Introduction
Medição do eletrorretinograma (ERG) e visual potencial evocado (VEP) fornecem avaliações quantitativas úteis da integridade da via visual. O ERG mede as respostas eléctricas do retina para a estimulação pela luz, enquanto o VEP mede a integridade funcional correspondente das vias visuais da retina para o córtex visual primário seguindo o mesmo evento de luz. Este manuscrito descreve um protocolo para a gravação e análise das respostas do ERG e VEP em um modelo de laboratório comumente usado, o rato.
O ERG fornece um índice da integridade funcional de um número de classes principais de células da retina quantificando resposta elétrica bruta da retina para um flash de luz. Uma série coordenada de fluxos iônicos iniciado pelo aparecimento de luz e compensar, produzir mudanças detectáveis na tensão que pode ser medido por meio de eletrodos de superfície colocados fora do olho. A forma de onda resultante representa a combinação de um SEries de componentes bem definidas, diferindo na amplitude, tempo e frequência. Um corpo substancial de investigação tem demonstrado que estes componentes são relativamente bem conservada entre muitos retina de vertebrados e que os componentes podem ser separados uns dos outros. Ao seleccionar criteriosamente as condições de estímulo (stimulus flash, fundo, intervalo interstimulus) e escolher características específicas da forma de onda composta para analisar se pode ter a certeza de voltar uma medida de um grupo específico de células da retina 1,2. Estas características são a base da utilidade e, portanto, as aplicações difundidas do ERG como uma medida não-invasiva da função retina. Este manuscrito incide sobre a metodologia para a medição do ERG e analisar suas características para retornar informações sobre alguns dos principais classes de células na retina, nomeadamente fotorreceptores (o componente PIII), células bipolares (o componente PII) e células ganglionares da retina (o positivo limiar de resposta escotópica ou pstr).
3. Em roedores, a maioria (90-95%) de fibras do nervo óptico de cada olho decussate 4 e inervam o cérebro médio contralateral. Ao contrário do ERG, é como ainda não é possível atribuir diferentes componentes da VEP às classes de células específicas, 5 muda, assim, em qualquer lugar ao longo da via visual pode afetar a forma de onda VEP. No entanto, o VEP é uma medida não-invasivo útil do desempenho visual e integridade da via visual. A VEP, quando usado em conjunto com o ERG, pode proporcionar uma avaliação mais completa do sistema visual (ou seja, a retina / via visual).
registos de ERG e VEP pode ser realizada de forma isolada ou em combinação, dependendo da aplicação. A metodologia descrita neste artigo permite a avaliação simultânea de eletrofisiologia visual evocado retina e cortical de ambos os olhos e ambos os hemisférios em ratos anestesiados. Esta é uma maneira útil para avaliar de forma mais abrangente a função da retina e os efeitos a montante que as mudanças na função da retina pode ter em função cortical evocado visual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos, estabelecido pela National Health and Medical Research Council na Austrália. apuramento de Ética foi obtido a partir da Universidade de Melbourne, Faculdade de Ciências, Comitê de Ética Animal (número de aprovação 0.911.322,1).
1. Pré-implantação de VEP crônica Eletrodos
Nota: Se os sinais ERG e VEP simultâneos devem ser recolhidos os animais devem ser implantados cirurgicamente com VEP eléctrodos, pelo menos, uma semana antes para sinalizar coleção.
- Esteriliza-se o banco cirúrgica antes da experimentação com a limpeza com cloro-hexidina (0,5% em 70% de etanol). Autoclave todo o equipamento cirúrgico antes do uso. Cobrir o animal com um campo cirúrgico esterilizado. Garantir que todos os experimentadores usar máscaras cirúrgicas, batas e luvas esterilizadas.
- Induzir a anestesia com 3-3,5% de isoflurano com O 2 a um caudal de 3 L / min. manter anesthesia a 1,5% e 2 L / min durante toda a cirurgia. Certifique-se suficiente profundidade da anestesia pela ausência do reflexo pata pitada.
- Aplicar 1% de carboximetilcelulose de sódio sobre a córnea para evitar a secagem dos olhos.
- Raspar uma área de 30 mm x 30 milímetros sobre a testa, posterior aos olhos e anterior para os ouvidos.
- Coloque o animal em uma almofada de calor (37 ° C) para manter a temperatura corporal e estabilizar a cabeça dos animais com um quadro estereotáxico.
- Desinfectar a área raspada com 10% de iodopovidona três vezes. Evitar o uso de anti-sépticos à base de álcool para a área perto do olho, sendo consistente com o padrão de prática estabelecidos pela Associação dos Tecnólogos cirúrgicos.
- Faça uma incisão mediana sagital na cabeça com um bisturi e desta especiais de consumo um círculo de diâmetro ~ 20 mm de tecido dérmico para expor o osso craniano.
- Remover periósteo subjacente por raspagem e secagem com gaze para expor as suturas cranianas coronal e sagital.
- Nosing uma broca dentária ligado a uma broca, trepan dois orifícios (0,7 mm de diâmetro, a profundidade ~ 1 mm) através do crânio em ambos os hemisférios em coordenadas estereotáxicas: 7 milímetros caudal ao bregma, a 3 mm lateral à linha média.
- Screw em parafusos de aço inoxidável (diâmetro 0,7 mm, comprimento 3 mm, esterilizado com clorexidina) nos dois orifícios pré-fabricados até uma profundidade de ~ 1 mm (dois milímetros do parafuso exposta) para permitir a ancoragem firme. Este contactos a dura sem danificar o tecido cortical subjacente.
- Prepare a área cirúrgica para amálgama dental por secagem do osso craniano com gaze, e retrair a pele solta com dois 3-0 suturas em ~ 4 e 8 horas.
- Espalhe amálgama dental sobre o crânio exposto para proteger os eléctrodos de parafuso (parafusos de aço inoxidável descrito na etapa 1.10) no lugar. Certifique-se de ~ 1,5 mm dos parafusos permanecem expostos para a gravação.
- Retirar as suturas de retração.
- Injectar 0,5% por via subcutânea carprofeno (5 mg / kg) para analgesia e soro fisiológico (cloreto de sódio a 0,9%, 10,5 ml) por via subcutânea para a reposição de líquidos.
- Permitir animal recuperar em gaiolas separadas. Não deixe animais sem vigilância até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal.
- Não devolva animal para a companhia de outros animais até que ele está totalmente recuperado de uma cirurgia (mínimo de 5 dias).
- Continue a administrar por via subcutânea 0,5% carprofeno para analgesia (5 mg / kg) uma vez por dia durante 4 dias.
- Grave ERG e VEP uma semana após a cirurgia.
2. ERG e VEP Recording
- preparação de coleta de dados
- Use um software de computador para acionar simultaneamente estímulo e adquirir dados de 2 de acordo com as configurações recomendadas abaixo.
- Amplificar os sinais 3 (ERG: × 1.000, VEP: x10,000) com o ganho ajustado internamente por um pré-amplificador e amplificador isolado, e com ambos os olhos pareados por impedância.
- Ajustar a taxa de amostragem para a ERG a 4 kHz através de uma 650ms janela de gravação (2.560 pontos), Para fazer isso, clique na guia de "base de tempo" no software de aquisição de dados (por nome e versão do software Tabela see de Materiais), selecione "2560" para as amostras, e "500 ms" para o tempo que irá retornar uma janela de gravação de 650 ms.
- Use o mesmo método para definir a taxa de amostragem para o VEP para 10 kHz durante um período ms 250. Permitir a 10 ms linha de base pré-estímulo para ambos os registos de ERG e VEP. Para fazer isso, clique na aba "Configuração"; selecione "estimulador" para abrir uma nova janela de diálogo; nessa janela, selecione "pulso" da lista de "Mode" para baixo; e defina o valor para "atraso" para "10 ms".
- Definir band-pass ERG filtrando a 0,3 - 1.000 Hz (- 3 dB). Isto é feito clicando "Bio amplificador" no software de aquisição de dados. Em seguida, defina o valor para "High Pass" para "0,3 Hz", eo valor para o "low pass" para "1 kHz".
- Usando o método acima referido em 2.1.1.3, definir as configurações passa-banda VEP para 0,1 - 100 Hz (- 3 dB), conforme recomendado pela Sociedade Internacional de Eletrofisiologia Visual Clínica (ISCEV) para gravações humana VEP 6.
- Use um software de computador para acionar simultaneamente estímulo e adquirir dados de 2 de acordo com as configurações recomendadas abaixo.
- preparação eletrodo
- Costume de fazer os eletrodos ERG ativos / inativos e VEP ativos / inativos, anexando fio de prata ou de um jacaré para um cabo-eletrodo, respectivamente 2. Comercialmente obter eletrodo terra.
- Para os 4 eletrodos feitos por medida, o corte do lado masculino da extensão cabo-eletrodo. Retirar 1 cm, o revestimento de isolamento exterior politetrafluoroetileno com uma lâmina de bisturi assegurando o fio interior não é danificado.
- Pré-forma, o ERG eléctrodos inactivos por corte de um comprimento de 70 milímetros de fio de prata (espessura de 0,3 milímetros) e formando um anel ~ 8 mm de diâmetro para rodear o olho de rato. Prepare um círculo uniforme por moldar o loop em um 1 ml ponta da pipeta.
- Pré-forma os eléctrodos activos ERG por corte de um comprimento de 30 mm de fio de prata e que formam um laço pequeno para contactar suavemente a córnea de rato (~ 1-2 mm de diâmetro)
- Firmemente unir eletrodos (2 ERG ativo, 2 ERG inativo, 1 VEP inativo) para o cabo-eletrodo por entrelaçando a prata com o fio interno exposto.
- Isolar o excesso de metal exposto com fita adesiva para reduzir artefatos fotovoltaicos.
- Nos eletrodos inativos ERG furar um pequeno pedaço de prendedor de gancho e loop (~ 5 mm x 20 mm) para a fita adesiva para permitir fixação estável para a alça de roedor pescoço.
- Anexar jacaré para o fio interno do eletrodo leva para fazer os eletrodos ativos VEP.
- Antes de gravações, galvanizar as superfícies expostas dos fios de prata (isto é, o anel inactivo e ACTIve ponta) com cloreto de usar uma fonte de 9 V DC por 20 s para melhorar a condução do sinal.
- Para fazer isso, mergulhar a ponta do fio de prata do eléctrodo ERG (que actua como o ânodo de uma célula primária) em solução salina normal; ligar a outra extremidade do fio deste eléctrodo ao terminal positivo de uma bateria de 9 V.
- Conecte outro fio (o cátodo) ao terminal negativo da bateria, e mergulhar a outra extremidade em solução salina também. Desconectar após 20 segundos e observar a ponta da tira do fio eléctrodo ERG a ser revestido uniformemente na cor branca.
Nota: Preparar novos eletrodos ERG para cada sessão experimental (~ até 8 horas) para garantir a permeabilidade do revestimento de cloreto.
- preparação animal
- Dark-se adaptar os animais durante a noite (≥ 8 horas) antes da gravação em uma luz quarto apertado. Certifique-se de adaptação ao escuro máxima desligando luzes da sala, fechando todas as portas e persianas. Minimizar o vazamento de luz, colocando materiais à prova de luz ao redorjunções de portas / janelas e telas de computador colocação fora cortinas pretas grossas.
- Realizar preparação animal em um quarto escuro com a ajuda de dim vermelho light-emitting diode (LED; 17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm) para sustentar a sensibilidade rod.
- Anestesiar ratos por injecção de cetamina / xilazina (60: 5 mg / kg) por via intramuscular. Confirmar suficiente profundidade de anestesia pela ausência de um reflexo da pata pitada.
- Para manter a sedação, administrar uma dose adicional de anestesia (50% da dose inicial), após 50 minutos, se necessário.
- Para anestesia tópica adicional aplicar uma gota de 0,5% proxymetacaine para cada olho, e piscará o excesso de fluido.
- Para a dilatação da pupila aplicar uma gota de tropicamida 0,5% para cada olho, em seguida, secar o excesso de líquido.
- ERG e VEP posicionamento dos eletrodos
- Coloque o animal na plataforma de ERG em frente da bacia Ganzfeld situado na gaiola de Faraday. Evite usar uma almofada de aquecimento eléctrico, uma vez que cum introduzir ruído eléctrico para as gravações eletrofisiológicas. Nota: A plataforma está ligado a uma plataforma de água aquecida circulado para manter a temperatura corporal.
- Seguro animal a plataforma com uma tira de fecho de gancho e laço colocado com firmeza, mas não firmemente em torno da nuca.
- Gancho o eletrodo VEP inativa ao redor incisivos inferiores do rato anestesiado.
- Posicione os eletrodos inativos ERG cercando o anel escleral não-invasiva em torno do equador do olho. Estabilizar esta anexando eléctrodos à tira de fecho de gancho e laço em torno da nuca. Repita o procedimento para o olho contralateral.
- Apertem VEP eletrodos ativos, anexando garras jacaré para parafusos de aço inoxidável pré-implantados no crânio.
- Colocar uma pequena gota de 1% de carboximetilcelulose de sódio em córnea antes da colocação do eléctrodo activo ERG para melhorar a qualidade do sinal. Nota: O fluido viscose também ajuda a manter a hidratação da córnea ao longo da experimentação a mini-mizar a formação de tipo dessecação de catarata em roedores 7.
- Colocar uma pequena gota de 1% de carboximetilcelulose de sódio sobre os incisivos inferiores para melhorar o contacto do eléctrodo de VEP inactiva e, assim, a qualidade do sinal.
- Posicione os eletrodos ativos ERG para tocar levemente a superfície da córnea central utilizando um micromanipulador presa a um braço estereotáxico custom-built.
- Insira 2 - 5 mm de comprimento da agulha de eléctrodo de chão (aço inoxidável) subcutaneamente na cauda.
- Se necessário secar o excesso de fluido da pálpebra inferior antes de gravar para melhorar a qualidade do sinal.
- Deslize plataforma mais perto da bacia de Ganzfeld assegurando os olhos do animal alinhar com a abertura da taça para permitir uma iluminação uniforme de ambas as retinas (veja passo 2.4.1).
- Feche a gaiola de Faraday para reduzir ruídos estranhos.
- Coleção de dados
- Use um teste-flash dim (- 0,52 log cd.sm -2) para avaliar se placem eletrodoent é satisfatória 2. Sob condições de controlo isto resultaria em uma amplitude do ERG ~ de 800 mV e uma variabilidade inter-ocular que não seja maior do que 10%. Se eletrodos de reposição necessárias.
- Após o ensaio de-flash permitir aos animais dark-se adaptar para 10 min em completa escuridão antes da gravação.
- flashes presentes de estímulos de luz usando uma tigela Ganzfeld enquanto coleta ERG e VEP sinaliza simultaneamente durante um-janela de tempo ~ 500 ms. Progresso de dimmer para mais claro os níveis de luz, a fim de manter escuro-adaptação suficiente para formas de onda específicos.
- Recolhe sinais a uma variedade de energias luminosas para eliciar STR, b-ondas e uma forma de onda / onda b do ERG. Média de mais sinais nos níveis dimmer luz (20 repetições) e menos nas energias mais brilhante luminosos (1 repetição). Gradualmente aumentar o intervalo inter-estímulo 1-180 seg de dimmest para o nível de luz mais brilhante. Ver Tabela 1 para um exemplo de protocolo.
- para isotarde os bastonetes e cones respostas ERG, utilizar um paradigma-flash emparelhado 8. Iniciado quatro flashes em 1,52 log cd.sm -2 com um intervalo de 500 ms inter-estímulo 2 in-between. Subtrair digitalmente a forma de onda cone (3º ou 4º flash) da forma de onda mista (1 flash de st) para obter a resposta de bastonetes putativo.
- Para gravar sinais VEP, média de 20 repetições para as energias mais brilhante luminosos (ou seja, - 0,52-1,52 log cd.sm -2, 5 seg intervalo inter-estímulo). Observe que o primeiro flash nesta seqüência retorna a resposta de adaptação ao escuro convencional ERG.
- Permitir 1-3 min para readaptação depois (20) varre VEP antes do mais brilhante próximo passo do ERG, dependendo da energia luminosa.
- Após a conclusão da recolha de dados, sacrificar o animal anestesiado com injecção intracardíaca de pentobarbital de sódio (325 mg / ml, 3 ml).
| Forma de Onda | A energia da luz estímulo (cd.sm log -2) | Número de repetições | intervalo interstimulus (seg) |
| STR | -6,24 | 20 | 2 |
| STR | -5,93 | 20 | 2 |
| STR | -5.6 | 20 | 2 |
| STR | -5,33 | 20 | 2 |
| Rod b-ondas | -4,99 | 10 | 2 |
| Rod b-ondas | -4,55 | 10 | 2 |
| Rod b-ondas | -4,06 | 5 | 5 |
| Rod b-ondas | -3,51 | 5 | 5 |
| Rod b-ondas | -3,03 | 1 | 15 |
| Rod b-ondas | -2.6 | 1 | 15 |
| Rod b-ondas | -1,98 | 1 | 15 |
| a- Mixed / b-ondas | -1.38 | 1 | 30 |
| a- Mixed / b-ondas | -0,94 | 1 | 30 |
| Flash 1: média de 20 /-ondas b a- misto: VEP | -0,52 | 20 | 5 |
| (90 segundos antes do próximo) | |||
| Flash 1: média de 20 /-ondas b a- misto: VEP | 0,04 | 20 | 5 |
| (120 segundos antes do próximo) | |||
| Flash 1: média de 20 /-ondas b a- misto: VEP | 0.58 | 20 | 5 |
| (180 seg antes do próximo) | |||
| Flash 1: média de 20 /-ondas b a- misto: VEP | 1.2 | 20 | 5 |
| (180 seg antes do próximo) | |||
| Flash 1: média de 20 /-ondas b a- misto: VEP | 1,52 | 20 | 5 |
| (180 seg antes do próximo) | |||
| Cone a- / b-ondas | 1,52 | 4 | 0,5 |
Tabela 1. ERG e VEP Protocolo de gravação usando uma variedade de estímulo Energia. Apresentações de estímulo progresso de dim (superior) para (inferior) flashes luminosos, com suficiente intervalo inter-estímulos para garantir a adaptação escuro. No final do protocolo, a repetição de quatro pisca com curto intervalo de tempo é apresentada para induzir a resposta mediada cone.
3. Análise do ERG formas de onda
Nota: a análise do ERG e VEP foi descrito em pormenor anteriormente 3,9,10 A.seções a seguir fornecem uma visão geral.
- sinais de exportação em formato de tempo de tensão digital a um software de planilha para análise de dados.
- função photoreceptoral Rod
- Modelar o bordo de ataque da onda de um PIII com uma gaussiana retardada (Equação 1) 11.
PIII (i, t) = Rm PIII ∙ [1 - exp (- i ∙ S (t - t d) 2)] para t> t d (Equação 1) - Otimizar o ajuste sobre um conjunto de duas energias mais brilhante luminosos 12,13 (ou seja, cd.sm 1,22 e 1,52 log -2).
- Modelo de até 90% da amplitude da onda a evitar intrusões pós-receptoral 14.
Nota: O modelo retorna a amplitude saturada (Rm PIII, mV), sensibilidade (S, m 2 .cd -1 .s -3) e de atraso (t d, ms) da resposta photoreceptoral.
- Modelar o bordo de ataque da onda de um PIII com uma gaussiana retardada (Equação 1) 11.
- Rod funct célula bipolaríon
- subtrair digitalmente o modelo PIII (ver acima) a partir das formas de onda mistos para retornar o PII misturado com potenciais oscilatórios sobrepostas.
- Para extrair o PII haste do PII mista, digitalmente subtrair a resposta de cones (3º ou 4º flash a 1,52 log cd.sm -2) do PII mista (1 flash de st em cd.sm 1,52 log -2).
- Em seguida, aplique um filtro passa-baixa para a forma de onda (46,9 Hz, -3 dB, a janela de Blackman) para remover potenciais oscilatórios. A forma de onda restante é a vara resposta PII 10.
- Extrair a haste PII pico de amplitude e traçar-lo contra todas as intensidades de estímulo (abaixo de -2 PII log cd.sm -2 e haste isolado a 1,52 log cd.sm -2) 10.
- Modelar esses dados através de uma função hiperbólica (Equação 2), que fornece uma medida da integridade celular da retina interna.
V (i) = V max (i n / (i nK + n)) (Equação 2)
Nota: Esta equação retorna resposta PII máxima (V max, mV), 1 / sensibilidade e a inclinação da função (n) 15 (k, cd.sm-2 log).
- função da célula bipolar Cone
Nota: Como a resposta cone é tomada em um único intensidade (1,52 log cd.sm -2) a amplitude e tempo são sintonizados neste nível de luz.- Extraia cone máxima resposta PII 2,16.
- Extraia tempo implícita ao qual esta resposta máxima corresponde 2,16.
- a função das células ganglionares
- À medida que a STR é um sinal pequeno, aplicar um filtro passa-baixa com 50 Hz notch a forma de onda para eliminar a alta frequência e ruído de linha (46,9 Hz, -3 dB, a janela de Blackman).
- Extraia resposta pstr máximo 3,17.
- Extraia tempo implícita ao qual esta resposta máxima corresponde 3,17.
4. Analise de VEP formas de onda
- Extrair componentes máximas e mínimas do VEP (P1, N1 e P2). Para mais detalhes ver referências 3,6.
- Amplitudes Express como amplitudes vale e pico de seu pico anterior ou calha (P1N1 e N1P2) 3,6.
- Extraia o tempo implícito (ele) para que isto corresponde resposta máxima (P1-lo, N1-lo, P2-lo) 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
O ERG uma onda (> -1,38 log cd.sm -2), b-ondas (> - 4,99 log cd.sm -2) STRs (<- 4,99 log cd.sm -2) e os PEVs (> - 0,52 cd.sm log -2) foram gravadas simultaneamente (Figura 1 e 3). No flashes muito fraca, a STR positivo (pstr) é visto em cerca de 110 milissegundos após o flash, e uma STR negativo (NSTR) a cerca de 220 ms (Figuras 1 e 2). Um ERG com um grande da onda b, picos entre 50 a 100 ms após o início de um flash moderada que podem ser analisados para a sua resposta PII (Figuras 1 e 2). Neste energia estímulo, o negativo de uma onda antes do pico é insignificante. A energias luminosas brilhantes a deformação negativa da onda torna-se mais proeminente que pode ser quantificado com a resposta PIII (Figura 2). A forma de onda escotópica VEP mostra uma resposta negativa (P1N1; 15-70 janela mseg) seguido de um desvio positivo (N1P2; 30 - 100 ms) (Figuras 3 e 4).
Figura 1. Grupo Média ERG formas de onda. O ERG altera com o aumento da intensidade do estímulo. Os números à esquerda da forma de onda indicar a exposição luminosa utilizada para induzir a forma de onda. Observe as diferentes escalas de amplitude e tempo para cada painel. A energias luminosas de intensidade da luz das componentes positiva e negativa da resposta escotópica limiar pode ser provocada (pStr, NSTR). Como energias estímulo ficar mais brilhante, a um e b-onda de resposta pode ser testada, e um paradigma-flash emparelhado permite que a resposta cone a ser medido. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
pload / 54158 / 54158fig2.jpg "/>
Figura 2. Análise. (A) A função de fotorreceptores Rod ERG pode ser ensaiada usando um PIII para modelar a uma onda. A-ondas na cd.sm 1,22 e 1,52 log -2 (círculos não preenchidas, ○) estão aptos como um conjunto com um PIII (linhas cinzentas, Equação 1) a 90% do mínimo que retorna Rm PIII (amplitude saturado, mV) S (sensibilidade, m 2 .s -1 .cd -3) e os parâmetros de TD (atraso de temporização, ms). (B) a função da célula bipolar haste (média ± SEM) pode ser ensaiada através da modelação da série resposta intensidade da haste PII (círculos não preenchidos ○) com uma função de Naka-Rushton (linha cinza). Isso retorna V max (amplitude saturado, mV), k (1 / sensibilidade, ingresse cd sm -2) e n (inclinação). Função de células ganglionares (C) Retinal é ensaiada em energias luminosas fracas e quantificados por pstr pico de amplitude (pstr amp) e tempo (pstr-lo (D) a função das células bipolar Cone é provocada com um paradigma-flash emparelhado quantificada por cone PII pico de amplitude (cone PII amp) e tempo (cone PII-lo). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Grupo Média VEP formas de onda. A forma da onda de VEP altera com o aumento da energia estímulo. Os números à esquerda da forma de onda indicam a exposição luminosa utilizada para induzir a forma de onda. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figure 4. Análise VEP e função Response Intensidade. (A) Análise Amplitude da VEP é tomado como pico à calha (P1N1) e através de pico amplitudes (N1P2). Os tempos implícitos (ele) destas respostas também é retornado (P1-lo, N1-lo, P2-lo). (B) A amplitude VEP P1N1 (média ± SEM) aumenta com o aumento da energia estímulo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O ERG e VEP são medidas objetivas da função visual da retina eo córtex, respectivamente. A vantagem de gravação simultânea é que uma visão mais abrangente de toda a via visual é oferecida. Especificamente, as informações complementares na sua avaliação simultânea poderia fornecer uma definição mais clara do local da lesão na via visual (por exemplo, para distúrbios com sobreposição ERG ainda distinta VEP manifestações 18, quando neuropatia óptica pode co-existir com atrofia cerebral primário 19, 20, ou quando a perda de VEP podem ser confundidos pela manifestação de lesões em vários locais na via visual 21,22). Através da medição do ERG e VEP simultaneamente, um índice do ganho entre a resposta da retina e cortical também pode ser derivada. Isto pode fornecer uma ferramenta útil para detectar alterações patológicas sutis. O protocolo atual permite a medição ERG e VEP em ratos de laboratório comumente usados, mas podem facilmente ser adApted a outras espécies de mamíferos 23-25. ERG e VEP formas de onda a partir de roedores fornecem um substituto razoável pré-clínico para respostas observadas em olhos humanos 26-28.
Ao projetar um protocolo de estímulo específico, tanto resposta ERG e VEP pode ser obtida durante uma única sessão de gravação. A Tabela 1 mostra uma progressão nos níveis de luz com a devida consideração do tempo de recuperação entre flashes consecutivos. Este protocolo proporciona um equilíbrio entre a necessidade de maximizar as características sinal-ruído e limitar o tempo de gravação dentro da janela de anestésico é fornecida por uma única dose de cetamina: xilazina. Portanto, esta técnica pode ser útil para uma medida quantitativa objectivo da função visual para pesquisa em fisiologia de base e a doença.
Uma avaliação abrangente do sistema visual pode ser alcançado através da avaliação simultaneamente respostas da retina bilaterais e respostas corticais visuais evocados. No entanto, cada técnica também pode ser realizada de forma isolada e monocular em vez de binocularmente para simplificar o procedimento. O protocolo atual descreve sinais escotópicas ERG e VEP escolhidos para isolar a haste da via, dado que os ratos têm uma retina dominada-rod. Se as respostas de luz adaptado são de maior interesse para o estudo, também é possível conduzir sinais ERG e VEP fotópicas por pré-adaptação a um fundo claro.
Uma grande limitação desta técnica é a necessidade de realizar o procedimento em condições anestesiados para permitir a colocação do eletrodo estável. No entanto, esta abordagem fornece características robustas de sinal-para-ruído, permitindo a detecção de alterações de tratamento sutis.
Devido à pequena amplitude do STR e sua sensibilidade à adaptação à luz, várias etapas devem ser cuidadosamente observados para garantir uma gravação de sucesso desta resposta. Em primeiro lugar, a adaptação ao escuro suficiente precisa ser implementado, que incluiovernight adaptação ao escuro (≥ 8 horas), a colocação do eletrodo sob iluminação vermelha fraca (17,4 cd.m -2, λ max = 600 nm), e adaptação re-escuro após um teste-flash dim (10 min para - 0,52 log cd. SM -2). Além disso, as características de sinal-para-ruído da STR pode ser melhorada pela média ao longo de vários sinais (ou seja, 20 sinais) recolhidas com intervalos curtos inter-estímulos (isto é, 2 seg). Uma das vantagens desta avaliação abrangente de ambos os olhos e córtices é permitir comparação com a gravação contralateral 3. Como tal cuidado, especial deve ser tomado na tomada de eletrodo (ou seja, os mesmos eletrodos de tamanho e em forma), para garantir o mínimo inter-olho e variabilidade inter-cortical.
Dada a extensa utilização de ambas as técnicas de ERG e VEP para fornecer em medidas in vivo da via visual e os seus processos relacionados com a doença, seria útil para recolher outra via específica p-rotocols (por exemplo, ON / OFF ou cone sub-tipo específico), e realizar gravações ERG / VEP simultâneas com diferentes modalidades de estímulo (por exemplo, cintilação, teste padrão, dente de serra) para estender a aplicação desta técnica em diagnósticos clínicos. Outra etapa lógica desta aplicação no futuro também seria para gravar o ERG e VEP simultaneamente de consciência 29, os animais livremente em movimento para evitar influências anestésicos sobre a fisiologia neural 30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alligator clip | generic brand | HM3022 | Stainless steel 26 mm clip for connecting VEP screw electrodes to cables |
| Bioamplifier | ADInstruments | ML 135 | For amplifying ERG and VEP signals |
| Carboxymethylcellulose sodium 1.0% | Allergan | CAS 0009000-11-7 | Viscous fluid for improving signal quality of the active ERG electrode |
| Carprofen 0.5% | Pfizer Animal Health Group | CAS 53716-49-7 | Proprietary name: Rimadyl injectable (50 mg/ml). For post-surgery analgesia, diluted to 0.5% (5 mg/ml) in normal saline |
| Chlorhexadine 0.5% | Orion Laboratories | 27411, 80085 | For disinfecting surgical instruments |
| Circulating water bath | Lauda-Königshoffen | MGW Lauda | For maintaining body temperature of the anesthetized animal during surgery and electrophysiological recordings |
| Dental amalgam | DeguDent GmbH | 64020024 | For encasing the electrode-skull assembly to make it more robust |
| Dental burr | Storz Instruments, Bausch and Lomb | #E0824A | A miniature drill head of ~ 0.7 mm diameter for making a small hole in the skull over each hemisphere to implant VEP screws |
| Drill | Bosch | Dremel 300 series | An automatic drill for trepanning |
| Electrode lead | Grass Telefactor | F-E2-30 | Platinum cables for connecting silver wire electrodes to the amplifier |
| Faraday Cage | custom-made | Ensures light proof to maintain dark adaptation. Encloses the Ganzfeld setup to improve signal to noise ratio | |
| Gauze swabs | Multigate Medical Products Pty Ltd | 57-100B | For drying the surgical incision and exposed skull surface during surgery |
| Ganzfeld integrating sphere | Photometric Solutions International | Custom designed light stimulator: 36 mm diameter, 13 cm aperture size | |
| Velcro | VELCRO Australia Pty Ltd | VELCRO Brand Reusable Wrap | Hook-and-loop fastener to secure the electrodes and the animal on the recording platform |
| Isoflurane 99.9% | Abbott Australasia Pty Ltd | CAS 26675-46-7 | Proprietary Name: Isoflo(TM) Inhalation anaaesthetic. Pharmaceutical-grade inhalation anesthetic mixed with oxygen gas for VEP electrode implant surgery |
| Ketamine | Troy Laboratories | Ilium Ketamil | Proprietary name: Ketamil Injection, Brand: Ilium. Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Luxeon LEDs | Phillips Lighting Co. | For light stimulation twenty 5 W and one 1 W LEDs. | |
| Micromanipulator | Harvard Apparatus | BS4 50-2625 | Holds the ERG active electrode during recordings |
| Needle electrode | Grass Telefactor | F-E2-30 | Subcutaneously inserted in the tail to serve as the ground electrode for both the ERG and VEP |
| Phenylephrine 2.5% minims | Bausch and Lomb | CAS 61-76-7 | Instilled with Tropicamide to achieve maximal dilation for ERG recording |
| Povidone iodine 10% | Sanofi-Aventis | CAS 25655-41-8 | Proprietory name: Betadine, Antiseptic to prepare the shaved skin for surgery 10%, 500 ml |
| Powerlab data acquisition system | ADInstruments | ML 785 | Controls the LEDs |
| Proxymetacaine 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 5875-06-9 | For corneal anaesthesia during ERG recordings |
| Saline solution | Gelflex | Non-injectable, for electroplating silver wire electrodes | |
| Scope Software | ADInstruments | version 3.7.6 | Simultaneously triggers the stimulus via the Powerlab system and collects data |
| Silver (fine round wire) | A&E metal | 0.3 mm | Used to make active and inactive ERG electrodes, and the inactive VEP electrode |
| Stainless streel screws | MicroFasterners | 0.7 mm shaft diameter, 3 mm in length to be implanted over the primary visual cortex and serve as the active VEP electrodes | |
| Stereotaxic frame | David Kopf | Model 900 | A small animal stereotaxic instrument for locating the primary visual cortices according to Paxinos & Watson's 2007 rat brain atlas coordinates |
| Surgical blade | Swann-Morton Ltd. | 0206 | For incising the area of skin overlaying the primary visual cortex to implant the VEP electrodes |
| Suture | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,Ltd | 3-0 silk braided suture non-absorbable, for skin retraction during VEP electrode implantation surgery | |
| Tobramycine eye ointment 0.3% | Alcon Laboratories | CAS 32986-56-4 | Proprietary name: Tobrex. Prophylactic antibiotic ointment applied around the skin wound after surgery |
| Tropicamide 0.5% | Alcon Laboratories | CAS 1508-75-4 | Proprietary name: 0.5% Mydriacyl eye drop, Instilled to achieve mydriasis for ERG recording |
| Xylazine | Troy Laboratories | Ilium Xylazil-100 | Pharmaceutical-grade anesthetic for electrophysiological recording |
| Pipette tip | Eppendorf Pty Ltd | 0030 073.169 | Eppendorf epTIPS 100 - 5,000 ml, for custom-made electrodes |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | version 2010 | spreadsheet software for data analysis |
| Lethabarb Euthanazia Injection | Virbac (Australia) Pty Ltd | LETHA450 | 325 mg/ml pentobarbital sodium for rapid euthanazia |
References
- Nguyen, C. T. O., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Weymouth, A. E., Vingrys, A. J. Rodent electroretinography: methods for extraction and interpretation of rod and cone responses. Prog Retin Eye Res. 27, 1-44 (2008).
- Tsai, T. I., Bui, B. V., Vingrys, A. J. Effect of acute intraocular pressure challenge on rat retinal and cortical function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 1067-1077 (2014).
- Cowey, A., Franzini, C. The retinal origin of uncrossed optic nerve fibres in rats and their role in visual discrimination. Exp Brain Res. 35, 443-455 (1979).
- Weinstein, G. W., Odom, J. V., Cavender, S. Visually evoked potentials and electroretinography in neurologic evaluation. Neurol Clin. 9, 225-242 (1991).
- Odom, J. V., et al. Visual evoked potentials standard (2004). Doc Ophthalmol. 108, 115-123 (2004).
- Ridder, W. H., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. Causes of cataract development in anesthetized mice. Exp Eye Res. 75, 365-370 (2002).
- Nixon, P. J., Bui, B. V., Armitage, J. A., Vingrys, A. J. The contribution of cone responses to rat electroretinograms. Clin Experiment Ophthalmol. 29, 193-196 (2001).
- Bui, B. V., et al. Using the electroretinogram to understand how intraocular pressure elevation affects the rat retina. J Ophthalmol. 2013, 262467 (2013).
- Nguyen, C. T., Vingrys, A. J., Bui, B. V. Dietary omega-3 fatty acids and ganglion cell function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3586-3594 (2008).
- Hood, D. C., Birch, D. G. A quantitative measure of the electrical activity of human rod photoreceptors using electroretinography. Vis Neurosci. 5, 379-387 (1990).
- Birch, D. G., Hood, D. C., Locke, K. G., Hoffman, D. R., Tzekov, R. T. Quantitative electroretinogram measures of phototransduction in cone and rod photoreceptors - Normal aging, progression with disease, and test-retest variability. Arch Ophthalmol. 120, 1045-1051 (2002).
- Bui, B. V., Vingrys, A. J. Development of receptoral responses in pigmented and albino guinea-pigs (Cavia porcellus). Doc Ophthalmol. 99, 151-170 (1999).
- Robson, J. G., Saszik, S. M., Ahmed, J., Frishman, L. J. Rod and cone contributions to the a-wave of the electroretinogram of the macaque. J Physiol. 547, 509-530 (2003).
- Severns, M. L., Johnson, M. A. The care and fitting of Naka-Rushton functions to electroretinographic intensity-response data. Doc Ophthalmol. 85, 135-150 (1993).
- Bui, B. V., Fortune, B. Origin of electroretinogram amplitude growth during light adaptation in pigmented rats. Vis Neurosci. 23, 155-167 (2006).
- Bui, B. V., Fortune, B. Ganglion cell contributions to the rat full-field electroretinogram. J Physiol. 555, 153-173 (2004).
- Tremblay, F., Laroche, R. G., Debecker, I. The Electroretinographic Diagnosis of the Incomplete Form of Congenital Stationary Night Blindness. Vision Res. 35, 2383-2393 (1995).
- Bayer, A. U., Keller, O. N., Ferrari, F., Maag, K. P. Association of glaucoma with neurodegenerative diseases with apoptotic cell death: Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Am J Ophthalmol. 133, 135-137 (2002).
- Wostyn, P., Audenaert, K., De Deyn, P. P. An abnormal high trans-lamina cribrosa pressure difference: A missing link between Alzheimer's disease and glaucoma. Clinical Neurology and Neurosurgery. 110, 753-754 (2008).
- Yucel, Y. H., Zhang, Q. A., Weinreb, R. N., Kaufman, P. L., Gupta, N. Effects of retinal ganglion cell loss on magno-, parvo-, koniocellular pathways in the lateral geniculate nucleus and visual cortex in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 22, 465-481 (2003).
- Gupta, N., Yucel, Y. H. What changes can we expect in the brain of glaucoma patients. Survey of Ophthalmology. 52, 122-126 (2007).
- Kong, Y. X., et al. Impact of aging and diet restriction on retinal function during and after acute intraocular pressure injury. Neurobiol Aging. 33, 1115-1125 (2012).
- Bui, B. V., Sinclair, A. J., Vingrys, A. J. Electroretinograms of albino and pigmented guinea-pigs (Cavia porcellus). Aust N Z J Ophthalmol. 26, Suppl 1 98-100 (1998).
- Jobling, A. I., Wan, R., Gentle, A., Bui, B. V., McBrien, N. A. Retinal and choroidal TGF-beta in the tree shrew model of myopia: isoform expression, activation and effects on function. Exp Eye Res. 88, 458-466 (2009).
- Robson, J. G., Frishman, L. J.
- Robson, J. G., Frishman, L. J. The rod-driven a-wave of the dark-adapted mammalian electroretinogram. Prog Retin Eye Res. 39, 1-22 (2014).
- Hudnell, H. K., Boyes, W. K. The comparability of rat and human visual-evoked potentials. Neurosci Biobehav Rev. 15, 159-164 (1991).
- Charng, J., et al. Conscious wireless electroretinogram and visual evoked potentials in rats. PLoS One. 8, e74172 (2013).
- Hetzler, B. E., Berger, L. K. Ketamine-Induced Modification of Photic Evoked-Potentials in the Superior Colliculus of Hooded Rats. Neuropharmacology. 23, 473-476 (1984).
