Abstract
Perifer artärsjukdom (PAD) är en ledande orsak till kardiovaskulär morbiditet och mortalitet i de utvecklade länderna, och djurmodeller som tillförlitligt reproducera den mänskliga sjukdomen är nödvändigt att utveckla nya terapier för denna sjukdom. Musen bakdelen ischemi modell har använts i stor utsträckning för detta ändamål, men det praxis att inducera akut ischemi genom ligation av femoralartären kan innebära en betydande vävnadsnekros, äventyra utredare förmåga att studera de vaskulära och skelettmuskulaturen vävnad svar på ischemi . Ett alternativt tillvägagångssätt för lårbensartären ligering är bildning av grad femoralisartärocklusion genom användningen av ameroid constrictors. När den placeras runt lårbensartären i samma eller olika ställen som ställena för lårbensartären ligering, dessa anordningar ockludera artären över 1 - 3 dagar, vilket resulterar i mer gradvis, subakut ischemi. Detta resulterar i mindre omfattande skelettmuskelvävnaden nekros, which kan närmare härma de svar som ses i humant PAD. Eftersom genetisk bakgrund påverkar utfall i både akuta och subakuta ischemi modeller, varvid hänsyn till musstam studerats är viktigt att välja den bästa modellen. Detta dokument beskriver ett korrekt sätt och anatomisk placering av ligaturer eller ameroid constrictors på musen lårbensartären för att inducera subakut eller akut bakdelen ischemi i musen.
Introduction
Perifer artärsjukdom (PAD) är en ledande orsak till kardiovaskulär morbiditet och mortalitet i de utvecklade länderna 1. PAD resultat från aterosklerotisk obstruktion av de perifera artärerna som leder till ischemi med resulterande ansträngning eller vila smärta och ibland icke-läkande sår och kallbrand som kräver lem amputation. Terapier inriktade PAD riktas främst mot endovaskulär två eller kirurgisk revaskularisering 3, som i huvudsak inga effektiva medicinska behandlingar finns fyra.
Tyvärr är revaskularisering ofta av begränsad nytta, eftersom bypasstransplantat har hög felfrekvens (upp till 50% inom 5 år) 5 som är värre i vissa populationer (t.ex. rökare, kvinnor, icke-vena ventransplantat) 6,7. Endovaskulära metoder, såsom angioplastik och stentning är också äventyras av höga restenosfrekvensen (över 50% inom ett år), speciellt in femoropopliteal sjukdom 8, även om användningen av läkemedelseluerande ballonger och stentar har förbättrat resultat något 9-11. För att utveckla nya behandlingar för PAD är det viktigt att utveckla djurmodeller som på ett tillförlitligt sätt återge den mänskliga sjukdomen.
Hittills är den vanligaste modellen av PAD det bakdelen ischemi modellen (HLI), som oftast utförs på möss 12,13. I sin vanligaste manifestationen, innebär modellen kirurgisk ligering av de proximala och distala lårbensartären och dess mellanliggande sidogrenar följt av excision av kärlet, vilket resulterar i tilltäppning av blodflöde och induktion av akut ischemi i extremiteterna. HLI har främst använts för att studera angiogena och arteriogen svar i perifert lem muskelvävnad och effekterna av olika behandlingar (t.ex. droger, gentillförsel stamceller) på dessa svar. På senare tid har vår grupp använt denna modell för att undersöka betydelsen av skelettmuskelceller in svaret på ischemi och effekterna av genetiska skillnader på resultaten 14.
Den HLI modellen har underlättat vår nuvarande förståelse för att de vaskulära och muskel svar på ischemi är beroende av genetik (dvs. inavlad stam) 15, 16 år, och närvaron eller frånvaron av andra sjukdomar eller tillstånd som är relevanta för åderförkalkning, däribland diabetes mellitus 17 och hyperkolesterolemi 18. Emellertid är en viktig svaghet i den traditionella HLI modellen att det är en modell av akut ischemi i extremiteterna 12,13, medan human PAD orsakar kronisk ischemi som ett resultat av den gradvisa utvecklingen av ocklusiva aterosklerotiska lesioner i de perifera artärerna.
I ett försök att kringgå denna svaghet, Tang och kollegor ursprungligen utvecklades en råttmodell av gradvis lårbens artärocklusion med hjälp ameroid constrictors 19, och samma grupp därefter developed en liknande musmodell 20. Ameroid constrictors beskrevs ursprungligen på 1950-talet i en hundmodell av kronisk myokardischemi 21,22. Dessa anordningar har en yttre metallhylsa som omsluter ett inre skikt av ett hygroskopiskt material, vanligtvis kasein, och när den är placerad runt en artär de inducerar gradvis kärlocklusion eftersom de absorberar fukt från de omgivande vävnaderna. I sin modifikation av modellen, Yang et al. Placerade konstriktorer på både de proximala och distala lårbensartären vid ställen som är analoga med de kirurgiska ligeringsprodukterna webbplatser, och de ligerades sido grenar av lårbensartären, såsom i den traditionella modellen. Jämfört med akut HLI, ameroid constrictor-inducerad ischemi resulterade i lägre expression av inflammatoriska och skjuvspänning-beroende gener, lägre blodflödes återhämtning 4 - 5 veckor postoperativt, och mindre muskel nekros 20. Baserat på dessa observationer, ansåg man att gradvis artärocklusion kan ge en modell av PAD mer relevant för den mänskliga sjukdomen.
Särskilt i den ursprungliga rapporten, har effekterna av ameroid constrictor-inducerad ischemi undersöktes endast i C57BL / 6 möss 19, som är relativt motståndskraftiga mot ischemi-inducerad muskel nekros 15. Vi ändrade nyligen gradvis ischemi modellen ytterligare och utforskas dess effekter i mer ischemi-mottagliga BALB / c-mus stam 23. I den första manifestationen av modellen, placerade vi constrictors på både den proximala och distala lårbensartären men lämnade alla sidogrenar intakt. I en andra, mildare modifiering, placerade vi en enda constrictor endast på den proximala lårbensartären och återigen lämnat alla sido grenar av artären intakt. I båda modifieringar av denna modell, fann vi att BALB / c-möss, men inte C57BL / 6 möss, visade betydande muskel nekros trots liknande blodflödet och vaskulär densitet. I likhet med vår tidigare studie 14, visade dessa resultat att lem muskelskada inte enbart påverkas av blodflödet, men är delvis beroende på genetisk bakgrund. Dessutom fann vi att lem blodflödet föll till sin nadir inom 3 dagar, alltså modellen tycks vara mer en av "subakut" snarare än gradvis ischemi.
Baserat på dessa tidigare studier, förefaller det uppenbart att en enda metod för att inducera bakdelen ischemi kanske inte passar i alla fall. Eftersom en rad olika tillstånd (t.ex. genetiska skillnader och närvaro eller frånvaro av komorbida förhållanden) påverkar både vaskulära och skelettmuskelspecifika svar, kan utredarna tycker att det är nödvändigt att modifiera kronicitet och / eller svårighetsgraden av bakdelen ischemi till bästa passar deras syften. Dessutom tidigare beskrivningar av modellen typiskt saknade lämpliga anatomiska landmärken för att underlätta tillförlitlig mellan utredare reproducerbarhet tekniken. I detta papper, förfaranden för inducering antingen akut eller subakut bakbens ischemi hos musbeskrivs, och exakta anatomiska landmärken är anordnade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurexperiment utfördes enligt protokoll som godkänts av Duke Institutional Animal Care and Use Committee. Hanmöss användes i denna studie, även om båda könen kan användas enligt vad som anges för den vetenskapliga syftet med studien.
1. Hårborttagning
- Före induktion av anestesi, inrätta en pre-kirurgisk förberedelse område som består av en täckt värmedyna inställd på 37 ° C och en noskon port ansluten till kontinuerligt flöde av isofluran.
- Placera musen i anestesi induktion kammare. Ställa in O 2 flödesmätaren till en L / min och isofluran till 1 - 3%.
OBS: Anestesi typiskt induceras i en 25 g mus med 2% isofluran. - Kontrollera musens stimulanssvar genom att försiktigt gungande kammaren och observera en brist på en rätande reflex.
- Spola kammaren med O 2 för att rensa isofluran innan den öppnas. Snabbt flytta musen till värme pannons och anslut den till isofluran via noskonen.
- Justera isofluran till 1,5%. Kontrollera stimulanssvar genom pedal reflex (toe nypa).
- Applicera oftalmisk smörjmedel frikostigt på båda ögonen för att undvika uttorkning under operation.
- Raka håret från båda bakbenen med hjälp av en liten elektrisk trimmer. Håll huden spänd under rakningen att undvika lacerating huden.
- Applicera förvärmda hårborttagningskräm och låt sitta i en minut. Torka försiktigt bort med hjälp av en fuktad kompress.
- För kirurgiskt ingrepp vid ett senare tillfälle, stänga av isofluran och flytta musen till en tom pappershandduk kantade återhämtning buren för att säkerställa att musen inte aspirera buren sängkläder. Övervaka djuret tills den kan bibehålla sternala VILA. Annars flyttar musen till operationsbordet.
OBS: hårborttagning processen kan irritera huden och påverka perfusionsmätningar. Det rekommenderas att vänta 1 - 2 dagar efter avlägsnande av djurets hår innan performing en pre-kirurgisk perfusion skanning eller utför operationen.
2. Pre-Kirurgisk förberedelse
- Använd följande verktyg under denna procedur; små raka kirurgisk sax, 2 spetsig vinklade pincett, små Graefe pincett, nål förare pincett, 3 upprullningsdon, liten fjäder sax och spetsig tops.
- Sterilisera alla verktyg med en autoklav före initieringen av operationen. Använd en varm pärla autoklav före och mellan varje kirurgiskt ingrepp, för upp till 5 djur. Sterilisera ytterligare kirurgiska verktygspaket för operationer av grupper större än fem.
- Förbered en steril operationsområdet består av en täckt värmedyna och en isofluran port. Utför allt arbete under 10 stereo dissektion mikroskop.
- Söva och förbereda musen som beskrivs i steg 1,1 till 1,5.
- Kontrollera att musen är helt sövd och placera i ryggläge på operationsbordet. Fäst båda benen med hjälp av kirurgisk tejp. </ Li>
- Om du använder en temperaturstyrd värmedyna, fäst temperatursensorn och fäst den till basen av den kirurgiska plattform med hjälp av kirurgtejp för att säkerställa att det inte kommer att av misstag dras ut under förfarandet.
- Rengör snittet platsen med hjälp av tre alternerande povidonjod och spritkompresser. Täck djuret med en steril operationshandduk och skär ett hål för att exponera snittstället.
3. Induktion av ischemi i extremiteterna
- Använda en skalpell för att göra en första snitt längs mitten av det mediala låret, som löper från knäet mot buken, och förlänga incisionen till cirka 1 cm med fina saxar (Figur 1A).
Figur 1. operationsområdet och Vascular Anatomiska landmärken för Mouse bakdelen ischemi kirurgi. (A) External view avden bakdelen av en mus i ryggläge. Den streckade linjen visar snittet plats för att utföra de bakdelen ischemi förfaranden. (B) Vy över den proximala mus bakbenen kärl. Den proximala änden av lårbensartären (FA) uppkommer ur nedanför det inguinala ligamentet (IL). Den distala änden av FA är belägen vid dess bifurkation in i popliteal artär (PA) och vena artär (SA). De stora kollaterala artärer off av FA är den laterala cirkumflex lårbensartären (LCFA), den proximala kaudala lårbensartären (PCFA), och den ytliga kaudala epigastrisk artär (SCEA). Lårbensvenen (FV) löper i anslutning till FA, och venösa grenar kan ses parallellt med de stora arteriella grenarna. Asterisker (*) betecknar de proximala och distala ställen för placering av ameroid constrictors eller ligaturer, beroende på om subakut eller akut ischemi kommer att induceras. Vänligen click här för att se en större version av denna siffra.
- Använd pincett, öppna snitt och exponera membranet täcker inguinal fettvävnad (IFT).
- Använda slutna pincett, tränga genom membranet in avståndet mellan IFT och buken. Släpp försiktigt trycket på tången för att separera IFT från magmusklerna, utsätta neurovaskulära bunt under. Observera proximala och ytliga stjärtfenan grenar som viktiga anatomiska landmärken (Figur 1B).
- Sätt en indragare och dra bukvävnad proximalt för att exponera den proximala ameroid constrictor eller ligeringsstället, alldeles proximalt till den laterala cirkumflex lårbensartären (Figur 1B). Den laterala cirkumflex artären ligger ca 5 mm proximal till den proximala och ytliga stjärtfenan artärer.
- Infoga ytterligare två sårhakar i den distala delen av snittet, en medial och en lateral, att dra IFT distalt bort frånkirurgiska platsen för att vidga det kirurgiska området.
- Använd två fina pincett för att ta bort det yttersta membranet täcker neurovaskulära bunt. Försiktigt in hälften av fin pincett spets mellan venen och artären, skjuta pincett spets under membranet som binder dem samman. Stäng pincett och försiktigt riva bort membranet.
- För in spetsen på en sluten tång mellan venen och artären och skapa ett gap mellan dem genom att släppa trycket på tången. Upprepa denna teknik för att skapa ett gap mellan artären och nerven.
- För subakut ischemi, placera en ameroid constrictor på den proximala lårbensartären (Figur 2).
- För att installera den proximala ameroid constrictor, skjuter spetsen av en tång enligt lårbensartären för att isolera den från neurovaskulära bunt. Använd en andra uppsättning angled- pincett att greppa kanten av constrictor guide det under lårbensartären.
- Låg lårbensartären in i smycket i constrictor. Upprepa för den distala constrictor, placera den omedelbart proximalt om bifurkation av lårbensartären i Poplietallymfknutor artär och vena artär (Figur 2).
Figur 2. Placering av Ameroid Constrictors och ligaturer. (A) Exempel på två ameroid constrictors placerade på lårbensartären för att inducera subakut bakdelen ischemi. Den proximala constrictor placeras alldeles proximalt till den laterala cirkumflex lårbensartären (LCFA). Den distala constrictor placeras alldeles proximalt till förgreningen av Poplietallymfknutor (PA) och vena artärer (SA). Constrictor installeras med spåret uppåt för att säkerställa artären är rätt inställd i constrictor. (B) Exempel på ligaturer i lårbensartären för att inducera akut bakdelen ischemi. Ligatures (gula pilar) är placerade så att de flankerar läget för konstriktorer i panel (B) och den femorala artären transected mellan varje uppsättning av två ligaturer (asterisker). Bar, en mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
- För akut ischemi i extremiteterna, ligera och transekt proximala lårbensartären.
- Att transekt lårbensartären, tråd 7 - O sutur under artären alldeles proximalt till positionen av den proximala constrictor (se steg 3.7) och ligera. Knyta en andra ligatur omkring 1 mm distalt till den första.
- Använd Spring sax för att transekt artären mellan de två ligaturer. För den distala arteriella transection, upprepa dessa steg, placera två ligaturer ca 1 mm från varandra, bara proximala till förgreningen av lårbensartären i Poplietallymfknutor artär och vena artär men se till att de är distalt om ytliga caudal epigastrisk artär (se figur 1)
- Stäng snitt med hjälp av avbrutna 5 - O Vicryl suturer.
4. Perfusion Imaging
- Flytta musen till en 37 ° C värmedyna inställd under laser Doppler perfusion kameran (LDPI) och ansluta via en noskon till isofluran källa. Om ingen temperaturvakt är tillgängligt, tillåter 5 min för musen för att värmas upp till 37 ° C.
- Slå på Imager och starta bildinspelning.
- Klicka på "Ny singel bild" ikonen för att öppna "Scanner Setup" fönstret. Ställ in "skanningsstorlek" till "Large" och "Scan Speed" till "4 ms / pixel". Ställ in skanningsområdet genom att ändra x- och y-värden under "Scan Area (enheter) rutan.
- Klicka på fliken "Video och Avstånd" för att visa video foder och ordna musen för att passa in i scanningsområdet indikeras av en röd kontur. Klicka på "Auto Avstånd" för att kalibreraavståndet från lasern till motivet. Klicka på "Nästa" för att öppna "ämne detaljer" fönster.
- Ange ämnesinformationen och eventuella kommentarer. Klicka på Nästa för att gå vidare till skanningsfönstret.
- Klicka på "Start Measurement" knappen för att öppna "Bekräfta eller åsidosätta Scan Avstånd" dialog. Klicka på "OK" för att bekräfta skanna avstånd. Observera skanningen börjar och köra för 4-8 min beroende på storleken av scanningsområdet.
- När skanningen är klar, observera "Spara som" fönstret. Namnge filen och spara den.
- Stäng av isofluran och flytta musen till ett tomt återhämtning bur och övervaka dess att djuret kan bibehålla sternala VILA. Placera aldrig en mus som återhämtar sig från anestesi i en bur med andra möss.
- Öppna bildanalysmjukvara. Klicka på "Öppna" ikonen och bläddra till och öppna bildfilen för analys. På filfönstret, observera flödet,foto, och färgbilder på musen.
- För att markera regionen av intresse (ROI) på flödes bilden, klicka på "Visa ROI" ikon. Nästa klicka på "Lägg till Polygon knappen och dra markören runt icke-kirurgiska lem att dra ROI. Högerklicka för att stänga formen. Välj "Lägg till Polygon" igen och dra en matchande ROI runt operations lem.
- Klicka på "Statistik" ikonen för att öppna "Image ROI Statistiska resultat (PU) fönster. Observera skillnaden procent i flödet i kolumnen "Flux%.
OBS: Den första ROI dras kommer att fungera som referens.
OBS: Före varje efterföljande perfusion scan följa stegen i avsnitt ett att söva musen och steg 4,1 till 4,11 för att avbilda djuret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt identifiering av mus bakben kärl är avgörande för att säkerställa reproducerbarhet av de tekniker för att inducera både subakuta och akuta bakbenen ischemi, som beskrivs här. Förutom variationen inneboende i djurstudier, kan andra faktorer införa variabilitet i laser Doppler perfusion imaging (LDPI), inklusive den typ av anestesi, position djuret (liggande vs benägen), och kroppstemperatur (se figur 3). Dessutom är beroende av kvaliteten på de ameroid constrictor, som kan variera kraftigt inom en given sats av subakuta bakdelen ischemi modell (se Figur 4). Var och en av dessa frågor kan få betydande effekter på kvantifiering av flödet mätt med LDPI och diskuteras mer i detalj nedan.
Efter placering av ameroid constrictors i subakuta bakben ischemi modell eller ligeringoch transektion av lårbensartären i den akuta bakbenen ischemimodell, bör LDPI bilder tas omedelbart efter operationen medan djuret fortfarande är sövda för att demonstrera effekterna av kirurgi och etablera en baslinje postoperativ nivå av perfusion (figur 5). Kvantifiering av perfusion utförs genom att rita ett område av intresse (ROI) runt den ischemiska bakbenet och en jämförbar ROI runt den icke-ischemiska bakbenet. Perfusion är oftast uttryckt som ett förhållande av perfusionen i den ischemiska extremiteten med det i den icke-ischemiska extremiteten, och förändringar i detta förhållande mäts över tiden. Vi har funnit att avbildnings möss i framstupa läge resulterar i mindre variationer på grund av djurförflyttningar och förändringar i positioneringen av fötterna från en tidpunkt till nästa. Dessutom perfusion i det övre låret tenderar att vara mer variabla när möss är i ryggläge. bör observeras en total förlust av bakdelen perfusion efter induktion av akut lemischemi, medan endast en liten sänkning av perfusion vanligen observeras efter placering av ameroid constrictors i subakuta modellen (figur 5). I vissa fall har vi observerat snabb constrictor ocklusion med åtföljande dramatisk förlust av perfusion omedelbart postoperativt.
Figur 3. Variation i Perfusion Imaging Baserat på bakdelen Position och kroppstemperatur. Laser Doppler perfusion bilder av en enda BALB / c-mus, bedövades med 1,5% isofluran och scannas i både liggande och liggande ställning vid 35 ° C, 37 ° C, och 38 ° C. Med isoflurananestesi, djurets bakben tenderar att röra sig med andning, vilket resulterar i en artefakt (horisontella linjer) som observeras med högre frekvens på liggande jämfört med utsatta bilder. I liggande position, är det mycket lättare att reproducera den exakta vinkelnav fötterna, vilket gör kvantifiering av perfusion över tiden mer exakt. Perfusion reduceras väsentligt som kroppstemperaturen sjunker under 37 ° C, medan bilderna är mättade vid högre temperaturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Variation av kommersiellt tillgänglig Ameroid Constrictors (A) Ett exempel på en idealisk 0,25 mm innerdiameter (dubbelriktad pil) constrictor med enhetlig slot form och kasein tjocklek (B - D).. Exempel på slot form variation. Slots kan ibland visa ett "d" form (B och C) eller ett "b" form (D). I dessa fall är det kasein tämligen jämnt fördelad och spåren är tillräckligt djup hoId artären. (E) Ett exempel på ojämn kasein tjocklek. Detta constrictor skulle kasseras. (F) Ett exempel på en plats som är för grunt för att hålla artären på plats under sammandragning. Detta constrictor skulle också kasseras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Perfusion bilder direkt efter induktion av subakut eller akut bakdelen ischemi. Representativa perfusion bilder i både liggande och liggande ställning BALB / c-möss som har genomgått placering av två ameroid constrictors på den vänstra lårbensartären för att inducera subakut bakdelen ischemi eller placering av två ligaturer och transektion av den vänstra lårbensartären för att inducera akut bakbensischemi. Notera att perfusion minskar men fortfarande detekterbar efter ameroid constrictor placering, medan väsentligen inget flöde upptäcks omedelbart efter dubbelbindning / tran av lårbensartären. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kanske mest utmanande steget i detta förfarande är separering av lårbensartären från lårbensvenen. Den större diametern och tunnare väggar lårbensvenen jämfört med dem av artären ökar dess känslighet för punktering och rivning under kirurgisk manipulation. Sannolikheten för att störa venen kan reduceras genom att hålla såret fuktigt med en steril bomullstopp fuktad med PBS. Det är också viktigt att se till att alla pincett skärps, i linje, och fri från avbrott för att möjliggöra exakt manipulation av fartyg och omgivande vävnader. I händelse av att blödning inträffar, applicera tryck till området med steril gasbinda tills blödningen har slutat. Detaljerade kirurgiska anteckningar bör bibehållas för varje djur, såsom vad som kan uppfattas som "mindre" blödningar kan representera en oavsiktligt allvarligare ischemisk skada på lång sikt. För överensstämmelse mellan uppgifter, operationer innebär ingen venös eller säkerheter arteriell blödninging händelser är avgörande.
En begränsning med denna teknik är att svårighetsgraden och / eller uppkomsten av ischemi (i subakuta ameroid constrictor modell) kan variera inom vida gränser beroende på flera faktorer. Den proximala constrictor / ligeringsstället kommer att avgöra hur många kollaterala artärer påverkas av induktion av ischemi. Lämnar sidogrenar intakt minskar skadans allvarlighetsgrad, men som nämnts, i vissa sammanhang, det vill säga, i djur av vissa genetiska bakgrunder ännu mildare, kan subakut ischemi orsaka betydande vävnadsnekros 23. Dessutom kommer tillsatsen av en andra, distal constrictor eller ligaturen minskar perfusion i både akuta och subakuta modellen 23. Vissa forskare har ligerades eller använt en diatermi för att avlägsna sidogrenar från den laterala cirkumflex artären, den proximala svanslårbensartären, och den ytliga svans epigastrisk artär 24. Detta resulterar i allvarligare ischemi ennd kan inducera större muskelskada, men det beror också på genetisk bakgrund. Det är viktigt att notera att diatermi kan vara mer benägna att orsaka skada på omgivande vävnader och bör därför användas med försiktighet.
Mot bakgrund av dessa variabler, är det viktigt att den vaskulära anatomin exakt identifieras innan du väljer platsen för ocklusion. Et al. Kochi 25 noterades en markant brist på enighet bland många rapporter om namn och platser av blodkärlen i musens bakben, och de har gett en mycket detaljerad beskrivning av arteriell anatomi som vi tror är en viktig vägledning för alla företag här procedur. En tidigare offentliggjorts i denna tidskrift visade tekniken för att inducera akut ischemi 13, men i denna rapport de vaskulära anatomiska landmärken inte väldefinierade. Ett viktigt mål med denna rapport var att åstadkomma en förbättrad visuell representation of dessa landmärken i tillägg till att visa en modifiering av den teknik med användning av subakut ischemi i extremiteterna.
En ytterligare begränsning med detta tillvägagångssätt är att uppkomsten av ischemi i subakut ischemi-modellen är en funktion av kvaliteten på de ameroid constrictors som en använder. Vi har funnit att kommersiella constrictors kan variera i djupet och formen på deras interna slot (Figur 4). Om facket är för grunt artären kan extruderas under sammandragning. Constrictor med spruckna kasein eller missbildade slots ska kasseras. Dessutom kan inkonsekvent distribution av kasein i constrictor resultera i accelererade andelen ocklusion. Storlek och ålder av mössen är en annan viktig faktor att beakta, som fartygsstorlekar i "vuxna" möss kan variera avsevärt i åldrarna 8 och 30 veckors ålder. Detta är särskilt viktigt när man använder flera oberoende grupper av möss för att generera datamängder, som uppenbarligen small åldersintervall (t.ex., 10 - 16 veckor) kan resultera i inkonsekventa hastigheter av ocklusion och svårighetsgrad av ischemisk extremitet skada.
Kvantifiering av laser Doppler perfusionsavbildning kan även variera inom vida gränser beroende på djurets kroppstemperatur och läge (fig 4), såväl som anestesimedel som används. Det är avgörande att musen upprätthålla en 37 ° C kroppstemperatur under perfusionen avbildning. Om temperaturen är högre än 37 ° C perfusionen bilden kommer att mättas. Om temperaturen är under 36 ° C perfusionen signalen kan vara för svag. Det är också viktigt att hålla båda benen så symmetrisk som möjligt för att få en korrekt perfusion förhållande (perfusion i den ischemiska extremiteten jämfört med den i den icke-ischemiska extremiteten). Även möss ofta avbildas liggande på rygg, kan symmetri bli svårare att bibehålla i denna position. Dessutom variation i blodflödet i den överlägsna delen av bildfältet, dvs den proximal låret, kan bidra till variation i kvantifiering. Dessutom anestesi med isofluran resulterar ofta i ökad bröstet rörelse, vilket i sin tur orsakar benrörelser och variabilitet i den signal som erhålls genom LDPI. Vi har funnit att placera djuren i liggande position ger mer stöd till armar och ben, vilket möjliggör lättare positionering och kraftigt reducerad rörlighet, vilket resulterar i mer reproducerbar kvantifiering av perfusion (figur 5). Vidare underlättar liggande ställning mer konsekvent underhåll av 37 ° C temperatur i de skannade lemmar, vilket också förbättrar reproducerbarheten för kvantifiering (Figur 5). Jämfört med isofluran, möss sövda med ketamin display minskad bröstet rörelse, vilket gör liggande avbildning mindre variabel. Dock kommer ketamin också öka anestesi induktion och återhämtning, vilket resulterar i betydligt ökad absolut perfusion värden 16. Varje kombination av kroppsställning och Anesthetic medel kan skapa en tydlig perfusion bildvärdet, därför är det viktigt att använda en konsekvent metod för var och en av dessa metoder i alla efterföljande mätningar perfusion.
Det är viktigt att känna igen flera andra begränsningar av denna teknik. Eftersom modellen utförs ofta i möss utan några comorbidities, såsom fetma, hyperlipidemi, ateroskleros, diabetes mellitus, eller andra faktorer som predisponerar för vaskulär sjukdom, kommer induktion av ischemi i extremiteterna aldrig perfekt replikera patologin för klinisk PAD. Såsom angivits, har effekterna av akut ischemi bedömts i åldern, diabetes, och hyperkolesterolemi möss, och i framtiden kommer att vara användbart för att bestämma effekterna av dessa komorbida villkor för responsen på subakut ischemi. Dessutom, på grund PAD är en kronisk sjukdom, till och med subakut ischemi i extremiteterna är en ofullkomlig modell av den kliniska scenariot. Därför är det viktigt att fortsätta att utveckla modeller somresultera i sann kronisk ischemi och att testa dem i samband med modeller av kardiovaskulära riskfaktorer. En teknisk begränsning av laser Doppler imaging modalitet oberoende av djurmodell som används är att den mäter blodströmningshastighet och inte absolut vävnadsperfusion, därför att det kan endast användas för att jämföra relativa förändringar i blodflöde inom ett givet djur. Noterbart är att ischemi som orsakar lem förlust resultera i en minskad perfusion förhållande oberoende av förändringar i blodflödet 23.
Sammanfattningsvis ger vi detaljerade metoder för att inducera akut och subakut bakbenen ischemi i möss för att analysera effekter på skelettmuskler och kärlremodellering. Särskild uppmärksamhet ägnas åt identifiering av kritiska vaskulära landmärken för att underlätta korrekt inom och mellan operatör reproducerbarhet av modellen. Ytterligare förfining av tekniken kan så småningom leda till utvecklingen av en kronisk ischemi modell att korrektly replikerar patogenesen för klinisk PAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7 - 0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5 - 0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
- Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
- Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
- Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
- Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
- Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
- Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
- Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
- Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
- Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
- Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
- Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
- Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
- Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
- Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
- Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
- Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
- Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
- McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).
