Abstract
Perifere slagaderziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de ontwikkelde landen en diermodellen die betrouwbaar reproduceren menselijke ziekte zijn nodig om nieuwe therapieën te ontwikkelen voor deze ziekte. De muis achterbeen ischemie model is op grote schaal gebruikt voor dit doel, maar de standaardpraktijk induceren acute ischemie door ligatie van de femorale slagader kan aanzienlijke weefselnecrose, compromitteren vermogen onderzoekers om de vasculaire en skeletspier weefselreacties ischemie bestuderen . Een alternatieve benadering voor dijbeenslagader ligatie is de inductie van geleidelijke femorale arterie occlusie met behulp van ameroid constrictors. Wanneer geplaatst rondom de femorale slagader in dezelfde of verschillende locaties sites dijbeenslagader ligatie deze apparaten de slagader afsluiten dan 1-3 dagen, wat geleidelijker, subacute ischemie. Dit resulteert in minder groot skeletspier weefselnecrose, which kan beter na te bootsen de reacties te zien in de menselijke PAD. Omdat de genetische achtergrond invloeden uitkomsten in zowel de acute en subacute ischemie modellen, rekening houdend met de muis stam wordt bestudeerd is belangrijk bij het kiezen van het beste model. Dit artikel beschrijft de juiste procedure en anatomische plaatsing van ligaturen of ameroid constrictors op de muis femorale slagader subacute of acute ischemie achterbeen induceren in de muis.
Introduction
Perifere slagaderziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de ontwikkelde landen 1. PAD resultaten van atherosclerotische verstopping van de perifere slagaders die leidt tot ischemie met de daaruit voortvloeiende inspanning of rust pijn en soms niet-genezende zweren en gangreen dat amputatie noodzakelijk maken. Behandelingen die PAD is vooral gericht endovasculaire 2 of chirurgische revascularisatie 3, als in wezen geen effectieve medische behandelingen bestaan 4.
Helaas, revascularisatie is vaak beperkt voordeel, zoals omleidingen hebben een hoge uitval (tot 50% binnen 5 jaar) 5 die zijn slechter in sommige populaties (bijvoorbeeld rokers, vrouwen, non-vene transplantaten) 6,7. Endovasculaire benaderingen, zoals angioplastie en stenting, worden eveneens aangetast door hoge restenose doses (meer dan 50% binnen 1 jaar), voornamelijk in femoropopliteale ziekte 8, hoewel het gebruik van drug-eluting ballonnen en stents resultaten 9-11 enigszins verbeterd. Om nieuwe behandelingen te ontwikkelen voor PAD is het essentieel om diermodellen die betrouwbaar de menselijke ziekte reproduceren ontwikkelen.
Tot op heden het meest voorkomende type van PAD is de achterpoot ischemiemodel (HLI), dat meestal uitgevoerd bij muizen 12,13. In zijn meest algemene manifestatie model houdt chirurgische ligatie van de proximale en distale femorale slagader en de tussenliggende zijtakken gevolgd door excisie van het vaartuig, hetgeen resulteert in occlusie van de bloedstroom en inductie van acute ischemie van de ledematen. HLI wordt voornamelijk gebruikt om de angiogenese en arteriogenese responsen in perifere ledematen spierweefsel en de effecten van verschillende therapieën (bijvoorbeeld drugs, genafgifte, stamcellen) op deze reacties te bestuderen. Recentelijk heeft onze fractie dit model gebruikt om de rol van skeletspiercellen onderzoeken in de respons op ischemie en de effecten van genetische verschillen op de resultaten 14 ledematen.
De HLI model huidige inzichten dat de vasculaire en spier respons op ischemie afhankelijk zijn genetica (dwz inteeltstam) 15, leeftijd 16, en de aanwezigheid of afwezigheid van andere ziekten of aandoeningen atherosclerose betrokken, waaronder diabetes mellitus 17 en gefaciliteerd hypercholesterolemie 18. Echter, een belangrijke zwakte van de traditionele HLI model is dat het een model van acute ischemie 12,13, terwijl menselijke PAD veroorzaakt chronische ischemie als gevolg van de geleidelijke ontwikkeling van occlusieve atherosclerotische laesies in de perifere slagaders.
In een poging om deze zwakte te omzeilen, Tang en zijn collega's in eerste instantie ontwikkeld een rat model van geleidelijke dijbeen arteriële occlusie met behulp ameroid constrictors 19, en dezelfde groep die inmiddels developed een soortgelijke muismodel 20. Ameroid constrictors werden oorspronkelijk beschreven in 1950 in een hond model van chronische myocardiale ischemie 21,22. Deze toestellen hebben een buitenste metalen huls omhullen een binnenlaag van een hygroscopisch materiaal, gewoonlijk caseïne en, wanneer het om een slagader induceren geleidelijk vatocclusie zij vocht uit de omringende weefsels. In de wijziging van het model, Yang et al. Constrictors geplaatst aan zowel de proximale en distale femorale slagader op plaatsen analoog aan de chirurgische ligatie plaatsen en ze geligeerd de zijtakken van de arteria femoralis, zoals in het traditionele model. In vergelijking met acute HLI, ameroid-constrictor geïnduceerde ischemie resulteerde in lagere expressie van inflammatoire en shear stress-afhankelijke genen, lagere bloeddoorstroming herstel 4-5 weken na de operatie, en minder spiernecrose 20. Op basis van deze observaties, was men van mening dat de geleidelijke arteriële occlusie zou een model van P biedenAD relevanter voor de menselijke ziekte.
Met name in het oorspronkelijke rapport, effecten van ameroid-constrictor ischemie onderzocht alleen in C57BL / 6 muizen 19, die relatief resistent zijn tegen ischemie geïnduceerde spiernecrose 15 zijn. We hebben onlangs wijzigde de geleidelijke ischemie model verder en de gevolgen ervan in de meer ischemie-gevoelige BALB / c muizenstam 23 verkend. In de eerste manifestatie van het model plaatsten we constrictors zowel de proximale en distale femorale arterie maar liet al zijtakken intact. In een tweede, mildere wijziging, plaatsten we een enkele constrictor alleen op de proximale dij slagader en weer liet al kant-takken van de slagader intact. In beide modificaties van dit model hebben wij BALB / c-muizen, maar C57BL / 6 muizen, toonde aanzienlijke spiernecrose ondanks gelijke bloedstroom en vasculaire dichtheid. Vergelijkbaar met onze vorige studie 14, deze bevindingen blijkt dat ledematen spierenletsel wordt niet alleen beïnvloed door de bloedstroom, maar is voor een deel afhankelijk van de genetische achtergrond. Bovendien vonden we dat ledematen bloedstroom daalde tot het laagste punt binnen 3 dagen, waardoor het model lijkt meer een van 'subacute' in plaats van een geleidelijke lidmaat ischemie.
Op basis van deze eerdere studies, lijkt het duidelijk dat een werkwijze voor het induceren achterbeen ischemie niet in alle gevallen geschikt kunnen zijn. Omdat verschillende omstandigheden (bijvoorbeeld genetische verschillen en met of zonder comorbide omstandigheden) beïnvloeden zowel de vasculaire en skeletspier-specifieke responsen, onderzoekers kan het nodig om de chroniciteit en / of de ernst van achterpoot ischemie beste wijzigen passen hun doeleinden. Bovendien voorafgaande beschrijvingen van het model meestal ontbrak geschikte anatomische oriëntatiepunten om betrouwbare inter-onderzoeker reproduceerbaarheid van de techniek te vergemakkelijken. In dit document, werkwijzen voor het induceren van acute en subacute achterbeen ischemie in de muisworden beschreven, en nauwkeurige anatomische oriëntatiepunten zijn aanwezig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocol door de hertog Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. Mannelijke muizen werden in dit onderzoek, hoewel beide geslachten kan worden gebruikt als geïndiceerd voor de wetenschappelijk doel van de studie.
1. Ontharing
- Voorafgaand aan inductie van anesthesie, het opzetten van een pre-operatieve voorbereiding gebied dat bestaat uit een overdekte verwarmingselement ingesteld op 37 ° C en een neuskegel poort waarop continue stroom van isofluraan.
- Plaats de muis in de anesthesie inductie kamer. Stel de O 2 flowmeter tot 1 l / min en isofluraan tot 1-3%.
OPMERKING: Anesthesie wordt typisch geïnduceerd in een 25 g muis met 2% isofluraan. - Controleer de muis stimulus respons door zachtjes schommelen van de kamer en het observeren van het ontbreken van een oprichtende reflex.
- Spoel de kamer met O 2 om de isofluraan voorafgaand aan de opening te wissen. Snel naar de muis om de verwarming pad en sluit deze aan isofluraan via de neuskegel.
- Stel de isofluraan 1,5%. Controleer de stimulus reactie van pedaal reflex (teen knijpen).
- Toepassen oftalmische smeermiddel royaal beide ogen te drogen tijdens de operatie te voorkomen.
- Scheer het haar van beide achterpoten met behulp van een kleine elektrische trimmer. Houd de huid strak tijdens het scheren te voorkomen verscheurende de huid.
- Solliciteer voorverwarmde ontharingscrème en laat zitten voor 1 min. Veeg weg met een vochtig gaasje.
- Voor chirurgische procedure op een later tijdstip, schakelt u de isofluraan en beweeg de muis om een lege papieren handdoek gevoerd herstel kooi om de muis te verzekeren niet te zuigen de kooi beddengoed. Monitor het dier totdat het in staat is borstligging handhaven. Zo niet, beweeg de muis om de chirurgische tafel.
LET OP: De ontharing kan de huid irriteren en aantasten perfusie metingen. Het wordt aanbevolen om te wachten 1-2 dagen na het ontharen van het dier voordat performing een pre-operatieve perfusie scan of het uitvoeren van een operatie.
2. Pre-Surgical Voorbereiding
- Gebruik de volgende gereedschappen tijdens deze procedure; kleine rechte chirurgische schaar, 2 fijne punt schuine pincet, kleine Graefe pincet, naald driver tang, 3 oprolmechanismen, kleine lente schaar, en fine-tip wattenstaafjes.
- Steriliseren alle gereedschappen met behulp van een autoclaaf voorafgaand aan de start van de operatie. Gebruik een hete kraal sterilisator voor en tussen elke chirurgische procedure tot 5 dieren. Steriliseren extra chirurgisch instrument pakketten voor operaties van de groepen groter dan 5.
- Bereid een steriele chirurgische veld, bestaande uit een overdekte verwarming pad en een isofluraan poort. Voer alle werkzaamheden in het kader van een 10 stereo dissectie microscoop.
- Verdoven en de voorbereiding van de muis, zoals beschreven in de stappen 1,1 tot 1,5.
- Controleer of de muis is volledig verdoofd en plaats in een liggende positie op de chirurgische tafel. Secure beide benen met behulp van chirurgische tape. </ Li>
- Bij gebruik van een temperatuur-gecontroleerde verwarming pad, bevestig de temperatuursensor en zet hem aan de basis van de chirurgische platform met behulp van chirurgische tape om ervoor te zorgen dat het niet per ongeluk wordt uitgetrokken tijdens de procedure.
- Reinig de incisie site met behulp van 3 afwisselend povidonjood en alcohol doekjes. Bedek het dier met een steriele chirurgische doek en een gat aan de incisie bloot.
3. Inductie van Limb ischemie
- Gebruik een scalpel een eerste insnijding langs het midden van de mediale dij, loopt vanaf de knie naar de buik, en verlengen de incisie ongeveer 1 cm met een fijne schaar (figuur 1A).
Figuur 1. Chirurgische Site en Vasculaire anatomische oriëntatiepunten voor Mouse achterbeen ischemie Surgery. (A) Externe weergave vanhet achterbeen van een muis in rugligging. De gearceerde lijn geeft de incisie site om de achterbeen ischemie procedures behoren uit te voeren. (B) Uitzicht op de proximale muis achterbeen vaatstelsel. Het proximale uiteinde van de femorale arterie (FA) komt voort uit onder het inguinale ligament (IL). Het distale uiteinde van de FA zich op de vertakking in de popliteale arterie (PA) en saphena ader (SA). De belangrijkste collaterale arteriën off van de FA zijn de laterale circumflex dijbeenslagader (LCFA), het proximale caudale dijbeenslagader (PCFA), en de oppervlakkige caudale epigastrische slagader (SCEA). De femorale ader (FV) loopt naast de FA en veneuze takken parallel aan de grote arteriële vertakkingen zien. Sterretjes (*) geven de proximale en distale locaties voor plaatsing van ameroid constrictors of ligaturen, naargelang subacute of acute ischemie wordt veroorzaakt. Gelieve click hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Met behulp van een tang, opent de incisie en bloot de membraan dat de lies vetweefsel (IFT).
- Gebruik gesloten tang, doordringen door het membraan in de scheiding tussen de IFT en de buik. Voorzichtig de druk op de tang om de IFT scheiden van de buikspieren, waardoor de neurovasculaire bundel eronder. Let op de proximale en oppervlakkige staartvin takken zo belangrijk anatomische oriëntatiepunten (Figuur 1B).
- Plaats een retractor en trek de buik weefsel proximaal aan de proximale ameroid constrictor of ligatie site, net proximaal van de laterale circumflex dijbeenslagader (Figuur 1B) bloot te leggen. De laterale circumflex slagader ligt ongeveer 5 mm proximaal van de proximale caudale en oppervlakkige bloedvaten.
- Plaats twee oprolmechanisme in het distale deel van de incisie, een mediale en een laterale, aan de IFT distaal van het trekkenoperatieplaats naar het operatiegebied te verbreden.
- Gebruik twee fijne tang om de buitenste membraan dat de neurovasculaire bundel te verwijderen. Steek de ene helft van de fijne tang tip tussen de ader en slagader, glijden de tang tip onder het membraan dat hen samenbindt. Sluit de tang en voorzichtig losrukken het membraan.
- Steek de punt van een gesloten forceps tussen de ader en slagader en een spleet daartussen door het vrijgeven van de druk op de tang. Herhaal deze techniek om een spleet tussen de slagader en zenuw creëren.
- Voor subacute ischemie, plaats een ameroid constrictor op het proximale femorale slagader (figuur 2).
- De proximale ameroid constrictor installeren, schuift het uiteinde van een pincet onder de femorale slagader te isoleren van de neurovasculaire bundel. Gebruik een tweede set angled- tang om greep de rand van de constrictor en begeleiden onder de dijbeenslagader.
- Leg de dijbeenslagader in de sveel in de constrictor. Herhaal de distale constrictor, positionering onmiddellijk proximaal van de vertakking van de femorale slagader naar de popliteale slagader en vena slagader (figuur 2).
Figuur 2. Plaatsing van ameroid Constrictors en Ligaturen. (A) Voorbeeld van twee ameroid constrictors geplaatst op de dij slagader naar subacute achterbeen ischemie induceren. Het proximale constrictor wordt geplaatst net proximaal van de laterale circumflex dijbeenslagader (LCFA). Het distale constrictor is geplaatst juist proximaal van de vertakking van de knieholte (PA) en vena slagaders (SA). Constrictors zijn geïnstalleerd met de gleuf naar boven om de slagader te verzekeren goed is ingesteld binnen de constrictor. (B) Voorbeeld van ligaturen van de dijbeenslagader tot acute achterbeen ischemie induceren. Ligatures (gele pijlen) zodanig geplaatst dat ze flankeren de positie van de constrictors in paneel (B), en de dij slagader wordt doorsneden tussen elke set van twee ligaturen (sterretjes). Bar, 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voor acute ischemie van de ledematen, afbinden en doorsnijden het proximale dijbeen slagader.
- De femorale slagader doorsnijden, draad 7 - O hechtdraad onder de arterie proximaal van de positie van de proximale constrictor (zie stap 3,7) en ligeren. Bind een tweede ligatuur ongeveer 1 mm distaal van de eerste.
- Gebruik de lente een schaar om de slagader tussen de twee ligaturen doorsnijden. Voor de distale arteriële doorsnijding Herhaal deze stappen, het plaatsen van twee ligaturen ongeveer 1 mm van elkaar, net proximaal van de splitsing van de femorale slagader in de arteria poplitea en de vena slagader, maar ervoor te zorgen dat ze zijn distale aan de oppervlakkige caudal epigastrische slagader (zie figuur 1)
- Sluit de incisie middels onderbroken 5 - O Vicryl hechtingen.
4. perfusie beeldvorming
- Verplaats de muis naar een 37 ° C verwarming pad ingesteld onder de laser doppler perfusie imager (LDPI) en sluit via een neuskegel aan de isofluraan bron. Indien geen temperatuurbewaking beschikbaar is, laat 5 minuten voor de muis opwarmen tot 37 ° C.
- Schakel de imager en de lancering van het beeld capture software.
- Klik op het pictogram 'Nieuwe single Image' om het venster 'Scanner instellen' te openen. Stel de 'Scanformaat' naar 'groot' en de 'Scan Speed' naar '4 ms / pixel'. Stel de scan gebied door het veranderen van de x- en y-waarden onder de 'Scan Area (eenheden) "ruit.
- Klik op het tabblad 'Video en Distance' om de video-feed te bekijken, en leg de muis aan te passen in de scan gebied aangegeven door een rode contour. Klik op 'Auto Distance' te kalibrerende afstand van de laser aan de patiënt. Klik op 'Volgende' om het venster 'Subject Details' te openen.
- Voer de vakinformatie en alle relevante opmerkingen. Klik op de knop 'Volgende' om verder te gaan om het scannen venster.
- Klik op de 'Start Measurement' knop om de 'Bevestigen of Override Scan Distance' opent dialoog. Klik op 'OK' om de scan op afstand te bevestigen. Acht het scanproces starten en looptijd van 4-8 min afhankelijk van de grootte van het scangebied.
- Nadat het scannen is voltooid, let op de 'Opslaan als' venster. Noem het bestand en sla het op.
- Schakel de isofluraan en beweeg de muis om een lege herstel kooi en controleren totdat het dier in staat is om borstligging handhaven. Plaats nooit een muis te herstellen van anesthesie in een kooi met andere muizen.
- Open de beeldanalyse software. Klik op het pictogram 'Open' en blader naar en open het beeld voor analyse. Op het venster bestand, observeert de flux,foto en kleurenbeelden van de muis.
- Om de regio van belang (ROI) op de flux afbeelding te markeren, klikt u op het pictogram 'Show ROI'. Klik vervolgens op de 'Add Polygon' ingedrukt en sleep de cursor over het niet-chirurgische ledematen om de ROI te trekken. Klik met de rechtermuisknop om de vorm te sluiten. Selecteer 'Add Polygon' weer en trek een bijpassende ROI rond de chirurgische ledemaat.
- Klik op de 'Statistics' icoon te openen de 'Image ROI Statistiek Resultaten (PU)' venster. Let op de procentuele verschil in beweging in de kolom 'Flux%'.
OPMERKING: De eerste ROI getrokken zal als referentie dienen.
NB: Voorafgaand aan elke volgende perfusiescan volg de stappen in hoofdstuk 1 geschetst om de muis te verdoven en in stappen 4,1-4,11 het imago van de dieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Correcte identificatie van de muis achterbeen vasculatuur essentieel belang zijn voor de reproduceerbaarheid van de technieken voor het induceren van zowel acute en subacute achterbeen ischemie, zoals hier beschreven. Naast de variatie die inherent in dierstudies, kunnen andere factoren variabiliteit introduceren laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI), zoals het type anesthesie positie van het dier (rug vs. gevoelig) en lichaamstemperatuur (zie figuur 3). Bovendien, de subacute achterbeen ischemie model is afhankelijk van de kwaliteit van de ameroid constrictors, die sterk kan variëren binnen een gegeven partij (zie figuur 4). Elk van deze punten kan belangrijke gevolgen voor de kwantificering van stroom gemeten LDPI hebben en worden hieronder nader besproken.
Na plaatsing van ameroid constrictors in de subacute achterbeen ischemie model of ligatieen doorsnijding van de dijbeenslagader in de acute hindlimb ischemiemodel dient LDPI beelden worden verkregen onmiddellijk na operatie, terwijl het dier nog verdoofd effecten van de operatie te tonen en om een basislijn postoperatieve niveau van perfusie (figuur 5). Kwantificering van perfusie wordt uitgevoerd door een van belang (ROI) rond de ischemische achterpoot en een vergelijkbare ROI rond de niet-ischemische achterbeen trekken. Perfusie wordt meestal uitgedrukt als een verhouding van de perfusie in de ischemische ledematen die in de niet-ischemische ledematen en wijzigingen in deze verhouding wordt gemeten in de tijd. Wij hebben gevonden dat imaging muizen in buikligging resulteert in minder variabiliteit door dierenbeschermingsbeweging en veranderingen in positie van de voeten van het ene tijdstip tot het andere. Bovendien perfusie in het dijbeen neiging meer variabel te zijn bij muizen in rugligging. Een volledig verlies van achterbeen perfusie worden waargenomen na inductie van acute ledemaatischemie, terwijl slechts een lichte daling van perfusie typisch wordt waargenomen na plaatsing van ameroid constrictors in de subacute model (Figuur 5). In sommige gevallen hebben we waargenomen snelle constrictor occlusie met resulterende dramatisch verlies van perfusie onmiddellijk na de operatie.
Figuur 3. Variatie in perfusie beeldvorming basis achterbeen Locatie lichaamstemperatuur. Laser Doppler perfusiebeeldvorming van een BALB / c muis verdoofd met 1,5% isofluraan en afgetast in zowel liggende als buikligging bij 35 ° C, 37 ° C, en 38 ° C. Met isofluraan anesthesie achterpoten van het dier de neiging te bewegen met de ademhaling, waardoor een artefact (horizontale lijnen) die worden waargenomen met een grotere frequentie in liggende houding ten opzichte van gevoelig beelden. In buikligging, is het veel gemakkelijker om de exacte hoek reproducerenvan de voet, waardoor kwantificatie van perfusie in de tijd nauwkeuriger. Perfusie wordt aanzienlijk verminderd als de lichaamstemperatuur daalt tot onder 37 ° C, terwijl de beelden worden verzadigd bij hogere temperaturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De variabiliteit van commercieel verkrijgbare ameroid Constrictors (A) Een voorbeeld van een ideale 0,25 mm inwendige diameter (dubbele pijl) constrictor met uniforme slot vorm en caseïne dikte (B - D).. Voorbeelden van slot vorm variatie. Slots soms een 'D' vorm (B en C) of een 'b' vorm (D) weer te geven. In deze gevallen wordt de caseïne vrij gelijkmatig verdeeld en de sleuven voldoende diep hold de slagader. (E) Een voorbeeld van ongelijke dikte caseïne. Deze constrictor worden weggegooid. (F) Een voorbeeld van een slot die te ondiep om de slagader tijdens vernauwing houden. Dit constrictor zou ook worden weggegooid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. perfusiebeeldvorming onmiddellijk na inductie van Subacute of acute ischemie achterbeen. Representatieve perfusiebeeldvorming in zowel liggende als buikligging van BALB / c muizen die plaatsing van twee ameroid constrictors hebben ondergaan aan de linker femorale slagader subacute achterbeen ischemie of stage induceren van twee ligaturen en doorsnijding van de linker dij slagader acute achterbeen ischemie induceren. Merk op dat perfusion wordt verminderd, maar nog steeds aantoonbaar na ameroid constrictor plaatsing, terwijl in wezen geen stroom onmiddellijk wordt gedetecteerd nadat dubbele ligatie / doorsnijding van de dijbeenslagader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Misschien wel de meest uitdagende stap in deze werkwijze is de scheiding van de dijbeenslagader van de femorale ader. De grotere diameter en dunnere wanden van de femorale ader vergeleken met die van de arterie de gevoeligheid voor doorboren en scheuren tijdens chirurgische manipulatie. De waarschijnlijkheid van het verstoren van de ader kan worden verminderd door het houden van de wond vochtig met een steriel wattenstaafje bevochtigd met PBS. Het is ook belangrijk dat alle tang worden geslepen, uitgelijnd en vrij van onderbrekingen ten einde de juiste manipulatie van de vaten en omgevende weefsels toe. Indien bloeding optreedt, geldt druk met een steriel gaas totdat het bloeden is gestopt. Gedetailleerde chirurgische noten moeten worden gehandhaafd voor elk dier, als wat als 'minor' bloedingen kan worden opgevat kan een onbedoeld meer ernstige ischemische schade op de lange termijn te vertegenwoordigen. Voor de consistentie van gegevens, operaties waarbij geen veneuze of onderpand slagaderlijke bloedinging gebeurtenissen zijn cruciaal.
Een beperking van deze techniek is dat de ernst en / of begin van ischemie (in de subacute ameroid constrictor model) sterk kan variëren afhankelijk van verschillende factoren. De proximale constrictor / ligatieplaats bepaalt hoeveel collaterale arteriën worden beïnvloed door de inductie van ischemie. Leaving zijtakken intact vermindert de ernst van het letsel, maar zoals opgemerkt, in bepaalde contexten, dwz bij dieren van bepaalde genetische achtergronden ook milder kan subacute ischemie aanzienlijk weefselnecrose 23 veroorzaken. Bovendien zal de toevoeging van een tweede, distale ligatuur constrictor of perfusie afname van zowel de acute als subacute model 23. Sommige onderzoekers hebben afgebonden of gebruik gemaakt van een elektrocauterisatie om onderpand takken ablatie van de laterale circumflex slagader, de proximale caudale dijbeenslagader, en de oppervlakkige caudale epigastrische slagader 24. Dit resulteert in meer ernstige ischemie eennd kan groter spierblessure induceren, hoewel dit ook afhankelijk van de genetische achtergrond. Het is belangrijk op te merken dat elektrocauterisatie meer waarschijnlijk leiden tot schade aan de omliggende weefsels kan zijn en dient daarom met voorzichtigheid worden gebruikt.
Gezien deze variabelen, is het essentieel dat de vasculaire anatomie nauwkeurig voorafgaand aan het selecteren van de plaats van occlusie wordt geïdentificeerd. Kochi et al. 25 merkte een duidelijke gebrek aan consensus tussen de talrijke rapporten met betrekking tot de namen en locaties van de bloedvaten in de muis achterbeen, en zij hebben verstrekt een zeer gedetailleerde beschrijving van de arteriële anatomie dat wij geloven is een onmisbare gids voor iedereen die deze onderneming procedure. Een eerdere publicatie in dit tijdschrift toonde de techniek voor het induceren van acute ischemie van de ledematen 13, maar in dat het verslag van de vasculaire anatomische oriëntatiepunten zijn niet goed gedefinieerd. Een belangrijk doel van dit rapport was om een betere visuele weergave o biedenf de oriëntatiepunten naast tonen een modificatie van de techniek met subacute ischemie.
Een extra beperking van deze benadering is dat het begin van ischemie in de subacute ischemiemodel is afhankelijk van de kwaliteit van de ameroid constrictors die men gebruikt. We hebben gevonden dat commerciële constrictors kunnen variëren in de diepte en de vorm van hun interne sleuf (figuur 4). Als het slot te ondiep is de slagader kan worden geëxtrudeerd tijdens de vernauwing. Constrictors met gebarsten caseïne of misvormde slots moet worden weggegooid. Daarnaast kunnen inconsistent verdeling van caseïne binnen de constrictor leiden tot versnelde tarieven van de occlusie. De grootte en de leeftijd van de muizen is een andere cruciale factor om te overwegen, zoals grootte van de vaartuigen in 'volwassen' muizen kan aanzienlijk variëren in de leeftijd tussen 8 en 30 weken oud. Dit is vooral belangrijk wanneer er meerdere onafhankelijke cohorten van muizen gegevenssets, zoals blijkbaar small leeftijdscategorieën (bijvoorbeeld 10-16 weken) kunnen resulteren in inconsistente tarieven occlusie en ernst van ischemische ledematen letsel.
Kwantificering van laser Doppler perfusie beeldvorming kan ook variëren sterk, afhankelijk van de lichaamstemperatuur van het dier en de positie (figuur 4), alsmede de gebruikte anestheticum. Het is cruciaal dat de muis handhaven van een 37 ° C lichaamstemperatuur perfusie beeldvorming. Als de temperatuur hoger dan 37 ° C beeld perfusie wordt verzadigd. Bij temperaturen onder 36 ° C kan de perfusie te zwak zijn. Het is ook belangrijk om beide benen zo symmetrisch mogelijk te houden om een nauwkeurige perfusie verhouding (perfusie in de ischemische ledematen in vergelijking met die in de niet-ischemische lidmaat) te verkrijgen. Hoewel muizen vaak afgebeeld terwijl rugligging kan symmetrie moeilijker te handhaven in deze positie. Bovendien verschillen in de bloedstroom in het superieure deel van het beeldveld, dat wil zeggen, de proximal dij, kan bijdragen aan variabiliteit in kwantificeren. Bovendien anesthesie met isofluraan leidt vaak tot verhoogde borst beweging, waardoor weer beenbeweging en variabiliteit in het verkregen signaal door LDPI. We hebben gevonden dat het plaatsen van dieren in buikligging geeft meer steun aan de ledematen, waardoor eenvoudiger positionering en sterk verminderde beweeglijkheid, waardoor meer reproduceerbare kwantificering van regionale perfusie (Figuur 5). Bovendien buikligging vergemakkelijkt consistentere handhaving van 37 ° C temperatuur van het gescande onderdelen, die ook verhoogt de reproduceerbaarheid van kwantificering (Figuur 5). Vergeleken met isofluraan, muizen verdoofd met ketamine vertoning verminderde beweging van de borstkas, waardoor liggende imaging minder variabel. Toch zal ook toenemen ketamine anesthesie inductie en herstel tijd, wat resulteert in aanzienlijk toegenomen absolute perfusie waarden 16. Elke combinatie van lichaamshouding en anesthetic middel kan een duidelijk beeld perfusie waarde, dus is het belangrijk om een consistente techniek voor elk van deze methoden in alle volgende perfusiemetingen.
Het is belangrijk om een aantal andere beperkingen van deze techniek herkennen. Omdat het model wordt vaak uitgevoerd in muizen zonder comorbiditeiten, zoals obesitas, hyperlipidemie, atherosclerose, diabetes mellitus, of andere factoren die predisponeren voor vaatziekte, de inductie van ischemie volmaakt repliceren de pathologie van klinische PAD. Zoals opgemerkt, zijn de effecten van acute ischemie geëvalueerd in leeftijd, diabetes en hypercholesterolemie muizen, en in de toekomst zal het nuttig zijn om de effecten van deze comorbiditeit over reacties op subacute ischemie te bepalen. Omdat bovendien PAD is een chronische ziekte, zelfs subacute ischemie is een imperfect model van het klinische scenario. Daarom is het van belang te blijven modellen te ontwikkelen dieresulteren in ware chronische ischemie en te testen in combinatie met modellen van cardiovasculaire risicofactoren. Een technische beperking van de laser Doppler imaging modaliteit ongeacht het diermodel gebruikt dat meet bloedstroomsnelheid en niet absoluut weefselperfusie, kan daarom alleen gebruikt om relatieve veranderingen in de bloedstroom te vergelijken binnen een bepaald dier. Met name zal dit onderdeel ischemie verlies veroorzaakt resulteren in een verminderde perfusie verhouding ongeacht veranderingen in de bloedstroom 23.
Kortom, wij diep werkwijzen voor het induceren van acute en subacute achterpoot ischemie in muizen voor het analyseren op skeletale spier en vasculaire hermodellering. Speciale aandacht wordt besteed aan de identificatie van de kritische vasculaire bezienswaardigheden nauwkeurige intra- en inter-operator reproduceerbaarheid van het model te vergemakkelijken. Verdere verfijning van de techniek kan uiteindelijk leiden tot de ontwikkeling van een chronische ischemie model dat accuraatly repliceert de pathogenese van klinische PAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7 - 0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5 - 0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
- Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
- Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
- Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
- Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
- Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
- Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
- Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
- Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
- Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
- Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
- Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
- Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
- Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
- Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
- Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
- Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
- Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
- McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).
