Abstract
Perifer arteriesygdom (PAD) er en førende årsag til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i udviklede lande, og dyremodeller, som pålideligt gengive den humane sygdom er nødvendigt at udvikle nye terapier for denne sygdom. Musen bagben iskæmi-model har været meget anvendt til dette formål, men det standardpraksis at inducere akut iskæmi i lemmerne ved ligering af den femorale arterie kan resultere i betydelige vævsnekrose, kompromittere undersøgere mulighed for at studere de vaskulære og skeletmuskulatur vævsreaktioner på iskæmi . En alternativ tilgang til femoral arterie ligering er induktionen af gradvis femoral arterieokklusion gennem brug af ameroid constrictors. Når den placeres rundt lårarterien i de samme eller forskellige steder som stederne for femoral arterie ligering disse enheder okkludere arterien over 1 - 3 dage, hvilket resulterer i mere gradvis, subakut iskæmi. Dette resulterer i mindre væsentlig skeletmuskulatur vævsnekrose, which kan mere nøje efterligner svarene ses i human PAD. Fordi genetisk baggrund påvirkninger resultater i både akutte og subakutte iskæmimodeller, idet der skal tages af muse-stamme undersøgt er vigtigt at vælge den bedste model. Dette papir beskriver den korrekte procedure og anatomiske placering af ligaturer eller ameroid kvælerslanger på musen femoral arterie at fremkalde subakut eller akut bagben iskæmi i mus.
Introduction
Perifer arteriesygdom (PAD) er en førende årsag til kardiovaskulær morbiditet og mortalitet i de udviklede lande 1. PAD resultater fra aterosklerotisk obstruktion af de perifere arterier, der fører til iskæmi i lemmerne med deraf anstrengelses eller hvile smerte og lejlighedsvis ikke-helende sår og koldbrand, der nødvendiggør lemmer amputation. Behandlinger rettet mod PAD er primært rettet mod endovaskulær 2 eller kirurgisk revaskularisering 3, som hovedsagelig ingen effektive medicinske behandlinger findes fire.
Desværre, revaskularisering er ofte af begrænset fordel, da bypass grafts har høje fejlrater (op til 50% inden for 5 år) 5, der er værre i nogle populationer (fx rygere, kvinder, ikke-saphenavene transplantater) 6,7. Endovaskulære tilgange, såsom ballonudvidelse og stent, er også kompromitteret af høje restenose satser (over 50% inden for 1 år), specielt in femoropopliteal sygdom 8, selv om brugen af narkotikarelaterede eluering balloner og stents har forbedret udfald noget 9-11. For at udvikle nye behandlinger for PAD er det vigtigt at udvikle dyremodeller, som pålideligt gengiver den humane sygdom.
Til dato den mest almindelige model af PAD er bagbenet iskæmimodel (HLI), som oftest udført i mus 12,13. I sin mest almindelige manifestation, modellen indebærer kirurgisk ligering af den proximale og distale femorale arterie og dens mellemliggende side-grene efterfulgt af udskæring af fartøjet, hvilket resulterer i okklusion af blodgennemstrømning og induktion af akut iskæmi i lemmerne. HLI er primært blevet anvendt til at undersøge angiogene og arteriogen responser i perifert lemmer muskelvæv og virkningerne af forskellige behandlinger (fx lægemidler, genafgivelse, stamceller) på disse responser. På det seneste har vores gruppe denne model anvendes til at undersøge, hvilken rolle skeletmuskelceller in svaret på lemmer iskæmi og virkningerne af genetiske forskelle på resultaterne 14.
Den HLI model har lettet vores nuværende forståelse, at de vaskulære og muskel reaktioner på iskæmi er afhængige af genetik (dvs. indavlet stamme) 15, 16 alder, og tilstedeværelsen eller fraværet af andre sygdomme eller tilstande der er relevante for atherosklerose, herunder diabetes mellitus 17 og hyperkolesterolæmi 18. En væsentlig svaghed ved den traditionelle HLI modellen er, at det er en model af akut iskæmi i lemmerne 12,13, hvorimod human PAD forårsager kronisk iskæmi som følge af den gradvise udvikling af okklusive aterosklerotiske læsioner i de perifere arterier.
I et forsøg på at omgå denne svaghed, Tang og kolleger oprindeligt udviklet en rotte model for en gradvis femoral arteriel okklusion hjælp ameroid constrictors 19, og samme gruppe efterfølgende developed en lignende musemodel 20. Ameroid kvælerslanger blev beskrevet indledningsvis i 1950'erne i en hundemodel for kronisk myokardieiskæmi 21,22. Disse indretninger har en ydre metalbøsning omslutter et indre lag af et hygroskopisk materiale, sædvanligvis casein, og når den placeres rundt en arterie de inducerer gradvis karokklusion da de absorberer fugt fra det omgivende væv. I deres modifikation af modellen, Yang et al. Placeret constrictors på både den proksimale og distale femorale arterie på steder analoge med de kirurgiske ligerings- sites, og de ligeret sidegrenene af den femorale arterie, som i den traditionelle model. Sammenlignet med akut HLI, ameroid constrictor-induceret iskæmi resulterede i lavere ekspression af inflammatoriske og shear stress-afhængige gener, lavere blodgennemstrømning recovery 4 - 5 uger efter operationen, og mindre muskel nekrose 20. Baseret på disse observationer, var det opfattelsen, at en gradvis tillukning af blodkar kan give en model af PAD mere relevant for den humane sygdom.
Især i den oprindelige rapport, effekter af ameroid constrictor-induceret iskæmi blev undersøgt kun i C57BL / 6 mus 19, som er relativt resistent over for iskæmi-induceret muskel nekrose 15. Vi har for nylig ændret den gradvise iskæmi model længere og udforskede dets virkninger i mere iskæmi-modtagelige BALB / c-mus stamme 23. I den første manifestation af modellen, som er tilføjet vi constrictors på både den proksimale og distale femorale arterie men forlod alle side-grene intakt. I en anden, mildere modifikation, som er tilføjet vi en enkelt constrictor kun på den proksimale femorale arterie og igen forlod alle side-afdelingerne af arterien intakt. I begge modifikationer af denne model, fandt vi, at BALB / c-mus, men ikke C57BL / 6-mus, viste signifikant muskel nekrose trods lignende blodgennemstrømning og vaskulær densitet. Svarende til vores tidligere undersøgelse 14, disse resultater viste, at lemmemuskelskade, er ikke alene påvirkes af blodgennemstrømning, men er til dels afhængig af genetisk baggrund. Desuden fandt vi, at lemmer blodgennemstrømningen faldt til sit nadir inden for 3 dage, og dermed modellen synes at være mere en af 'subakut "snarere end gradvis lemmer iskæmi.
Baseret på disse tidligere undersøgelser, synes det klart, at en enkelt fremgangsmåde til induktion bagbens iskæmi ikke kan være egnet i alle tilfælde. Fordi en række betingelser (f.eks genetiske forskelle og tilstedeværelse eller fravær af følgesygdomme) indflydelse både vaskulære og skelet muskel-specifikke reaktioner, kan efterforskerne finde det nødvendigt at ændre kroniske og / eller sværhedsgraden af bagbenet iskæmi bedst passer til deres formål. Endvidere kendte beskrivelser af modellen manglede typisk egnede anatomiske kendetegn til at lette pålidelig inter-investigator reproducerbarhed af teknikken. I dette papir, fremgangsmåder til induktion enten akut eller subakut bagben iskæmi i musener beskrevet, og præcise anatomiske kendetegn leveres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokol godkendt af Duke Institutional Animal Care og brug Udvalg. Hanmus blev anvendt i denne undersøgelse, selv om der kan anvendes enten køn som indiceret til videnskabelige formål med undersøgelsen.
1. Hair Removal
- Før induktion af anæstesi, der er nedsat en præ-kirurgisk forberedelse område bestående af et overdækket varmepude indstillet til 37 ° C og en næsekegle port forbundet til kontinuerlig strøm af isofluran.
- Placer musen i anæstesi induktion kammer. Indstil O 2 flowmeteret til 1 l / min og isofluran til 1 - 3%.
BEMÆRK: Anæstesi typisk induceret i en 25 g mus med 2% isofluran. - Kontrollér musens stimulusreaktion ryst forsigtigt kammeret og observere en mangel på en oprettende refleks.
- Skyl kammer med O 2 at rydde isofluran før åbning. Hurtigt flytte musen til opvarmning pannonce og slutte den til isofluran via næsekeglens.
- Juster isofluran til 1,5%. Kontroller stimulus respons ved pedal refleks (tå knivspids).
- Påfør oftalmologiske smøremiddel liberalt til begge øjne for at undgå udtørring under operationen.
- Barbere håret fra begge bagben hjælp af en lille elektrisk trimmer. Stram huden, mens du barberer at undgå sønderriver huden.
- Påfør forvarmet hårfjerning fløde og lad sidde i 1 min. Tør forsigtigt væk med en fugtet gaze.
- For kirurgisk procedure på et senere tidspunkt, skal du slukke for isofluran og flyt musen til en tom køkkenrulle-foret opsving bur for at sikre musen ikke aspirere buret sengetøj. Overvåg dyret indtil det er i stand til at opretholde brystleje. Ellers flyt musen til det kirurgiske bord.
BEMÆRK: fjernelse proces hår kan irritere huden og påvirke perfusionsmålinger. Det anbefales at vente 1 - 2 dage efter fjernelse af dyrets hår før performing en præ-kirurgisk perfusion scanning eller udføre kirurgi.
2. Pre-Kirurgisk Forberedelse
- Brug følgende værktøjer under denne procedure små lige kirurgiske sakse, 2 fine spids vinklet pincet, små Graefe pincet, nål driver pincet, 3 retraktorer, små forår saks og fin spids vatpinde.
- Sterilisere alle værktøjer ved hjælp en autoklave forud for indledningen af operationen. Brug en hot-bead sterilisator før og mellem hver kirurgisk procedure, i op til 5 dyr. Sterilisere yderligere kirurgiske værktøj pakker for operationer af grupper større end 5.
- Forbered en steril kirurgisk felt bestående af en overdækket varmepude og en isofluran port. Udfør alt arbejde under en 10 stereo dissektion mikroskop.
- Bedøve og forberede musen som beskrevet i trin 1.1 til 1.5.
- Kontroller, at musen er fuldt bedøvet og anbringes i en liggende stilling på det kirurgiske bord. Fastgør begge ben ved hjælp kirurgisk tape. </ Li>
- Hvis du bruger en temperatur-kontrolleret varmepude, fastgøre temperatur sonden og fastgør den til bunden af den kirurgiske platform ved hjælp af kirurgisk tape for at sikre, at det ikke vil blive et uheld trækkes ud under proceduren.
- Rengør stedet snit bruger 3 vekslende povidon-jod og spritservietter. Dæk dyret med en steril kirurgisk afdækningsstykke og skære et hul for at blotlægge incisionssted.
3. Induktion af Limb Iskæmi
- Brug en skalpel til at foretage en indledende indsnit langs midten af den mediale lår, der løber fra knæet mod maven, og forlænge snittet til ca. 1 cm med fine sakse (figur 1A).
Figur 1. Kirurgisk stedet og Vaskulære anatomiske kendetegn for Mouse bagben Iskæmi Surgery. (A) Ekstern visning afbagbenet af en mus i liggende stilling. Den skraverede linje angiver incisionssted til at udføre det bagben iskæmi procedurer. (B) Udsigt af den proksimale mus bagben kar. Den proksimale ende af den femorale arterie (FA) hidrører fra neden lyskeligamentet (IL). Den distale ende af FA er placeret ved dens bifurkation ind i den popliteale arterie (PA) og vena arterie (SA). De store collaterale arterier off af FA er den laterale circumflex femorale arterie (LCFA), den proximale caudale femorale arterie (PCFA), og den overfladiske epigastriske kaudale arterie (SCEA). Den femorale vene (FV) løber ved siden af IF og venøse grene kan ses parallelt med de store arterielle grene. Stjerner (*) angiver de proksimale og distale steder til anbringelse af ameroid constrictors eller ligaturer, alt efter om subakut eller akut iskæmi vil blive induceret. Zoom click her for at se en større version af dette tal.
- Ved hjælp af pincet, åbne snittet og udsætte membranen dækker lyskelymfeknuder fedtvæv (IFT).
- Brug af lukkede pincet, gennembore gennem membranen ind i adskillelsen mellem IFT og maven. frigive forsigtigt pres på pincet til at adskille IFT fra mavemusklerne, udsætter nerveforgrening nedenunder. Overhold den proksimale og overfladiske caudale grene som vigtige anatomiske kendetegn (Figur 1B).
- Indsæt en retractor og træk den abdominale væv proximalt at eksponere den proksimale ameroid constrictor eller ligation site, bare proksimalt til den laterale cirkumfleks femorale arterie (figur 1B). Den laterale circumflex arterie ligger ca. 5 mm proksimalt til den proksimale og overfladiske caudale arterier.
- Indsæt yderligere to retraktorer i den distale del af snittet, en medial og en lateral, at trække IFT distalt væk fraoperationssted at udvide operationsområdet.
- Brug to fine pincet til at fjerne den yderste membran, der dækker nerveforgrening. Sæt forsigtigt den ene halvdel af den fine pincet spids mellem venen og arterien, skubbe pincet spids under membranen, der binder dem sammen. Luk pincet og forsigtigt rive væk membranen.
- Sæt spidsen af et lukket pincet mellem vene og arterie og skabe en kløft mellem dem ved at frigive pres på pincet. Gentag denne teknik til at skabe en kløft mellem arterien og nerve.
- For subakut iskæmi i lemmerne, placere en ameroid constrictor på den proksimale femorale arterie (figur 2).
- For at installere den proksimale ameroid kvælerslange, skub spidsen af en pincet under den femorale arterie for at isolere det fra nerveforgrening. Brug et andet sæt af angled- pincet til at gribe kanten af constrictor og lede den under den femorale arterie.
- Lå den femorale arterie i Smeget i constrictor. Gentag for den distale constrictor, placere den umiddelbart proximalt til bifurkationen af den femorale arterie i poplitaeaarterien og vena arterie (figur 2).
Figur 2. Placering af Ameroid kvælerslanger og Ligaturer. (A) Eksempel på to ameroid kvælerslanger placeret på den femorale arterie at fremkalde subakut bagben iskæmi. Den proximale constrictor er placeret umiddelbart proksimalt til den laterale circumflex femorale arterie (LCFA). Den distale constrictor er placeret lige proximalt til bifurkationen af popliteale (PA) og saphenous arterier (SA). Kvælerslanger er installeret med åbningen opad for at sikre arterien er korrekt indstillet i constrictor. (B) Eksempel på ligaturer af den femorale arterie for at fremkalde akut bagben iskæmi. ligatures (gule pile) anbringes således, at de flankerer positionen af constrictors i panel (B), og den femorale arterie gennemskæres mellem hvert sæt af to ligaturer (asterisker). Bar, 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
- For akut iskæmi i lemmerne, liger og transektere den proximale femorale arterie.
- At transektere den femorale arterie, gevind 7 - O sutur under arterien umiddelbart proksimalt til positionen af den proximale constrictor (se trin 3.7) og liger. Bind en anden ligatur omkring 1 mm distalt i forhold til den første.
- Brug foråret saks til transektere arterien mellem de to ligaturer. For den distale arterielle overskæring, gentage disse trin, placere to ligaturer omkring 1 mm fra hinanden, bare proksimale til forgreningen af den femorale arterie i poplitaeaarterien og vena arterie, men at sikre, at de er distalt for den overfladiske caudal epigastriske arterie (se figur 1)
- Lukke snittet under anvendelse afbrudt 5 - O Vicryl-suturer.
4. Perfusion Imaging
- Flyt musen til et 37 ° C varmepude sat under laser-doppler perfusion imager (LDPI) og forbinde via en næsekegle til isofluran kilde. Hvis der ikke temperaturmonitor er tilgængelig, tillader 5 min for musen til at varme op til 37 ° C.
- Tænd for imager og starte billedoptagelse software.
- Klik på 'Ny Enkelt billede' ikonet for at åbne 'Scanner Setup' vinduet. Indstil "Scan Size 'til' Stor" og "Scan Speed 'til' 4 ms / pixel '. Indstil scanningsområdet ved at ændre x og y-værdier under den "Scan Area (enheder)" rude.
- Klik på 'Video og Afstand' fane for at se videoen foder, og arrangere musen til at passe ind i scanningsområdet angivet med en rød kontur. Klik på 'Auto afstand' at kalibrereafstanden fra laseren til individet. Klik på 'Næste' for at åbne "Emne oplysninger 'vindue.
- Indtast emnet oplysninger og relevante kommentarer. Klik på knappen 'Næste' for at gå videre til scanning vinduet.
- Klik på knappen 'Start Measurement "for at åbne" Bekræft eller Tilsidesæt Scan Distance' dialogen. Klik på 'OK' for at bekræfte scanning afstand. Overhold scanningen begynder og køre for 4-8 min afhængig af størrelsen af scanningsområdet.
- Når scanningen er fuldført, observere 'Gem som' vindue. Navngiv filen og gem den.
- Sluk isofluran og flyt musen til en tom opsving bur og overvåge, indtil dyret er i stand til at opretholde brystleje. Placer aldrig en mus genoprettelse fra anæstesi i et bur med andre mus.
- Åbn billedanalysesoftware. Klik på 'Åbn' ikon, og find og åbn billedfilen til analyse. På vinduet filen, observere flux,foto, og farvebilleder med musen.
- For at markere området af interesse (ROI) på flux billede ved at klikke på "Vis ROI'er 'ikon. Næste klikke på knappen 'Tilføj Polygon «og træk markøren rundt på ikke-kirurgisk lemmer at tegne ROI. Højreklik for at lukke formen. Vælg 'Tilføj Polygon "igen og tegne en matchende ROI omkring kirurgiske lemmer.
- Klik på "Statistik" ikonet for at åbne 'billede ROI'er statistikkontorer Resultater (PU) "vinduet. Overhold procent forskel i flux i kolonnen »Flux%«.
BEMÆRK: første ROI trukket vil tjene som reference.
BEMÆRK: Før hver efterfølgende perfusion scanning Følg trinene i afsnit 1 til bedøver musen og i trin 4.1 til 4.11 til billedet dyret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Korrekt identifikation af muse bagben vaskulatur er kritiske for reproducerbarhed af de teknikker til induktion både subakut og akut bagben iskæmi, som beskrevet her. Foruden variationen iboende i dyreforsøg, kan andre faktorer indføre variabilitet i laser Doppler perfusionsafbildning (LDPI), herunder typen af anæstesi, placering af dyret (rygliggende vs. tilbøjelige), og legemstemperatur (se figur 3). Derudover subakut bagben iskæmi model er afhængig af kvaliteten af de ameroid kvælerslanger, som kan variere bredt inden for en given batch (se figur 4). Hvert af disse emner kan have væsentlige følger for kvantificering af strømmen målt ved LDPI og diskuteres mere detaljeret nedenfor.
Efter placering af ameroid constrictors i subakutte bagben iskæmi model eller ligeringog overskæring af den femorale arterie i den akutte bagben iskæmi, bør indhentes LDPI billeder umiddelbart postoperativt mens dyret stadig er bedøvet at demonstrere virkninger af kirurgi og etablere en basislinje postoperativ niveau af perfusion (figur 5). Kvantificering af perfusionen udføres ved at trække et område af interesse (ROI) omkring den iskæmiske bagben og en sammenlignelig ROI omkring den ikke-iskæmiske bagben. Perfusion er mest almindeligt udtrykt som et forhold af perfusionen i den iskæmiske lemmer med den i den ikke-iskæmiske lemmer og ændringer i dette forhold måles over tid. Vi har fundet, at billeddannende mus i bugleje resulterer i mindre variabilitet skyldes dyrs bevægelser og ændringer i positionering af fødderne fra ét tidspunkt til det næste. Endvidere perfusion i overlåret tendens til at være mere variabel, når mus er i rygleje. En komplet tab af bagben perfusion bør observeres efter induktion af akut lemmeriskæmi, mens kun et svagt fald i perfusion typisk observeres efter anbringelse af ameroid constrictors i subakut model (figur 5). I nogle tilfælde har vi observeret hurtig constrictor okklusion med deraf følgende dramatiske tab af perfusion umiddelbart efter operationen.
Figur 3. Variation i Perfusion Imaging Baseret på bagbenet Position og legemstemperatur. Laser Doppler perfusion billeder af en enkelt BALB / c-mus, bedøvet med 1,5% isofluran og scannes i både liggende og bugleje ved 35 ° C, 37 ° C, og 38 ° C. Med isofluran anæstesi, dyrets bagben tendens til at bevæge sig med respiration, hvilket resulterer i en artefakt (horisontale linjer), der er observeret med større hyppighed på liggende i forhold til udsatte billeder. I bugleje, er det meget lettere at reproducere den nøjagtige vinkelaf fødderne, hvilket gør kvantificering af perfusion over tid mere præcis. Perfusion er væsentligt reduceret som kropstemperaturen falder til under 37 ° C, mens billederne mættet ved højere temperaturer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Variabilitet af kommercielt tilgængelige Ameroid kvælerslanger (A) Et eksempel på en ideel 0,25 mm indvendig diameter (dobbeltpil) constrictor med ensartet slot form og kasein tykkelse (B - D).. Eksempler på slot form variation. Slots kan sommetider vise et 'd' form (B og C) eller en "b" form (D). I disse tilfælde er det kasein nogenlunde jævnt fordelt, og slots er dybt nok hold arterien. (E) Et eksempel på ujævn kasein tykkelse. Denne constrictor ville blive kasseret. (F) Et eksempel på en spalte, der er for lavt til at holde arterien på plads under konstriktion. Denne constrictor vil også blive kasseret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Perfusion billeder umiddelbart efter Induktion af subakut eller akut bagben Iskæmi. Repræsentative perfusion billeder i både liggende og udsat position BALB / c mus, der har undergået placering af to ameroid kvælerslanger i venstre femoral arterie at fremkalde subakut bagben iskæmi eller placering af to ligaturer og overskæring af den venstre femorale arterie for at inducere akut bagben iskæmi. Bemærk at perfusion er reduceret, men stadig spores efter ameroid kvælerslange placering, hvorimod væsentlige ingen flow detekteres umiddelbart efter dobbelt ligation / transsektion af den femorale arterie. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Måske den mest udfordrende skridt i denne procedure er adskillelsen af den femorale arterie fra den femorale vene. Den større diameter og tyndere vægge af den femorale vene i forhold til dem af arterien øge sin modtagelighed for punktering og rivning under kirurgisk manipulation. Sandsynligheden for at forstyrre venen kan reduceres ved at holde såret fugtigt med en steril vatpind fugtet med PBS. Det er også vigtigt at sikre, at alle pincet skærpes, justeret, og fri for pauser for at muliggøre præcis manipulation af skibene og de omkringliggende væv. I tilfælde af, at blødning sker, lægge pres på området med steril gaze, indtil blødningen er stoppet. Detaljerede kirurgiske noter bør opretholdes for hvert dyr, som det, der kan opfattes som »mindre« blødninger, kan udgøre en utilsigtet mere alvorlig iskæmisk skade på lang sigt. For konsistens data, operationer, der involverer ingen venøs eller sikkerhedsstillelse arteriel blødninging begivenheder er afgørende.
En begrænsning ved denne teknik er, at sværhedsgraden og / eller indtræden af iskæmi (i subakutte ameroid constrictor model) kan variere meget afhængigt af flere faktorer. Den proximale constrictor / ligeringsstedet vil afgøre, hvor mange collaterale arterier påvirkes ved induktion af iskæmi. Leaving kollaterale grene intakt mindsker alvorligheden af skaden, men som bemærket i visse sammenhænge, dvs, i dyr af visse genetiske baggrunde endnu mildere, kan subakut iskæmi forårsager væsentlig vævsnekrose 23. Endvidere vil tilsætning af en anden, distal constrictor eller ligatur falde perfusion i både den akutte og subakutte model 23. Nogle forskere har ligeret eller brugt en elektrokauterisation at ablatere kollaterale forgrener sig den laterale circumflexa arterie, den proximale kaudale femorale arterie, og den overfladiske epigastriske kaudale arterie 24. Dette resulterer i mere alvorlig iskæmi and kan inducere større muskelskader, selv om dette også afhænger af genetisk baggrund. Det er vigtigt at bemærke, at elektrokauterisation kan være mere tilbøjelige til at resultere i skade på det omgivende væv og bør derfor anvendes med forsigtighed.
I lyset af disse variabler er det kritisk, at den vaskulære anatomi nøjagtigt identificeres før udvælgelse af lokaliteten af okklusion. Kochi et al. 25 bemærkede en markant mangel på konsensus blandt talrige rapporter om navne og placeringer af blodkarrene i mus bagben, og de har givet en meget detaljeret beskrivelse af den arterielle anatomi, som vi mener er en vigtig vejledning for nogen virksomhed dette procedure. En tidligere offentliggørelse i dette tidsskrift demonstrerede teknikken for at fremkalde akut iskæmi i lemmerne 13, men i denne rapport de vaskulære anatomiske kendetegn ikke var veldefineret. Et vigtigt mål med denne rapport var at give en forbedret visuel repræsentation of disse landmærker i tillæg til at demonstrere en modifikation af teknikken under anvendelse subakut iskæmi i lemmerne.
En yderligere begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at den begyndende iskæmi i subakutte iskæmi-modellen er en funktion af kvaliteten af de ameroid constrictors at man anvender. Vi har fundet, at kommercielle constrictors kan variere i dybden og formen af deres interne spalte (figur 4). Hvis spalten er for lavvandet arterien kan ekstruderes under konstriktion. Kvælerslanger med revnet kasein eller misdannede slots bør kasseres. Derudover kan inkonsekvent fordeling af kasein i constrictor resultere i accelererede satser for okklusion. Størrelsen og alder af musene er en anden afgørende faktor til at overveje, som fartøjet størrelser i "voksen" mus kan variere betydeligt i alderen 8 og 30 uger gamle. Dette er især vigtigt, når du bruger flere uafhængige kohorter af mus til at generere datasæt, som tilsyneladende small aldersgrupper (f.eks 10 - 16 uger) kan medføre inkonsistente satser for okklusion og sværhedsgrad af iskæmisk lemmer skade.
Kvantificering af laser Doppler perfusionsafbildning kan også variere meget afhængigt af dyrets kropstemperatur og position (figur 4), samt bedøvelsesmidlet anvendes. Det er afgørende, at musen opretholde en 37 ° C kropstemperatur under perfusion imaging. Hvis temperaturen er højere end 37 ° C perfusionen billede vil blive mættet. Hvis temperaturen er under 36 ° C perfusionen signalet blive for svagt. Det er også vigtigt at holde begge ben så symmetrisk som muligt at opnå en nøjagtig perfusionsforholdet (perfusion i den iskæmiske lemmer sammenlignet med den i den ikke-iskæmiske lemmer). Selvom mus ofte afbildet liggende på ryggen, kan symmetri være sværere at opretholde i denne position. Desuden variation i blodgennemstrømningen i superior del af billedfeltet, dvs. proximal lår, kan bidrage til variabilitet i kvantificering. Desuden anæstesi med isofluran resulterer ofte i øget bryst bevægelse, som igen forårsager bevægelse af benene og variabilitet i signalet opnået ved LDPI. Vi har fundet, at placere dyrene i bugleje giver mere støtte til arme og ben, hvilket letter positionering og stærkt reduceret bevægelse, hvilket resulterer i mere reproducerbar kvantificering af ekstremitetsperfusion (figur 5). Endvidere bugleje letter mere konsistent vedligeholdelse på 37 ° C temperatur i de scannede lemmer, hvilket også forbedrer reproducerbarheden af kvantificering (figur 5). Sammenlignet med isofluran, mus bedøvet med ketamin display faldt brystet bevægelse, hvilket gør rygliggende billeddannelse mindre variabel. Dog vil ketamin også øge anæstesi induktion og nyttiggørelse tid, hvilket resulterer i væsentligt forøget absolut perfusion værdier 16. Hver kombination af kropsstilling og Anesthetic middel kan skabe et særskilt perfusion billede værdi, hvorfor det er vigtigt at anvende en ensartet teknik til hver af disse metoder i alle efterfølgende perfusionsmålinger.
Det er vigtigt at erkende flere andre begrænsninger i denne teknik. Da modellen ofte udføres i mus uden nogen co-morbiditet, såsom fedme, hyperlipidæmi, aterosklerose, diabetes mellitus, eller andre faktorer, der prædisponerer til vaskulær sygdom, vil induktionen af iskæmi i lemmerne aldrig perfekt replikere patologi klinisk PAD. Som nævnt, er virkningerne af akut iskæmi i lemmerne blevet vurderet i alderen, diabetiske, og hypercholesterolæmi mus, og i fremtiden vil det være nyttigt at bestemme virkningerne af disse comorbide betingelser på reaktioner på subakut lemmer iskæmi. Desuden, på grund PAD er en kronisk sygdom, selv subakut iskæmi i lemmerne er en ufuldkommen model af den kliniske situation. Derfor vil det være vigtigt at fortsætte med at udvikle modeller, derresultere i ægte kronisk iskæmi i lemmerne og at teste dem sammen med modeller af kardiovaskulære risikofaktorer. En teknisk begrænsning af laseren Doppler billedmodalitet uanset dyremodellen som anvendes, er at den måler blodets strømningshastighed og ikke absolut vævsperfusion, derfor den kun kan bruges til at sammenligne relative ændringer i blodgennemstrømningen i et givet dyr. Især vil iskæmi, der forårsager tab lemmer resultere i en reduceret perfusionsforholdet uanset ændringer i blodgennemstrømningen 23.
Sammenfattende giver vi detaljerede fremgangsmåder til induktion af akut og subakut bagben iskæmi i mus med henblik på at analysere virkninger på skeletmuskler og vaskulær remodellering. Særlig opmærksomhed er givet til identifikation af kritiske vaskulære vartegn for at lette nøjagtig intra- og inter-operatør reproducerbarhed af modellen. Yderligere raffinering af teknikken kan med tiden føre til udvikling af en kronisk iskæmi model, nøjagtigly replikerer patogenesen af klinisk PAD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Dumoxel |
| Dumont Style 5 Mini Forceps | Fine Science Tools | 11200-14 | Inox |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| 7 - 0 Silk Suture | Sharpoint | DA-2527N | |
| 5 - 0 Coated Vicryl Suture | Ethicon | J463G | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11053-10 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Artifical Tears Ointment | Rugby Laboratories | 0536-6550-91 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-0 | |
| Fine Cotton Swabs | Contec | SC-4 | |
| Temperature Controller | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Ameroid Constrictors | Research Instruments SW | MMC-0.25 x 1.00-SS | |
| Hot Bead Sterilizer | |||
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | |
| Needle Driver | Fine Science Tools | ||
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 10010-023 | |
| Moor LDPI | Moor Instruments | moorLDI2 | |
| moorLDI Measurement software | Moor Instruments | v. 6.0 | |
| Hair Removal Cream | Nair |
References
- Criqui, M. H., Aboyans, V. Epidemiology of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1509-1526 (2015).
- Thukkani, A. K., Kinlay, S. Endovascular intervention for peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1599-1613 (2015).
- Vartanian, S. M., Conte, M. S. Surgical intervention for peripheral arterial disease. Circ. Res. 116, 1614-1628 (2015).
- Bonaca, M. P., Creager, M. A. Pharmacological treatment and current management of peripheral artery disease. Circ. Res. 116, 1579-1598 (2015).
- Conte, M. S., et al. Design and rationale of the PREVENT III clinical trial: edifoligide for the prevention of infrainguinal vein graft failure. Vasc Endovascular Surg. 39, 15-23 (2005).
- Pomposelli, F. B., et al. A decade of experience with dorsalis pedis artery bypass: analysis of outcome in more than 1000 cases. J. Vasc. Surg. 37, 307-315 (2003).
- Willigendael, E. M., et al. Smoking and the patency of lower extremity bypass grafts: a meta-analysis. J. Vasc. Surg. 42, 67-74 (2005).
- Schillinger, M., et al. Balloon angioplasty versus implantation of nitinol stents in the superficial femoral artery. N. Engl. J. Med. 354, 1879-1888 (2006).
- Marmagkiolis, K., et al. 12-month primary patency rates of contemporary endovascular device therapy for femoro-popliteal occlusive disease in 6,024 patients: beyond balloon angioplasty. Catheter. Cardiovasc. Interv. 84, 555-564 (2014).
- Rosenfield, K., et al. Trial of a Paclitaxel-Coated Balloon for Femoropopliteal Artery Disease. N. Engl. J. Med. 373, 145-153 (2015).
- Tepe, G., et al. Drug-coated balloon versus standard percutaneous transluminal angioplasty for the treatment of superficial femoral and popliteal peripheral artery disease: 12-month results from the IN.PACT SFA randomized trial. Circulation. 131, 495-502 (2015).
- Couffinhal, T., et al. Mouse model of angiogenesis. Am. J. Pathol. 152, 1667-1679 (1998).
- Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. J Vis Exp. , (2009).
- McClung, J. M., et al. Skeletal muscle-specific genetic determinants contribute to the differential strain-dependent effects of hindlimb ischemia in mice. Am. J. Pathol. 180, 2156-2169 (2012).
- Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117, 1207-1215 (2008).
- Rivard, A., et al. Age-dependent impairment of angiogenesis. Circulation. 99, 111-120 (1999).
- Hazarika, S., et al. Impaired angiogenesis after hindlimb ischemia in type 2 diabetes mellitus: differential regulation of vascular endothelial growth factor receptor 1 and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1. Circ. Res. 101, 948-956 (2007).
- Couffinhal, T., et al. Impaired collateral vessel development associated with reduced expression of vascular endothelial growth factor in ApoE-/- mice. Circulation. 99, 3188-3198 (1999).
- Tang, G. L., Chang, D. S., Sarkar, R., Wang, R., Messina, L. M. The effect of gradual or acute arterial occlusion on skeletal muscle blood flow, arteriogenesis, and inflammation in rat hindlimb ischemia. J. Vasc. Surg. 41, 312-320 (2005).
- Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. J. Vasc. Surg. 48, 1546-1558 (2008).
- Litvak, J., Siderides, L. E., Vineberg, A. M. The experimental production of coronary artery insufficiency and occlusion. Am. Heart J. 53, 505-518 (1957).
- Bredee, J. J. An improved ameroid constrictor. Preliminary communication. J. Surg. Res. 9, 107-112 (1969).
- McClung, J. M., et al. Subacute limb ischemia induces skeletal muscle injury in genetically susceptible mice independent of vascular density. J. Vasc. Surg. , (2015).
- Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 40, 796-803 (2010).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PloS one. 8, e84047 (2013).
