चेचक वायरस (वी.वी.) व्यापक रूप से जैव चिकित्सा अनुसंधान और मानव स्वास्थ्य के सुधार में इस्तेमाल किया गया है। यह लेख एक सरल, अत्यधिक कारगर तरीका एक CRISPR-Cas9 प्रणाली का उपयोग कर वी.वी. जीनोम को संपादित करने का वर्णन है।
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
चेचक वायरस (वी.वी.) एक छा डीएनए poxvirus परिवार से संबंधित वायरस है और चेचक के उन्मूलन की दवा में सबसे बड़ी उपलब्धियों में से एक में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। चेचक के बाद उन्मूलन युग में, वी.वी. वी.वी. वैक्टर में विभिन्न रोगजनकों से जीन डालने से एचआईवी और अन्य संक्रामक रोगों 1-7 के खिलाफ टीके के लिए जीन देने के लिए एक वेक्टर के रूप में विकसित किया गया है। वी.वी. भी बड़े पैमाने पर विशेष रूप से ट्यूमर को निशाना बनाया नकल oncolytic चेचक वायरस के विकास के लिए कैंसर प्रतिरक्षा 8-14 के लिए एक वेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया है। आदेश में कैंसर की कोशिकाओं के लिए सुधार चयनात्मकता के साथ एक कुशल टीका वेक्टर बनाने के लिए, वायरल जीनोम के भीतर संशोधनों जीन विलोपन या चिकित्सीय जीन की शुरूआत सहित आवश्यक हैं।
डीएनए प्रौद्योगिकी के विकास और वी.वी. में आणविक जीव विज्ञान और विषाणु विज्ञान, विदेशी डीएनए के सम्मिलन का एक बेहतर समझ के साथ मूल रूप को प्राप्त थाडी 1980 के दशक के 15 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) का उपयोग कर। इस पद्धति अभी भी व्यापक रूप से वी.वी. वैक्टर के निर्माण के लिए किया जाता है। आनुवंशिक संशोधन का परिचय जो पूर्व संक्रमित कोशिकाओं में वी.वी. जीनोम के साथ recombines घंटे के लिए एक शटल वेक्टर, का उपयोग करके हासिल की है। हालांकि, इस पद्धति अत्यधिक अक्षम (1% से कम मुताबिक़ पुनर्संयोजन दक्षता 16) साबित हो गया है और अक्सर गैर लक्षित क्षेत्रों और / या वायरस के विस्तार पर मार्कर के नुकसान में चयन मार्कर के यादृच्छिक प्रविष्टि में यह परिणाम है।
जीनोमिक loci में exogenous डीएनए डालने के लिए डीएनए मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता में नाटकीय रूप से डबल भूग्रस्त टूटता है (DSBs) 17 की उपस्थिति में बढ़ाया जा सकता है। इसलिए, प्रौद्योगिकी है कि लक्ष्य loci में DSBs प्रेरित कर सकते हैं वी.वी. के जीनोम इंजीनियरिंग के लिए महान क्षमता रखती है।
हाल ही में विकसित CRISPR-Cas9 प्रणाली किसी भी वी.वी. जीन क्षेत्र में DSBs ट्रिगर के लिए वादा दिखाता है। CRISPR-Cas9 एक RNA- हैनिर्देशित nuclease हमलावर फगेस और अन्य विदेशी आनुवंशिक सामग्री 18-20 के खिलाफ अनुकूली प्रतिरक्षा में शामिल किया गया। माइक्रोबियल प्रजातियों 21 की एक श्रृंखला में तीन CRISPR कैस प्रणालियों रहे हैं। प्रकार द्वितीय CRISPR कैस प्रणाली को व्यापक रूप से संपादन कोशिकाओं और बड़े वायरस के जीनोम के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आरएनए निर्देशित Cas9 endonuclease (स्ट्रेप्टोकोकस प्योगेनेस से) के होते हैं, एक गाइड आरएनए (sgRNA) और ट्रांस-सक्रिय crRNA (tracrRNA) 22-24। Cas9 / sgRNA जटिल पूरक 20-न्यूक्लियोटाइड जीनोमिक स्तनधारी कोशिकाओं 22 में एक 5'-NGG -3 'Protospacer आसन्न मूल भाव (पीएएम) अनुक्रम, 23 पूर्ववर्ती अनुक्रम को पहचानता है। यह सफलतापूर्वक आनुवंशिक रूप से संशोधित कोशिकाओं, वायरस के प्रभावी पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया है और पशु मॉडल 22-32।
CRISPR-Cas9 प्रणाली जीनोम वी.वी. की कोशिका द्रव्य में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के साथ संयोजन में लक्षित करने के लिए एक कुशल उपकरण साबित हो गया है संक्रमित सीवी -1 सेलएस उत्परिवर्ती चेचक वायरस उत्पन्न करने के लिए 33, 34। क्रम में इस विधि के संभावित आवेदन का विस्तार करने के लिए, हम इस प्रणाली की कार्यप्रणाली के बारे में विस्तृत जानकारी प्रस्तुत करते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल एक विशेष जीन विलोपन के साथ एक उत्परिवर्ती वी.वी. बना सकते हैं और / या एक चिकित्सकीय ट्रांस्जीन के साथ उत्परिवर्ती वायरस हाथ करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
वहाँ दो मुख्य चिकित्सा प्रयोजनों के लिए वी.वी. के संशोधन के संबंध में लक्ष्य कर रहे हैं। ऐसा ही एक thymidine kinase (टी) जीन विरोधी ट्यूमर चिकित्सकीय प्रयोग के लिए वायरस attenuate करने के लिए के रूप में, एक विशेष जीन को नष्ट करने के लिए है। अन्य एक वांछित चिकित्सीय जीन (जैसे जीएम-सीएसएफ) के रूप में या एक मार्कर जीन (जैसे luciferase जीन के रूप में) के साथ वी.वी. हाथ करने के लिए है। इन दोनों में से किसी एक को हासिल करने के लक्ष्य क्षेत्र / जीन का विलोपन शामिल है। एक सीधा डीएनए बंधाव विधि 35 और इन विट्रो पैकेजिंग विधि 36 टी जीन संशोधनों के साथ उत्परिवर्ती चेचक वायरस उत्पन्न करने के लिए पहले से इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन तरीकों जीनोम में अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइटों की कमी के कारण जीनोम में अन्य क्षेत्रों के उत्परिवर्तन के संबंध में आवेदन सीमित है। उत्परिवर्ती वी.वी. बनाने के लिए वर्तमान दृष्टिकोण एक मुताबिक़ पुनर्संयोजन incorporati प्रेरित करने के लिए एक चयन मार्कर (आरएफपी या GFP) सीवी -1 कोशिकाओं में वी.वी. के साथ संक्रमण के बाद दो घंटे के साथ एक शटल (दाता) वेक्टर के अभिकर्मक शामिलएनजी लक्ष्य क्षेत्र में चयन मार्कर। मार्कर पॉजिटिव सजीले टुकड़े का चयन उनकी शुद्धि 24 घंटे बाद अभिकर्मक के बाद है। पट्टिका शुद्धिकरण की प्रक्रिया, 10 राउंड तक का समय लग सकता है पिछले 3-4 सप्ताह और अक्सर बंद लक्ष्य क्षेत्रों में डाला चयन मार्कर के साथ अवांछित पुनः संयोजक वायरस की ओर जाता है। डीएनए डबल कतरा टूटता प्रभावी ढंग से स्तनधारी कोशिकाओं 37 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन पैदा कर सकते हैं, और इस तंत्र का दोहन करके, उत्परिवर्ती वी.वी. पैदा करने की दक्षता में काफी सुधार किया जा सकता है। GRNA निर्देशित Cas9 सिस्टम सफलतापूर्वक एडीनोवायरस और प्रकार के जीनोम मैं दाद सिंप्लेक्स वायरस gRNA निर्देशित Cas9 द्वारा संपादित किया गया मेजबान कोशिकाओं में जीनोम संपादन में कार्यरत किया गया है और, यूकेरियोटिक जीवों 22 में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की क्षमता को बढ़ाता है 25। हाल ही में, प्रणाली 24। यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि CRISPR Cas9 प्रणाली कुशलतापूर्वक वी.वी. जीनोम संपादन और एक व्यक्त करने के लिए एक वी.वी. वेक्टर के निर्माण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैविशेष जीन।
दोनों N1L gRNA निर्देशित Cas9 और पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) विधि N1L का एक ही लक्ष्य साइट पर सफल मानव संसाधन की घटनाओं में हुई। दिलचस्प है, हालांकि gRNA निर्देशित Cas9 प्रेरित मानव संसाधन पारंपरिक विधि की तुलना में मानव संसाधन क्षमता का बहुत उच्च स्तर पर। इस प्रकार, gRNA निर्देशित Cas9 के उपयोग उत्परिवर्ती वीवीएस प्राप्त करने के लिए के रूप में कई सजीले टुकड़े को शुद्ध करने की आवश्यकता समाप्त। इस काम में, हम काफी उत्परिवर्ती वी.वी. gRNA निर्देशित Cas9 प्रणाली का उपयोग करते हुए 33 की पीढ़ी के लिए दक्षता और समय-सीमा में सुधार हुआ। ध्यान से, मुताबिक़ पुनर्संयोजन के एक उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम पारंपरिक मुताबिक़ पुनर्संयोजन के प्रदर्शन से पहले plasmids 24 घंटे के लिए Cas9 और gRNA व्यक्त के साथ CV-1 कोशिकाओं transfect करने के लिए है। 24 घंटे के अंतराल Cas9 और gRNA एक उचित स्तर पर व्यक्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, gRNA अनुक्रम एक विशेष जीन को निशाना बनाने के रूप में हमने पाया है कि अलग अलग gRNA दृश्यों टी अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैargeting N1L जीन उनकी क्षमता 33, 34 में विविध।
संपादन वी.वी. में CRISPR / Cas9 के लिए सीमा पुनर्संयोजन के पहले दौर में आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े की दर कम है। जो बनाता पहले दौर थकाऊ स्क्रीनिंग आरएफपी सकारात्मक पुनः संयोजक वायरस युक्त सजीले टुकड़े के लिए पर्याप्त संख्या में, आम तौर पर कम से कम दस 6 अच्छी तरह प्लेटें की जरूरत है, प्राप्त करने के लिए। इसलिए, वहाँ अभी भी प्रोटोकॉल इस सीमा को पार करने के लिए अनुकूलन करने के लिए एक की जरूरत है।
आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े के छोटे आकार के एक अन्य संभावित समस्या है, जो lysate के एक उच्च मात्रा एक 6 अच्छी तरह से थाली को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल की वजह से है। इस पर काबू पाने के लिए, lysate की एक छोटी मात्रा एक 6 अच्छी तरह से थाली संक्रमित करने के लिए बड़े आकार आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। lysate की एक छोटी मात्रा का उपयोग करना भी आरएफपी नकारात्मक लोगों से आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े के बेहतर जुदाई के लिए सक्षम हो जाएगा। नतीजतन पट्टिका शुद्धि के कम दौर शुद्ध आरएफपी पॉजिटिव सजीले टुकड़े प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं।
<pवर्ग = "jove_content"> बंद लक्ष्य प्रभाव हमेशा जीन संपादन में एक अवांछित मुद्दा है। CRISPR-Cas9 बंद लक्ष्य प्रभाव को दिखाया गया है। हालांकि, gRNA से सावधान डिजाइन के साथ, बंद लक्ष्य प्रभाव जब संपादन वी.वी. जीनोम 33, 34 से बचा जा सकता है। इस संपादन वी.वी. के जीनोम के लिए gRNA निर्देशित Cas9 प्रणाली का उपयोग करने का विशेष लाभ होता है। वी.वी. के वादे को देखते हुए, CRISPR / Cas9 प्रणाली का उपयोग जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए और ट्रांसलेशनल मेडिसिन में उत्परिवर्ती वीवीएस के विकास को गति देगा। इसके अलावा, एक ऐसी प्रणाली भी इस तरह के संकेत दे अपने actin आधारित गतिशीलता के लिए वी.वी. द्वारा इस्तेमाल के लिए रास्ते के विच्छेदन के रूप में कोशिका जीव विज्ञान में खोजों, में तेजी लाने जाएगा।The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |