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तीव्र और subacute Murine hindlimb ischemia के लिए तरीके

Published: June 21, 2016 doi: 10.3791/54166
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University Medical Center

Abstract

परिधीय धमनी रोग (पैड) हृदय रुग्णता और मृत्यु दर विकसित देशों में, और पशु मॉडल है कि मज़बूती से मानव रोग पुन: पेश इस रोग के लिए नए उपचारों को विकसित करने के लिए आवश्यक हैं में से एक प्रमुख कारण है। माउस hindlimb ischemia मॉडल व्यापक रूप से इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया गया है, लेकिन और्विक धमनी के बंधाव द्वारा तीव्र अंग ischemia उत्प्रेरण के मानक अभ्यास पर्याप्त ऊतक परिगलन में परिणाम कर सकते हैं, जांचकर्ताओं 'ischemia के संवहनी और कंकाल की मांसपेशियों के ऊतकों प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने की क्षमता समझौता किए । और्विक धमनी बंधाव के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण ameroid constrictors के उपयोग के माध्यम से क्रमिक और्विक धमनी रोड़ा की प्रेरण है। जब और्विक धमनी बंधाव की साइटों के रूप में एक ही है या अलग-अलग स्थानों में और्विक धमनी के आसपास रखा, इन उपकरणों पर 1 धमनी रोक देना - 3 दिन, अधिक क्रमिक, अर्धजीर्ण ischemia में जिसके परिणामस्वरूप। यह कम पर्याप्त कंकाल की मांसपेशी ऊतक परिगलन में यह परिणाम है, which अधिक बारीकी से प्रतिक्रियाएं मानव पैड में देखा नकल कर सकते हैं। आनुवंशिक पृष्ठभूमि प्रभावों दोनों तीव्र और अर्धजीर्ण ischemia मॉडल में परिणामों क्योंकि, माउस तनाव के विचार अध्ययन किया जा रहा सबसे अच्छा मॉडल को चुनने के लिए महत्वपूर्ण है। इस पत्र उचित प्रक्रिया और संयुक्ताक्षर या माउस और्विक धमनी पर ameroid constrictors के संरचनात्मक प्लेसमेंट के माउस में अर्धजीर्ण या तीव्र hindlimb ischemia के लिए प्रेरित करने का वर्णन है।

Introduction

परिधीय धमनी रोग (पैड) विकसित देशों में हृदय 1 रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है। परिधीय धमनियों कि परिणामी एक्सर्शनल या बाकी दर्द और कभी कभी गैर-चिकित्सा अल्सर और गैंग्रीन कि अंग विच्छेदन की जरूरत के साथ अंग ischemia की ओर जाता है की atherosclerotic बाधा से पैड का परिणाम है। लक्षित कर पैड चिकित्सा मुख्य रूप से endovascular 2 या शल्य revascularization 3 की ओर निर्देशित कर रहे हैं, के रूप में अनिवार्य रूप से कोई प्रभावी चिकित्सा उपचार मौजूद हैं 4।

दुर्भाग्य से, revascularization अक्सर सीमित लाभ के, के रूप में बाईपास ग्राफ्ट (5 साल के भीतर 50% तक) 5 उच्च असफलता की दर है कि कुछ आबादी (जैसे, धूम्रपान करने वालों, महिलाओं, गैर saphenous नस ग्राफ्ट) 6.7 में बदतर रहे है। ऐसे एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग रूप Endovascular दृष्टिकोण, यह भी उच्च restenosis दर से (1 वर्ष के भीतर 50% से अधिक) समझौता कर रहे हैं, मैं खासकरn, रोग 8 femoropopliteal हालांकि दवा eluting गुब्बारे और स्टेंट के इस्तेमाल के परिणामों को कुछ हद तक 9-11 सुधार हुआ है। आदेश पैड के लिए नए उपचार को विकसित करने में यह पशु मॉडल है कि मज़बूती से मानव रोग पुन: पेश विकसित करने के लिए आवश्यक है।

तिथि करने के लिए, पैड का सबसे आम मॉडल hindlimb ischemia मॉडल (HLI) है, जो सबसे अधिक बार चूहों 12,13 में किया जाता है। इसकी सबसे आम अभिव्यक्ति में, मॉडल प्रॉक्सिमल और बाहर और्विक धमनी की शल्य बंधाव जरूरत पर जोर देता है और इसके बीच के पक्ष शाखाओं पोत के छांटना द्वारा पीछा किया, रक्त प्रवाह और तीव्र अंग ischemia की प्रेरण का रोड़ा में जिसके परिणामस्वरूप। HLI मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है परिधीय अंग मांसपेशियों के ऊतकों में एन्जियोजेनिक और arteriogenic प्रतिक्रियाओं और विभिन्न उपचारों (जैसे, दवाओं, जीन डिलीवरी, स्टेम सेल) इन प्रतिक्रियाओं पर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। हाल ही में, हमारे समूह इस मॉडल का इस्तेमाल किया गया है कंकाल की मांसपेशी कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए मैंn प्रतिक्रिया ischemia और परिणाम 14 पर आनुवंशिक मतभेद के प्रभाव के अंग के लिए।

HLI मॉडल हमारी वर्तमान समझ है कि ischemia के संवहनी और मांसपेशियों की प्रतिक्रियाएं आनुवंशिकी (यानी, जन्मजात तनाव) 15 पर निर्भर कर रहे हैं, 16 साल की उम्र, और उपस्थिति या अन्य बीमारियों या atherosclerosis करने के लिए प्रासंगिक शर्तों मधुमेह हो सकता है 17 और शामिल है, के अभाव में मदद की है hypercholesterolemia 18। हालांकि, पारंपरिक HLI मॉडल की एक महत्वपूर्ण कमजोरी यह है कि यह तीव्र अंग ischemia 12,13 का एक मॉडल है, जबकि मानव पैड परिधीय धमनियों में ओक्लूसिव atherosclerotic घावों के क्रमिक विकास का एक परिणाम के रूप में पुरानी ischemia का कारण बनता है।

इस कमजोरी को दरकिनार करने की कोशिश में, तांग और उनके सहयोगियों ने शुरू में ameroid constrictors 19 का उपयोग करते हुए क्रमिक ऊरु धमनी रोड़ा के एक चूहे मॉडल, और एक ही समूह के बाद डी विकसितइसी तरह के एक माउस मॉडल 20 eveloped। Ameroid constrictors पुरानी दौरे 21,22 के एक कुत्ते मॉडल में 1950 के दशक में शुरू में वर्णित किया गया। इन उपकरणों के एक बाहरी धातु आस्तीन एक हीड्रोस्कोपिक सामग्री की एक भीतरी परत encasing, आमतौर पर कैसिइन है, और जब एक धमनी के आसपास रखा वे क्रमिक पोत रोड़ा प्रेरित के रूप में वे आसपास के ऊतकों से नमी को अवशोषित। मॉडल के अपने संशोधन, यांग एट अल। दोनों समीपस्थ और शल्य बंधाव साइटों के अनुरूप स्थलों पर बाहर का और्विक धमनी पर रखा constrictors, और वे और्विक धमनी के पक्ष शाखाओं ligated, पारंपरिक मॉडल के रूप में। कम मांसपेशियों नेक्रोसिस 20 5 सप्ताह के बाद ऑपरेशन, और - तीव्र HLI की तुलना में, ameroid कंस्ट्रिकटर प्रेरित ischemia भड़काऊ और कतरनी तनाव पर निर्भर जीनों की अभिव्यक्ति में कम, निम्न रक्त प्रवाह वसूली 4 में हुई। इन टिप्पणियों के आधार पर यह महसूस किया गया कि धीरे-धीरे धमनी रोड़ा पी के एक मॉडल प्रदान हो सकता हैमानव रोग के लिए और अधिक प्रासंगिक विज्ञापन।

उल्लेखनीय है कि मूल रिपोर्ट में ameroid कंस्ट्रिकटर प्रेरित ischemia के प्रभाव केवल C57BL / 6 चूहों 19 है, जो अपेक्षाकृत ischemia प्रेरित पेशी नेक्रोसिस 15 के लिए प्रतिरोधी रहे में जांच की गई। हमने हाल ही में क्रमिक ischemia मॉडल आगे संशोधित और अधिक ischemia-अतिसंवेदनशील BALB / ग माउस तनाव 23 में इसके प्रभाव का पता लगाया। मॉडल की पहली अभिव्यक्ति में, हम दोनों प्रॉक्सिमल और बाहर और्विक धमनी पर constrictors रखा लेकिन बरकरार सभी पक्ष शाखाओं छोड़ दिया है। एक दूसरे, मामूली संशोधन में, हम केवल समीपस्थ और्विक धमनी पर एक भी कंस्ट्रिकटर रखा जाता है और फिर से बरकरार धमनी के सभी पक्ष शाखाओं छोड़ दिया है। इस मॉडल के दोनों संशोधनों में, हम उस BALB / ग चूहों, लेकिन नहीं C57BL / 6 चूहों पाया है, इसी तरह रक्त प्रवाह और संवहनी घनत्व होने के बावजूद महत्वपूर्ण मांसपेशी नेक्रोसिस का प्रदर्शन किया। हमारे पिछले अध्ययन 14 के लिए इसी प्रकार, इन निष्कर्षों को दिखा दिया है कि अंग पेशीचोट पूरी तरह से रक्त के प्रवाह से प्रभावित नहीं है, लेकिन आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर हिस्से में है। इसके अलावा, हमने पाया कि अंग रक्त के प्रवाह को 3 दिन के भीतर अपनी नादिर पर गिर गया, इस प्रकार मॉडल अधिक 'अर्धजीर्ण' के बजाय धीरे-धीरे अंग ischemia में से एक हो गया लगता है।

इन पूर्व के अध्ययन के आधार पर यह स्पष्ट प्रतीत होता है कि hindlimb ischemia उत्प्रेरण के लिए एक ही तरीका सभी मामलों में उपयुक्त नहीं हो सकता। यह आवश्यक चिरकालिकता और / या सबसे अच्छा करने के लिए hindlimb ischemia की गंभीरता को संशोधित करने के लिए क्योंकि शर्तों (जैसे, आनुवंशिक मतभेद और उपस्थिति या सह-रूग्णता की अनुपस्थिति) प्रभाव दोनों संवहनी और कंकाल की मांसपेशी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की एक किस्म, जांचकर्ताओं को मिल सकता है अपने उद्देश्यों के अनुरूप है। इसके अलावा, मॉडल की पूर्व विवरण आम तौर पर तकनीक के विश्वसनीय अंतर-अन्वेषक reproducibility की सुविधा के लिए उपयुक्त संरचनात्मक स्थलों का अभाव है। इस पत्र में, माउस में या तो तीव्र या अर्धजीर्ण hindlimb ischemia उत्प्रेरण के लिए तरीकेवर्णित हैं, और सटीक संरचनात्मक स्थलों प्रदान की जाती हैं।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों ड्यूक संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार प्रदर्शन किया गया। के रूप में अध्ययन के वैज्ञानिक उद्देश्य के लिए संकेत दिया नर चूहों, इस अध्ययन में इस्तेमाल किया, हालांकि या तो सेक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है किया गया।

1. बालों को हटाने

  1. संज्ञाहरण की प्रेरण करने से पहले, एक पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी एक कवर हीटिंग पैड 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट और एक nosecone isoflurane के सतत प्रवाह से जुड़े बंदरगाह से मिलकर क्षेत्र की स्थापना की।
  2. संज्ञाहरण प्रेरण कक्ष में माउस रखें। 3% - 1 से 1 एल / मिनट और isoflurane हे 2 प्रवाह मीटर सेट।
    नोट: संज्ञाहरण आम तौर पर 2% isoflurane के साथ एक 25 ग्राम माउस में प्रेरित किया है।
  3. धीरे चैम्बर कमाल की है और एक ठीक पलटा की कमी को देख कर माउस के प्रोत्साहन प्रतिक्रिया की जाँच करें।
  4. Isoflurane खोलने से पहले स्पष्ट करने के ओ 2 के साथ चैम्बर फ्लश। जल्दी हीटिंग पी करने के लिए माउस को स्थानांतरितविज्ञापन और nosecone के माध्यम से isoflurane से कनेक्ट।
  5. 1.5% isoflurane समायोजित करें। पेडल पलटा (पैर की अंगुली चुटकी) द्वारा प्रोत्साहन प्रतिक्रिया की जाँच करें।
  6. दोनों आंखों के लिए उदारतापूर्वक नेत्र स्नेहक लागू सर्जरी के दौरान सुखाने से बचने के लिए।
  7. एक छोटी इलेक्ट्रिक trimmer का उपयोग दोनों हिंद अंग से बाल दाढ़ी। त्वचा त्वचा lacerating से बचने के लिए शेविंग जबकि तना हुआ पकड़ो।
  8. पूर्व गर्म बालों को हटाने क्रीम लगाओ और 1 मिनट के लिए बैठते हैं। धीरे से एक सिक्त धुंध पैड का उपयोग कर पोंछ।
  9. बाद में शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के लिए, isoflurane बंद कर देते हैं और एक खाली कागज तौलिया लाइन वसूली पिंजरे के लिए माउस को स्थानांतरित करने के लिए माउस सुनिश्चित करने के लिए पिंजरे बिस्तर aspirate नहीं है। पशु मॉनिटर जब तक यह स्टर्नल लेटना बनाए रखने में सक्षम है। अन्यथा, शल्य चिकित्सा की मेज पर माउस ले जाएँ।
    नोट: बालों को हटाने की प्रक्रिया त्वचा में जलन और छिड़काव माप को प्रभावित कर सकते हैं। पी से पहले जानवर के बालों को हटाने के बाद 2 दिन - यह 1 इंतजार करने के लिए सिफारिश की हैएक पूर्व शल्य छिड़काव स्कैन erforming या सर्जरी प्रदर्शन।

2. पूर्व शल्य चिकित्सा की तैयारी

  1. इस प्रक्रिया के दौरान निम्नलिखित उपकरण का उपयोग करें; लघु सीधे शल्य कैंची, 2 ठीक इत्तला दे दी कोणीय संदंश, छोटे Graefe संदंश, सुई चालक संदंश, 3 retractors, छोटे वसंत कैंची, और ठीक इत्तला दे दी कपास swabs।
  2. एक आटोक्लेव सर्जरी की दीक्षा से पहले का उपयोग कर सभी उपकरण जीवाणुरहित। पहले और एक शल्य प्रक्रिया के बीच एक गर्म मनका अजीवाणु का प्रयोग करें, अप करने के लिए 5 जानवरों के लिए। 5 से बड़े समूहों की सर्जरी के लिए अतिरिक्त शल्य चिकित्सा उपकरण पैकेट जीवाणुरहित।
  3. एक कवर हीटिंग पैड और एक isoflurane बंदरगाह से मिलकर एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र तैयार करें। एक 10 स्टीरियो विच्छेदन खुर्दबीन के तहत सभी काम करते हैं।
  4. Anesthetize और कदम 1.5 करने के लिए 1.1 में वर्णित के रूप में माउस तैयार करते हैं।
  5. जाँच करें कि माउस पूरी तरह से बेहोश है और शल्य चिकित्सा की मेज पर एक लापरवाह स्थिति में जगह है। दोनों पैरों सर्जिकल टेप का उपयोग कर सुरक्षित। </ Li>
  6. एक तापमान नियंत्रित हीटिंग पैड का उपयोग करते हैं, तो तापमान जांच देते हैं और शल्य चिकित्सा टेप का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए कि यह गलती की प्रक्रिया के दौरान बाहर नहीं निकाला जाएगा शल्य चिकित्सा मंच के आधार पर इसे सुरक्षित।
  7. 3 बारी povidone आयोडीन और शराब पोंछे का उपयोग चीरा साइट को साफ करें। एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा के साथ पशु कवर और एक छेद में कटौती चीरा साइट को बेनकाब करने के लिए।

3. अंग ischemia की प्रेरण

  1. औसत दर्जे का जांघ के केंद्र के साथ एक प्रारंभिक चीरा बनाने, पेट की ओर घुटने से चल रहे हैं, और ठीक कैंची (चित्रा 1 ए) के साथ लगभग 1 सेमी चीरा लंबा करने के लिए एक छुरी का प्रयोग करें।

आकृति 1
चित्रा 1. शल्य साइट और माउस hindlimb Ischemia सर्जरी के लिए संवहनी संरचनात्मक स्थलों। (ए) के बाहरी दृश्यलापरवाह स्थिति में एक माउस के hindlimb। रची लाइन चीरा साइट सही hindlimb ischemia प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए (बी) के समीपस्थ माउस hindlimb वाहिका के देखें इंगित करता है।। और्विक धमनी (एफए) के समीपस्थ अंत वंक्षण बंध (IL) के नीचे से उठता है। एफए के बाहर का अंत घुटने की चक्की धमनी (पीए) और saphenous धमनी (एसए) में अपने विभाजन पर स्थित है। एफए के बंद प्रमुख जमानत के धमनियों पार्श्व सिकमफ़्लक्स और्विक धमनी (LCFA), समीपस्थ दुम और्विक धमनी (PCFA), और सतही दुम अधिजठर धमनी (SCEA) कर रहे हैं। ऊरु नस (FV) एफए से सटे चलाता है, और शिरापरक शाखाओं प्रमुख धमनी शाखाओं के समानांतर देखा जा सकता है। तारों (*), ameroid constrictors या संयुक्ताक्षर के स्थान के लिए प्रॉक्सिमल और बाहर साइटों को निरूपित कि क्या अर्धजीर्ण या तीव्र ischemia प्रेरित किया जाएगा पर निर्भर करता है। कृपया सीएलआईयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ सी.के.।

  1. संदंश का प्रयोग, चीरा खोलने के लिए और वंक्षण वसा ऊतक (IFT) कवर झिल्ली बेनकाब।
  2. बंद संदंश का प्रयोग, पियर्स IFT और पेट के बीच अलगाव में झिल्ली के माध्यम से। धीरे पेट की मांसपेशियों से IFT अलग करने के लिए, नीचे neurovascular बंडल उजागर संदंश पर दबाव जारी है। समीपस्थ और महत्वपूर्ण संरचनात्मक स्थलों (चित्रा 1 बी) के रूप में सतही दुम शाखाओं का निरीक्षण करें।
  3. एक प्रतिकर्षक डालें और समीपस्थ ameroid कंस्ट्रिकटर या बंधाव साइट, बस पार्श्व सिकमफ़्लक्स और्विक धमनी (चित्रा 1 बी) को बेनकाब करने के लिए समीपस्थ proximally पेट ऊतक खींच। पार्श्व परिवेष्टक धमनी समीपस्थ और सतही दुम धमनियों के बारे में 5 मिमी समीपस्थ निहित है।
    1. , चीरा के बाहर का भाग में दो और retractors, एक औसत दर्जे का है और एक पार्श्व डालें IFT distally से दूर खींचने के लिएशल्य साइट शल्य चिकित्सा क्षेत्र को चौड़ा करने के लिए।
  4. neurovascular बंडल को कवर सबसे बाहरी झिल्ली को दूर करने के लिए दो ठीक संदंश का प्रयोग करें। धीरे नस और धमनी के बीच ठीक संदंश टिप के एक आधे डालें, झिल्ली कि उन्हें एक साथ बांधता तहत संदंश टिप फिसलने। संदंश बंद करो और धीरे झिल्ली फाड़ दूर।
  5. नस और धमनी के बीच एक बंद संदंश की नोक डालें और संदंश पर दबाव जारी करके उन दोनों के बीच एक खाई पैदा करते हैं। धमनी और तंत्रिका के बीच एक खाई पैदा करने के लिए इस तकनीक को दोहराएँ।
  6. अर्धजीर्ण अंग ischemia के लिए, समीपस्थ और्विक धमनी (चित्रा 2) पर एक ameroid कंस्ट्रिकटर जगह है।
    1. समीपस्थ ameroid कंस्ट्रिकटर को स्थापित करने के neurovascular बंडल से इसे अलग करने और्विक धमनी के तहत एक संदंश की नोक स्लाइड। कंस्ट्रिकटर के किनारे पकड़ के लिए angled- संदंश की एक दूसरे सेट का प्रयोग करें और और्विक धमनी के तहत यह गाइड।
    2. रों में और्विक धमनी निर्धारित करनाकंस्ट्रिकटर में बहुत कुछ है। बाहर का कंस्ट्रिकटर के लिए दोहराएँ, इसे तुरंत घुटने की चक्की धमनी और saphenous धमनी (चित्रा 2) में और्विक धमनी के विभाजन के लिए समीपस्थ पोजीशनिंग।

चित्र 2
चित्रा 2. Ameroid constrictors और Ligatures की नियुक्ति। (ए) के दो ameroid अर्धजीर्ण hindlimb ischemia के लिए प्रेरित करने के और्विक धमनी पर रखा constrictors का उदाहरण है। समीपस्थ कंस्ट्रिकटर पार्श्व सिकमफ़्लक्स और्विक धमनी (LCFA) के लिए सिर्फ समीपस्थ रखा गया है। बाहर का कंस्ट्रिकटर घुटने की चक्की (पीए) और saphenous धमनियों (एसए) के विभाजन के लिए सिर्फ समीपस्थ रखा गया है। Constrictors (बी) और्विक धमनी के संयुक्ताक्षर का उदाहरण तीव्र hindlimb ischemia के लिए प्रेरित करने के साथ धमनी सुनिश्चित करने के लिए सामना करना पड़ रहा स्लॉट ठीक से कंस्ट्रिकटर के भीतर निर्धारित है स्थापित कर रहे हैं।। Ligatures (पीले तीर) इस तरह रखा जाता है कि वे पैनल (बी) में constrictors की स्थिति पार्श्व, और और्विक धमनी दो संयुक्ताक्षर (तारक) के प्रत्येक सेट के बीच transected है। बार, 1 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. तीव्र अंग ischemia के लिए, ligate और समीपस्थ और्विक धमनी आड़ा काट।
    1. और्विक धमनी आड़ा काट करने के लिए, धागा 7 - धमनी सिर्फ समीपस्थ कंस्ट्रिकटर के पद पर समीपस्थ तहत हे सिवनी और Ligate (3.7 चरण देखें)। 1 मिमी पहली करने के लिए बाहर के बारे में एक दूसरे संयुक्ताक्षर बाँधो।
    2. दो संयुक्ताक्षर के बीच धमनी आड़ा काट करने के लिए वसंत कैंची का प्रयोग करें। बाहर का धमनी transection के लिए, इन चरणों को दोहराएँ, घुटने की चक्की धमनी और saphenous धमनी में अलग, बस और्विक धमनी के विभाजन के लिए समीपस्थ 1 मिमी के बारे में दो संयुक्ताक्षर रखकर लेकिन यह सुनिश्चित करना है कि वे सतही caud के लिए बाहर हैंअल अधिजठर धमनी (चित्रा 1 देखें)
  2. हे vicryl टांके - चीरा बंद का उपयोग कर 5 बाधित।

4. छिड़काव इमेजिंग

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस हीटिंग पैड लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजर (LDPI) के नीचे स्थापित करने के लिए माउस ले जाएँ और isoflurane स्रोत के लिए एक nosecone के माध्यम से कनेक्ट। माउस 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने के लिए तो कोई तापमान पर नजर रखने के लिए उपलब्ध है, 5 मिनट के लिए अनुमति देते हैं।
  2. इमेजर चालू करें और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर लांच।
  3. 'स्कैनर सेटअप' विंडो खोलने के लिए 'नई एकल छवि' आइकन पर क्लिक करें। '4 एमएस / पिक्सेल' के लिए 'बड़े' और 'स्कैन गति' के लिए 'स्कैन आकार' सेट करें। 'स्कैन क्षेत्र (यूनिट)' फलक के तहत एक्स और वाई मूल्यों को बदलने के द्वारा स्कैन क्षेत्र सेट करें।
  4. वीडियो फ़ीड देखने के लिए 'वीडियो और दूरी' टैब पर क्लिक करें और माउस स्कैन क्षेत्र एक लाल रूपरेखा ने संकेत में फिट करने की व्यवस्था। जांचना के लिए क्लिक करें 'ऑटो दूरी'विषय के लिए लेजर से दूरी। 'अगला' 'विषय विवरण' विंडो खोलने के लिए क्लिक करें।
  5. विषय में जानकारी है और किसी भी प्रासंगिक टिप्पणियां दर्ज करें। स्कैनिंग खिड़की करने के लिए पर स्थानांतरित करने के लिए 'अगला' बटन पर क्लिक करें।
  6. 'पुष्टि या ओवरराइड स्कैन दूरी' खुला संवाद करने के लिए 'आरंभ मापन' बटन पर क्लिक करें। दूरी स्कैन पुष्टि करने के लिए क्लिक करें 'ठीक है'। निरीक्षण स्कैनिंग की प्रक्रिया शुरू करते हैं और 4 के लिए चलाने - स्कैन क्षेत्र के आकार के आधार पर 8 मिनट।
  7. स्कैनिंग के बाद पूरा हो, 'इस रूप में सहेजें' विंडो निरीक्षण करते हैं। फ़ाइल नाम और इसे बचाने के लिए।
  8. isoflurane बंद करो और एक खाली वसूली पिंजरे के लिए माउस ले जाने और जब तक पशु स्टर्नल लेटना बनाए रखने में सक्षम है की निगरानी। कभी अन्य चूहों के साथ एक पिंजरे में एक माउस संज्ञाहरण से उबरने के लिए जगह है।
  9. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें। आइकन 'ओपन' पर क्लिक करें और के लिए ब्राउज़ करें और विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइल को खोलने के। फ़ाइल खिड़की पर, प्रवाह का निरीक्षण,तस्वीर, और रंग माउस की छवियों।
  10. प्रवाह छवि पर ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए, 'शो ROIs' आइकन पर क्लिक करें। अगला 'जोड़े बहुभुज' बटन पर क्लिक करें और रॉय आकर्षित करने के लिए गैर सर्जिकल अंग के आसपास कर्सर खींचें। आकार बंद करने के लिए राइट क्लिक करें। फिर 'बहुभुज जोड़ें' और शल्य चिकित्सा अंग के आसपास एक मेल रॉय आकर्षित चयन करें।
  11. 'छवि ROIs आँकड़ा परिणाम (पु)' विंडो खोलने के लिए 'सांख्यिकी' आइकन पर क्लिक करें। 'फ्लक्स%' कॉलम में प्रवाह में प्रतिशत के अंतर को ध्यान से देखें।
    नोट: पहली रॉय तैयार संदर्भ के रूप में काम करेगा।
    नोट: प्रत्येक बाद छिड़काव स्कैन करने से पहले और कदम धारा 1 में उल्लिखित माउस anesthetize का पालन करने के कदम की छवि 4.11 करने के लिए 4.1 जानवर में।

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Representative Results

माउस hindlimb वाहिका की उचित पहचान के रूप में यहाँ वर्णित है, दोनों अर्धजीर्ण और तीव्र hindlimb ischemia उत्प्रेरण के लिए तकनीक के reproducibility सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। भिन्नता जानवरों के अध्ययन में निहित करने के अलावा, अन्य कारकों लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग (LDPI) में परिवर्तनशीलता लागू कर सकते हैं, संज्ञाहरण के प्रकार, (प्रवण लापरवाह बनाम) जानवर की स्थिति, और शरीर का तापमान (चित्रा 3 देखें) भी शामिल है। इसके अलावा, अर्धजीर्ण hindlimb ischemia मॉडल ameroid constrictors, जो व्यापक रूप से एक दिया बैच के भीतर भिन्न हो सकते हैं की गुणवत्ता पर निर्भर है (चित्रा 4 देखें)। इन मुद्दों में से प्रत्येक प्रवाह LDPI द्वारा मापा के quantitation पर काफी प्रभाव हो सकता है और नीचे और अधिक विस्तार में चर्चा कर रहे हैं।

अर्धजीर्ण hindlimb ischemia मॉडल या बंधाव में ameroid constrictors के प्लेसमेंट के बादऔर तीव्र hindlimb ischemia मॉडल में और्विक धमनी की transection, LDPI छवियों तुरंत बाद operatively प्राप्त किया जाना चाहिए, जबकि अभी भी पशु शल्य चिकित्सा के प्रभाव का प्रदर्शन और (चित्रा 5) छिड़काव की एक आधारभूत पोस्ट ऑपरेटिव स्तर पर स्थापित करने के लिए anesthetized है। छिड़काव के quantitation इस्कीमिक hindlimb के आसपास ब्याज (आरओआई) के एक क्षेत्र और गैर इस्कीमिक hindlimb के चारों ओर एक तुलनीय रॉय ड्राइंग द्वारा किया जाता है। छिड़काव सबसे अधिक गैर इस्कीमिक अंग में है कि इस्कीमिक अंग में छिड़काव के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है, और इस अनुपात में बदलाव के समय पर मापा जाता है। हम जानवर आंदोलन और अगले करने के लिए एक समय बिंदु से पैरों की स्थिति में परिवर्तन के कारण कम परिवर्तनशीलता में प्रवण स्थिति परिणामों में है कि इमेजिंग चूहों पाया है। इसके अलावा, जांघ के ऊपरी हिस्से में छिड़काव जब चूहों लापरवाह स्थिति में हैं और अधिक चर हो जाता है। hindlimb छिड़काव का एक पूरा नुकसान तीव्र अंग के शामिल होने के बाद मनाया जाना चाहिएischemia, (चित्रा 5) जबकि केवल छिड़काव में एक हल्के कमी आम तौर पर अर्धजीर्ण मॉडल में ameroid constrictors की नियुक्ति के बाद मनाया जाता है। कुछ मामलों में, हम छिड़काव के एवज में नाटकीय नुकसान तुरंत बाद operatively के साथ तेजी से कंस्ट्रिकटर रोड़ा मनाया गया है।

चित्र तीन
चित्रा 3. छिड़काव इमेजिंग में रूपांतर hindlimb स्थिति और एक एकल BALB / ग माउस के शरीर का तापमान। लेजर डॉपलर छिड़काव छवियों के आधार पर, 35 डिग्री सेल्सियस, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5% isoflurane साथ anesthetized और दोनों लापरवाह और प्रवण स्थिति में स्कैन, और 38 डिग्री सेल्सियस। isoflurane संज्ञाहरण के साथ, जानवर के hindlimbs, एक विरूपण साक्ष्य (क्षैतिज लाइनों) होने का खतरा है कि छवियों की तुलना में लापरवाह पर अधिक आवृत्ति के साथ मनाया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप में श्वसन के साथ स्थानांतरित करने के लिए करते हैं। प्रवण स्थिति में, यह सटीक कोण को पुन: पेश करने के लिए बहुत आसान हैपैरों की, और अधिक सटीक समय के साथ छिड़काव की मात्रा का ठहराव बना रही है। छिड़काव काफी हद तक कम हो जाता है के रूप में शरीर का तापमान 37 डिग्री सेल्सियस से नीचे चला जाता है, जबकि छवियों उच्च तापमान पर संतृप्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध परिवर्तनशीलता Ameroid constrictors (ए) एक आदर्श 0.25 मिमी भीतरी व्यास (दो सिरों वाले तीर) वर्दी स्लॉट आकार और मोटाई कैसिइन (बी - डी) के साथ कंस्ट्रिकटर का एक उदाहरण है।। स्लॉट आकार भिन्नता के उदाहरण हैं। स्लॉट कभी कभी एक 'डी' आकार (बी और सी) या 'बी' आकृति (डी) प्रदर्शित कर सकता है। इन मामलों में, कैसिइन काफी समान रूप से वितरित किया जाता है और स्लॉट काफी गहरे हो रहे हैंएलडी धमनी। (ई) असमान कैसिइन मोटाई का एक उदाहरण है। इस कंस्ट्रिकटर खारिज कर दिया जाएगा। (एफ) एक स्लॉट वह भी कसना दौरान जगह में धमनी धारण करने के लिए उथले है का एक उदाहरण है। इस कंस्ट्रिकटर भी खारिज किया। जाएगा यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. छिड़काव छवियाँ तुरंत Subacute या तीव्र hindlimb ischemia के प्रेरण के बाद। BALB / ग चूहों कि बाएं और्विक धमनी पर दो ameroid constrictors के स्थान आया है अर्धजीर्ण hindlimb ischemia या प्लेसमेंट के लिए प्रेरित करने के दोनों लापरवाह और प्रवण स्थिति में प्रतिनिधि छिड़काव छवियों दो संयुक्ताक्षर और छोड़ दिया और्विक धमनी की transection की तीव्र hindlimb ischemia प्रेरित करने के लिए। ध्यान दें कि perfusioएन, कम हो जाता है, लेकिन अभी भी ameroid कंस्ट्रिकटर नियुक्ति के बाद detectable जबकि अनिवार्य रूप से कोई प्रवाह के बाद और्विक धमनी के दोहरे बंधाव / transection तुरंत पता लगाया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

शायद इस प्रक्रिया में सबसे चुनौतीपूर्ण कदम ऊरु नस से और्विक धमनी की जुदाई है। बड़ा व्यास और धमनी के उन लोगों की तुलना में ऊरु नस की पतली दीवारों पंचर करने के लिए अपनी संवेदनशीलता को बढ़ाने और शल्य चिकित्सा हेरफेर के दौरान फाड़। नस में खलल न डालें की संभावना घाव नम रखते हुए एक बाँझ झाड़ू पीबीएस के साथ सिक्त का उपयोग करके कम किया जा सकता है। यह भी सुनिश्चित करें कि सभी संदंश, तेज कर रहे हैं गठबंधन, और आदेश वाहिकाओं और आसपास के ऊतकों की सटीक हेरफेर अनुमति देने के लिए टूट की मुक्त महत्वपूर्ण है। घटना है कि खून बह रहा हो करता है, बाँझ धुंध के साथ क्षेत्र के लिए दबाव लागू जब तक खून बह रहा बंद कर दिया है। विस्तृत शल्य चिकित्सा नोट्स, प्रत्येक जानवर के लिए बनाए रखा जाना चाहिए के रूप में क्या 'नाबालिग' खून बह रहा घटनाओं के रूप में माना जा सकता है लंबी अवधि में एक अनजाने अधिक गंभीर इस्कीमिक चोट का प्रतिनिधित्व कर सकते। डेटा स्थिरता के लिए, सर्जरी कोई शिरापरक या जमानत के धमनी खून से जुड़ेआईएनजी घटनाओं महत्वपूर्ण हैं।

इस तकनीक की एक सीमा है कि गंभीरता और / या ischemia (अर्धजीर्ण ameroid कंस्ट्रिकटर मॉडल में) की शुरुआत के लिए व्यापक रूप से कई कारकों पर निर्भर करता है भिन्न हो सकते है। समीपस्थ कंस्ट्रिकटर / बंधाव साइट का निर्धारण करेगा कि कितने जमानत के धमनियों ischemia की प्रेरण से प्रभावित हैं। बरकरार कम, जमानत शाखाओं को छोड़कर चोट की गंभीरता कुछ आनुवंशिक पृष्ठभूमि में भी मामूली से पशुओं में कुछ संदर्भों, अर्थात् में यद्यपि के रूप में उल्लेख किया, अर्धजीर्ण ischemia पर्याप्त ऊतक परिगलन 23 का कारण बन सकता है। इसके अलावा, एक दूसरे, बाहर का कंस्ट्रिकटर या संयुक्ताक्षर के अलावा दोनों तीव्र और अर्धजीर्ण मॉडल 23 में छिड़काव में कमी होगी। कुछ जांचकर्ताओं ligated या एक electrocautery इस्तेमाल किया पार्श्व परिवेष्टक धमनी, समीपस्थ दुम और्विक धमनी, और सतही दुम अधिजठर धमनी 24 बंद जमानत के शाखाओं काटकर अलग करने के लिए है। यह और अधिक गंभीर ischemia एक में यह परिणामएन डी अधिक से अधिक मांसपेशियों की चोट उत्पन्न हो सकता है, हालांकि यह भी आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर निर्भर करता है। यह नोट करना विद्युतदहनकर्म अधिक आसपास के ऊतकों को चोट में परिणाम की संभावना हो सकती है और इसलिए सावधानी से किया जाना चाहिए कि महत्वपूर्ण है।

इन चर के प्रकाश में, यह है कि नाड़ी शरीर रचना सही रोड़ा की साइट का चयन करने से पहले पहचान की है महत्वपूर्ण है। कोच्चि एट अल। 25 के नाम और माउस hindlimb में रक्त वाहिकाओं के स्थानों के बारे में कई रिपोर्टों के बीच आम सहमति की एक उल्लेखनीय कमी का उल्लेख किया है, और वे हमें विश्वास है कि किसी को भी इस उपक्रम के लिए एक अनिवार्य गाइड है धमनी शरीर रचना विज्ञान के एक बहुत विस्तृत विवरण प्रदान की है प्रक्रिया। इस पत्रिका में एक पहले प्रकाशन तीव्र अंग ischemia 13 उत्प्रेरण के लिए तकनीक का प्रदर्शन किया, कि रिपोर्ट में हालांकि संवहनी संरचनात्मक स्थलों अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे थे। इस रिपोर्ट का एक महत्वपूर्ण लक्ष्य एक बेहतर दृश्य प्रतिनिधित्व ओ प्रदान किया गयातकनीक अर्धजीर्ण अंग ischemia का उपयोग करने का एक संशोधन का प्रदर्शन करने के अलावा उन स्थलों च।

इस दृष्टिकोण का एक अतिरिक्त सीमा है कि अर्धजीर्ण ischemia मॉडल में ischemia की शुरुआत ameroid constrictors एक का उपयोग करता है की गुणवत्ता का एक समारोह है। हमने पाया है कि वाणिज्यिक constrictors गहराई और उनके आंतरिक स्लॉट के आकार (चित्रा 4) में भिन्न हो सकते हैं। अगर स्लॉट भी उथले है धमनी कसना दौरान निकाला जा सकता है। फटा कैसिइन या विकृत स्लॉट के साथ constrictors खारिज किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, कंस्ट्रिकटर के भीतर कैसिइन के असंगत वितरण रोड़ा के त्वरित दर में परिणाम कर सकते हैं। आकार और चूहों की उम्र में एक और महत्वपूर्ण कारक 'वयस्क' चूहों में पोत के आकार के रूप में विचार करने के लिए 8 की उम्र और उम्र के 30 सप्ताह के बीच काफी भिन्न हो सकते है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जब चूहों के कई स्वतंत्र साथियों का उपयोग कर डेटा सेट उत्पन्न करने के लिए, जाहिरा तौर पर smal के रूप मेंएल आयु सीमा नहीं है (जैसे, 10 - 16 सप्ताह) रोड़ा और इस्कीमिक अंग चोट की गंभीरता का असंगत दरों में हो सकता है।

लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग की मात्रा भी व्यापक रूप से पशु के शरीर का तापमान और स्थिति (चित्रा 4) के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, साथ ही संवेदनाहारी एजेंट इस्तेमाल किया। ऐसा नहीं है कि माउस छिड़काव इमेजिंग के दौरान एक 37 डिग्री सेल्सियस शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है। तापमान अधिक से अधिक 37 डिग्री सेल्सियस है, तो छिड़काव छवि संतृप्त कर दिया जाएगा। तापमान 36 डिग्री सेल्सियस से नीचे है तो छिड़काव संकेत भी कमजोर हो सकता है। यह भी दोनों पैरों के रूप में संभव के रूप में सममित रखने के लिए एक सटीक छिड़काव अनुपात (इस्कीमिक अंग में छिड़काव कि गैर इस्कीमिक अंग में की तुलना में) प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। हालांकि चूहों अक्सर लापरवाह जबकि झूठ बोल imaged हैं, समरूपता इस स्थिति में बनाए रखने के लिए कठिन हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग क्षेत्र के बेहतर भाग में रक्त के प्रवाह में बदलाव, यानी, जनसंपर्कoximal जांघ, quantitation में परिवर्तनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं। इसके अलावा, isoflurane के साथ संज्ञाहरण अक्सर वृद्धि छाती आंदोलन है, जो बारी में संकेत LDPI द्वारा प्राप्त में पैर आंदोलन और परिवर्तनशीलता का कारण बनता में यह परिणाम है। हमने पाया है कि प्रवण स्थिति में पशुओं को रखने के लिए और अधिक अंग समर्थन देता है, यह आसान स्थिति और बहुत कम आंदोलन है, जो अंग छिड़काव (चित्रा 5) की अधिक मात्रा का ठहराव प्रतिलिपि प्रस्तुत करने में जो परिणाम के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रवण स्थिति 37 डिग्री स्कैन अंगों में C, तापमान, (चित्रा 5) जो भी quantitation के reproducibility बढ़ाता की अधिक सुसंगत रखरखाव की सुविधा। isoflurane की तुलना में, ketamine प्रदर्शन के साथ anesthetized चूहों छाती आंदोलन में कमी आई है, लापरवाह इमेजिंग कम चर कर रही है। हालांकि, ketamine भी संज्ञाहरण प्रेरण और वसूली समय में वृद्धि होगी, काफी बढ़ पूर्ण छिड़काव में जिसके परिणामस्वरूप 16 महत्व देता है। शरीर की स्थिति और anest के प्रत्येक संयोजनhetic एजेंट एक अलग छिड़काव की छवि मूल्य पैदा कर सकते हैं, इस प्रकार यह सब बाद छिड़काव माप भर में इन तरीकों में से प्रत्येक के लिए एक सुसंगत तकनीक का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यह इस तकनीक के कई अन्य सीमाओं पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि मॉडल अक्सर ऐसे मोटापा, कोलेस्ट्रॉल, atherosclerosis, मधुमेह हो सकता है, या अन्य कारकों के रूप में किसी भी comorbidities, कि रोग की संभावना अधिक होती बिना चूहों में किया जाता है, अंग ischemia के शामिल होने के लिए पूरी तरह से नैदानिक ​​पैड की विकृति को दोहराने कभी नहीं होगा। बताया गया है, तीव्र अंग ischemia के प्रभाव, वृद्ध मधुमेह, और hypercholesterolemic चूहों में मूल्यांकन किया गया है, और भविष्य में यह अर्धजीर्ण अंग ischemia के लिए प्रतिक्रियाओं पर इन comorbid शर्तों के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए उपयोगी हो जाएगा। इसके अलावा, क्योंकि पैड एक पुरानी बीमारी है, यहां तक ​​अर्धजीर्ण अंग ischemia है नैदानिक ​​परिदृश्य के एक अपूर्ण मॉडल है। इसलिए, यह मॉडल विकसित करने के लिए जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण होगा किसच पुरानी अंग ischemia में परिणाम और उन्हें हृदय जोखिम कारकों के मॉडल के साथ संयोजन के रूप में परीक्षण करने के लिए। लेजर डॉपलर इमेजिंग साधन के एक तकनीकी सीमा पशु मॉडल की परवाह किए बिना इस्तेमाल किया जा रहा है इसलिए यह एक दिया जानवर के भीतर रक्त के प्रवाह में रिश्तेदार परिवर्तन तुलना करने के लिए ही इस्तेमाल किया जा सकता है, कि यह उपाय रक्त प्रवाह वेग और न पूर्ण ऊतक छिड़काव है। विशेष रूप से, ischemia कि अंग हानि का कारण बनता रक्त के प्रवाह को 23 में परिवर्तन की परवाह किए बगैर एक कम छिड़काव अनुपात में परिणाम होगा।

सारांश में, हम कंकाल की मांसपेशी और नाड़ी remodeling पर प्रभाव का विश्लेषण करने के प्रयोजन के लिए चूहों में तीव्र और अर्धजीर्ण हिंद अंग ischemia उत्प्रेरण के लिए विस्तृत तरीके प्रदान करते हैं। विशेष ध्यान देने की सटीक अंतर और मॉडल की अंतर-ऑपरेटर reproducibility की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण संवहनी स्थलों की पहचान करने के लिए दिया जाता है। तकनीक के आगे शोधन अंततः एक पुरानी ischemia मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं कि सहीLy नैदानिक ​​पैड के रोगजनन दोहराता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35 Dumoxel
Dumont Style 5 Mini Forceps Fine Science Tools 11200-14 Inox
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
7 - 0 Silk Suture Sharpoint DA-2527N
5 - 0 Coated Vicryl Suture Ethicon J463G
Graefe Forceps Fine Science Tools 11053-10
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
Artifical Tears Ointment Rugby Laboratories 0536-6550-91
Surgical Tape 3M 1530-0
Fine Cotton Swabs Contec SC-4
Temperature Controller Physitemp TCAT-2DF
Ameroid Constrictors Research Instruments SW MMC-0.25 x 1.00-SS
Hot Bead Sterilizer
Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific 39DP
Needle Driver Fine Science Tools
Phosphate Buffered Saline  Gibco 10010-023
Moor LDPI Moor Instruments moorLDI2
moorLDI Measurement software Moor Instruments v. 6.0
Hair Removal Cream Nair

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References

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चिकित्सा अंक 112 ischemia परिधीय धमनी रोग angiogenesis कंकाल की मांसपेशी उत्थान atherosclerosis संवहनी सर्जरी माउस hindlimb ameroid कंस्ट्रिकटर
तीव्र और subacute Murine hindlimb ischemia के लिए तरीके
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Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for Acute and Subacute Murine Hindlimb Ischemia. J. Vis. Exp. (112), e54166, doi:10.3791/54166 (2016).

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