הוא assayed באנרגיות זוהר עמום לכמת ידי משרעת השיא pSTR (pSTR מגבר) ועיתוי (pSTR זה (ד) על תפקוד תא דו קוטבי Cone מתקבל עם פרדיגמה-פלאש לזווג לכמת ידי משרעת שיא החרוט PII (מגבר PII חרוט) ועיתוי (חרוט PII זה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. קבוצה הממוצעת VEP Waveforms. צורת גל VEP משנה עם הגדלת אנרגית גירוי. מספרים משמאל צורת הגל לציין את החשיפה המאירה נהגה לעורר את צורת הגל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
figuמחדש 4. ניתוח VEP ותפקוד תגובה אינטנסיבית. (א) ניתוח משרעת של VEP נלקח כמו שיא שוקת (P1N1) ודרך להגיע לשיא אמפליטודות (N1P2). בפעמים מרומז (זה) של התגובות הללו הן גם חזרו (P1 זה, ​​N1 זה, ​​P2 זה). (ב) משרעת P1N1 VEP (ממוצע ± SEM) עולה עם הגדלת אנרגית גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ERG ו VEP הם מדדים אובייקטיביים של תפקוד הראייה מהרשתית והקליפה, בהתאמה. היתרון של הקלטה בו זמנית הוא תמונה מקיפה יותר של מסלול ויזואלית השלם מוענקת. באופן ספציפי, מידע המשלים מההערכה במקביל שלהם יכול לספק הגדרה ברורה יותר של האתר של פציעה במסלול ויזואלי (למשל, עבור הפרעות עם חפיפת ERG אך ברור VEP גילויי 18, כאשר נוירופתיה אופטית עשויה להתקיים יחד עם ניוון מוחי עיקרי 19, 20, או כאשר הפסד VEP ניתן מבולבל על ידי ביטוי של פציעות בכמה מקומות באותו המסלול החזותי 21,22). באמצעות מדידת ERG ו VEP במקביל, מדד של הרווח בין תגובת רשתית קליפת המוח יכול גם לנבוע. זה עשוי לספק כלי שימושי כדי לזהות שינויי פתולוגיים עדינים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר למדידת ERG ו VEP בחולדות מעבדה נפוץ אבל יכול להיות בקלות מודעהapted למינים יונקים אחרים 23-25. גל ERG ו VEP מפני מכרסמים לספק פונדקאי פרה-קליני סבירה תגובות שנצפו בעיניים אנושיות 26-28.

על ידי תכנון פרוטוקול גירוי ספציפי, הוא בתגובת ERG ו VEP ניתן להשיג במהלך הקלטה יחידים. טבלה 1 מראה התקדמות ברמות אור עם התחשבות הולמת את זמן ההתאוששות בין הבזקים רצופים. פרוטוקול זה מספק איזון בין הצורך למקסם מאפייני אות לרעש ולהגביל זמן הקלטה בתוך חלון ההרדמה שמספק מנה אחת של קטמין: xylazine. לכן, טכניקה זו עשויה להיות שימושית עבור מדד כמותי אובייקטיבי של תפקוד הראייה לחקר הפיזיולוגיה ומחלות בסיסיים.

הערכה מקיפה של מערכת הראייה יכולה להיות מושגת על ידי במקביל להערכת תגובות רשתית הבילטרליים ותגובות קליפת מוח עורר חזותי. עם זאת, כל טכניקה יכולה גם להתנהל בבידוד monocularly במקום binocularly כדי לפשט את ההליך. הפרוטוקול הנוכחי מתאר אותות ERG ו VEP scotopic נבחרו כדי לבודד את מסלול המוט נתון שיש חולדות רשתית מוט נשלט. אם תגובות מותאמות אור הן בעלי עניין רב יותר במחקר, אפשר גם לנהל אותות ERG ו VEP photopic ידי לאימוצו מראש אור רקע.

מגבלה עיקרית אחת של טכניקה זו היא הצורך לבצע את ההליך בתנאים מורדמים כדי לאפשר מיקום האלקטרודה יציב. עם זאת גישה זו מספקת מאפייני אות לרעש חזקים המאפשרים זיהוי של שינויי טיפול עדינים.

בשל משרעת הקטנה של STR ורגישותה הסתגלות אור, כמה צעדים יש נצפו מקרוב כדי להבטיח הקלטה מוצלחת של תגובה זו. ראשית, הסתגלות כהה מספיק צריכה להיות מיושמת, הכוללתהסתגלות כהה לילה (≥ 8 שעות), מיקום האלקטרודה בתאורת אדום עמום (17.4 cd.m -2, λ מקסימום = 600 ננומטר), ו מחדש כהה להסתגלות לאחר א-פלאש מבחן עמום (10 דק 'עבור - 0.52 יומן cd. SM -2). יתר על כן, אות לרעש המאפיינים של STR ניתן לשפר על ידי ממוצעים של מעל אותות מרובים (כלומר, 20 אותות) שנאסף עם מרווחים בין גירוי קצרים (כלומר, 2 שניות). אחד היתרונות של הערכה מקיפה זו היא של עיניים הקורטקס הוא לאפשר השוואה להקלטה 3 הנגדית. כמו טיפול כזה, בפרט יש לנקוט בקבלת אלקטרודה (כלומר, באותו אלקטרודות בגודלו ובצורתו), כדי להבטיח הבין-עין מינימלי והבין-מוחיות שונות.

בהינתן השימוש הנרחב של שתי טכניקות ERG ו VEP לספק אמצעי vivo של המסלול ויזואלי תהליכי המחלה הקשורה שלה, זה יהיה שימושי כדי לאסוף p מסלול ספציפי אחרrotocols (למשל, ON / OFF או חרוט סוג משנה ספציפי), ולבצע הקלטות ERG / VEP סימולטני עם שיטות גירוי שונים (למשל, הבהוב, דפוס, זיגזג) להרחיב את היישום של טכניקה זו ב אבחנות קליניות. עוד צעד הגיוני של יישום זה בעתיד יהיה גם להקליט את ERG ו VEP במקביל מ -29 מודעים, חופשי-נע חיות כדי למנוע שפעות הרדמה על פיזיולוגיה עצבית 30.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alligator clip generic brand HM3022 Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables
Bioamplifier ADInstruments ML 135 For amplifying ERG and VEP signals
Carboxymethylcellulose sodium 1.0% Allergan CAS 0009000-11-7 Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode
Carprofen 0.5% Pfizer Animal Health Group CAS 53716-49-7 Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline
Chlorhexadine 0.5% Orion Laboratories 27411, 80085 For disinfecting surgical instruments
Circulating water bath Lauda-Königshoffen MGW Lauda For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings
Dental amalgam DeguDent GmbH 64020024 For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust
Dental burr Storz Instruments, Bausch and Lomb #E0824A A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws
Drill Bosch Dremel 300 series An automatic drill for trepanning
Electrode lead Grass Telefactor  F-E2-30 Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier
Faraday Cage custom-made Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio
Gauze swabs Multigate Medical Products Pty Ltd 57-100B For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery
Ganzfeld integrating sphere Photometric Solutions International Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size
Velcro VELCRO Australia Pty Ltd VELCRO Brand Reusable Wrap Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform
Isoflurane 99.9% Abbott Australasia Pty Ltd CAS 26675-46-7 Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery
Ketamine  Troy Laboratories Ilium Ketamil Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording
Luxeon LEDs Phillips Lighting Co. For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs.
Micromanipulator Harvard Apparatus BS4 50-2625 Holds the ERG active electrode during recordings
Needle electrode Grass Telefactor  F-E2-30 Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP
Phenylephrine 2.5% minims  Bausch and Lomb CAS 61-76-7 Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording
Povidone iodine 10% Sanofi-Aventis CAS 25655-41-8 Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml
Powerlab data acquisition system ADInstruments ML 785 Controls the LEDs
Proxymetacaine 0.5% Alcon Laboratories  CAS 5875-06-9 For corneal anaesthesia during ERG recordings
Saline solution Gelflex Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes
Scope Software ADInstruments version 3.7.6 Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data
Silver (fine round wire) A&E metal 0.3 mm Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode
Stainless streel screws  MicroFasterners 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes
Stereotaxic frame David Kopf Model 900 A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates
Surgical blade Swann-Morton Ltd. 0206 For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes
Suture Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery
Tobramycine eye ointment 0.3% Alcon Laboratories  CAS 32986-56-4 Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery
Tropicamide 0.5% Alcon Laboratories  CAS 1508-75-4 Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording
Xylazine Troy Laboratories Ilium Xylazil-100 Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording
Pipette tip Eppendorf Pty Ltd 0030 073.169 Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes
Microsoft Office Excel Microsoft version 2010 spreadsheet software for data analysis
Lethabarb Euthanazia Injection Virbac (Australia) Pty Ltd LETHA450 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
  2. Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
  3. Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
  4. Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
  5. Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
  6. Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
  7. Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
  8. Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
  9. Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
  10. Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
  11. Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
  12. Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
  13. Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
  14. Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
  15. Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
  16. Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
  17. Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
  18. Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
  19. Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
  20. Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
  21. Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
  22. Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
  23. Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
  24. Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
  25. Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
  26. Robson, J. G., Frishman, L. J. Dissecting the dark-adapted electroretinogram. Doc Ophthalmol. 95, 187-215 (1998).
  27. Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
  28. Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
  29. Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
  30. Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).

Tags

Neuroscience גיליון 113 electroretinogram פוטנציאל חזותי עורר electroretinography אלקטרופיזיולוגיה תגובה חזותית עוררת פונקצית רשתית פונקצית עצב ראייה
הקלטה בו זמנית של Electroretinography ופוטנציאלים חזותיים מעוררים אצל חולדות הרדימו
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, C. T., Tsai, T. I., He, Z.,… More

Nguyen, C. T., Tsai, T. I., He, Z., Vingrys, A. J., Lee, P. Y., Bui, B. V. Simultaneous Recording of Electroretinography and Visual Evoked Potentials in Anesthetized Rats. J. Vis. Exp. (113), e54158, doi:10.3791/54158 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter