Summary
Vacciniavirus (VV) har vært mye brukt i biomedisinsk forskning og forbedring av menneskers helse. Denne artikkelen beskriver en enkel, svært effektiv metode for å redigere VV genomet ved hjelp av en CRISPR-Cas9 system.
Introduction
Vacciniavirus (VV) er en omhyllet DNA-virus som tilhører poxvirus familien og har spilt en avgjørende rolle i en av de største prestasjonene i medisin for utrydding av kopper. I post-utrydding æra av kopper, har VV blitt utviklet som en vektor for å levere gener for vaksiner mot HIV og andre smittsomme sykdommer 1-7 ved å sette inn gener fra ulike patogener i VV vektorer. VV har også blitt mye brukt som en vektor for cancer immunoterapi, spesielt 8-14 for utviklingen av tumormålrettet replikerende onkolytisk vacciniavirus. For å skape en effektiv vaksine vektor med forbedret selektivitet for kreftceller, blir modifikasjoner innenfor det virale genom som kreves, inkludert genet delesjoner eller innføring av terapeutiske gener.
Med utviklingen av DNA-teknologi, og en bedre forståelse av molekylær biologi og virologi, innsettingen av fremmed DNA inn i VV ble opprinnelig oppnåd hjelp homolog rekombinasjon (HR) i 1980 15. Denne metoden er fortsatt mye brukt for å konstruere VV vektorer. Innføring av den genetiske modifikasjon blir oppnådd ved hjelp av en pendelvektor for HR, som rekombinerer med VV genomet i pre-infiserte celler. Imidlertid har denne metode vist seg å være svært ineffektive (mindre enn 1% homolog rekombinasjon effektivitet 16) og resulterer ofte i tilfeldig innsetting av seleksjonsmarkøren inn i ikke-målrettede regioner og / eller tap av markøren på viruset ekspansjon.
Effektiviteten av DNA homolog rekombinasjon for innsetting av eksogent DNA i genomisk loci kan bli dramatisk forbedret i nærvær av dobbelttrådsbrudd (DSB) 17. Derfor er teknologi som kan indusere DSB sin på målet loci har et stort potensiale for genom prosjektering av VV.
Det nyutviklede CRISPR-Cas9 system viser løfte om å utløse DSB sin i noen VV genet regionen. CRISPR-Cas9 er en RNA-guidet nuklease involvert i adaptiv immunitet mot invaderende fager og andre utenlandske genetisk materiale 18-20. Det er tre CRISPR-Cas systemer i en rekke mikrobielle arter 21. Den type II CRISPR-Cas system er mye brukt for redigering av genomet av eukaryote celler og store virus. Det består av RNA-styrt Cas9 endonuklease (fra Streptococcus pyogenes), en enkelt hjelpe RNA (sgRNA) og trans-aktiverende crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA kompleks gjenkjenner den komplementære 20-nukleotid-genomisk sekvens foregående en 5'-NGG-3 'Protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens i pattedyrceller 22, 23. Det har vært brukt med hell for effektiv generering av genetisk modifiserte celler, virus og dyremodeller 22-32.
Den CRISPR-Cas9 system har vist seg å være et effektivt verktøy for genom målretting i kombinasjon med homolog rekombinasjon i cytoplasma av VV infiserte CV-1-celles å generere mutante vacciniavirus 33, 34. For å øke den potensielle anvendelsen av denne metoden, presenterer vi detaljert informasjon om dette system metodikk. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å skape en mutant VV med et bestemt gen delesjon og / eller arm mutant-viruset med et terapeutisk transgen.
Protocol
1. Utarbeidelse av Target RNA og Cas9 Konstruksjoner og reparasjon Donor Vector
- Kloning av gRNAs
- Design en guide-RNA målsekvens rettet mot N1L genet av vaccinia virus etter prinsippet nevnt tidligere 25. Juster styre-RNA-targetsekvensen mot genomet av vaccinia virus (i dette tilfellet, Lister stamme av vaccinia-virus) for å utelukke eventuelle off-target gRNA målsekvenser.
- Syntetisere og klone gRNA oligoer inn i et gRNA kloningsvektor slik som beskrevet tidligere 25. Bekrefte sekvensen av hver enkelt gRNA i den resulterende vektor av Sanger-sekvensering 33. Navn den resulterende gRNA konstruere som gRNA N2 33.
MERK: gRNA målområde er innenfor N1L genet, og er i området mellom venstre arm og høyre arm at reparasjon givervektor dekker (se figur 1).
- Klone Cas9-genet som mangler det nukleære lokaliseringssignal (NLS) ipST1374 vektor og utpeke konstruere som PST-Cas9 33.
NOTE: Alle pattedyrekspresjonsvektor kloningsvektor kan anvendes for bygging av Cas9 ekspresjonsvektor. - Bygging av reparasjon donor vektor for HR
- Bruk N1L genet av VV som målområdet for modifisering 33. Sørg for at lengdene av venstre og høyre arm er ca 500-600 bp hver, og flankerer målområdet.
MERK: Den venstre arm / høyre arm kan ha opp til 50 bp overlapping med målområdet (se figur 1). - Klone N1L regionen reparasjon donor vektor som beskrevet tidligere 33, 34 og utpeke reparasjon donor vektor som PT-N1L.
MERK: Se figur 1 for reparasjon donor vektor og dens målområdet. Andre regioner av VV kan bli målrettet ved å bruke region (gen) -spesifikk gRNA (e) og regionspesifikke reparasjon donor vektor. Alle kloningsvektor kan anvendes for konstruksjon av reparasjonen donor-vektoren. </ Ol>
- Bruk N1L genet av VV som målområdet for modifisering 33. Sørg for at lengdene av venstre og høyre arm er ca 500-600 bp hver, og flankerer målområdet.
- Utvidelse av plasmid
- Transform plasmidet inn i kjemisk kompetente E. coli i henhold til produsentens instruksjoner. Rens plasmidet ved hjelp av et plasmid ekstraksjon kit henvisning til protokollen fra produsenten.
2. Seeding Cells (Dag 1)
- Opprettholde CV-1-celler (apenyre fibroblaster) i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) supplert med 5% føtalt bovint serum (FBS), 100 U / ml penicillin, og 100 mikrogram / ml streptomycin, ved 37 ° C med 5% CO 2.
- Trypsineres CV-1-celler som er 80-90% konfluent
- Fjerne cellekulturmediet fra T-175-kolbe inneholdende CV-1-celler. Skyll den monolaget med 5 ml steril PBS for å fjerne gjenværende serum og suge PBS. Legg 2,5 ml 1 x Trypsin-EDTA-løsning for å dekke cellene og plassere kolben i 37 ° C inkubator i ca. 5 min for å hjelpe til celle løsgjøring.
- Legg til10 ml cellekulturmedium (se trinn 2.1) for å suspendere cellene ved mild pipette handling. Telle celle tall ved hjelp av en hemocytometer.
- Seeding cellene i 6-brønners plater
- Seed 2 x 10 5 CV-1-celler i 2 ml cellekulturmedium til hver brønn i en 6-brønn plate på dag før transfeksjon.
NB: Et ytterligere sentrifugeringstrinn for å fjerne trypsin er ikke nødvendig.
- Seed 2 x 10 5 CV-1-celler i 2 ml cellekulturmedium til hver brønn i en 6-brønn plate på dag før transfeksjon.
3. Transfeksjon av Cas9 Plasmid og gRNA Plasmid (Dag 2)
- Transfektere CV-1 celler (utarbeidet i trinn 2.2.3.1) med 0,5 pg pST-Cas9 plasmid og 0,5 mikrogram gRNA N2 plasmid ved hjelp av en transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner.
- Cellene inkuberes i 24 timer i en inkubator (37 ° C med 5% CO2), og deretter erstatte mediet med 2 ml friskt cellekulturmedium (beskrevet i trinn 2.1).
4. Infeksjon av CV-1 celler og Transport Donor VEctor Transfeksjon for HR (Dag 3)
- Fortynn ryggraden VVL15 virus med DMEM cellekulturmedium til en konsentrasjon på 2 x 10 5 pfu / ml. 24 timer etter transfeksjon av Cas9 og gRNA plasmider, tilsett 100 ul av den fortynnede viruset inn i hver brønn av de transfekterte CV-1-celler.
- 2 timer etter virusinfeksjon, transfektere 1,0 mikrogram shuttle donor vektor inn VVL15-infiserte celler for HR ved hjelp av en transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Plasser de transfekterte celler i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 24 timer.
5. høste rekombinant virus (Dag 4)
- Etter 24 timer av transfeksjon med shuttle donor vektor for HR i trinn 4.2, løsne de transfekterte CV-1 celler ved hjelp av en celle skrape. Samle cellesuspensjonen inn i en kryoampulle og oppbevar ved -80 ° C for fremtidig bruk.
MERK: Tørk av cellekulturmedium søl med desinfeksjonsmiddel umiddelbart og tørk igjen med 70% ethanol.
6. Rensing av Modified VV (First Round)
- På dag 1, frø 15 6-brønns plater med 3 x 10 5 CV-1-celler i hver brønn.
- På dag 2, tine frosne cellesuspensjonen fra trinn 5,1 i et vannbad ved 37 ° C i 3 minutter og Vortex cryovials kraftig i 30 s for å oppnå cellelysat uten å fjerne celleavfall.
- For infeksjon av en 6-brønns plate med CV-1-celler, fortynnet 1 ul cellelysat med 3 ml DMEM og tilsett 0,5 ml av den fortynnede cellelysat inn i hver brønn på 6-brønners plate på toppen av media allerede nåværende. Infisere alle seks-brønns plater fremstilt i trinn 6.1.
MERK: Fjerning av cellerester ikke er nødvendig. - Etter to dager med infeksjon (dvs. på dag 4), identifisere RFP-positive plakk under et fluorescens mikroskop ved hjelp 10X objektiv og merke plaketter under platen ved hjelp av en tusj ved sirkle plakk plassering.
MERK: Se- Fremstille seks merkede cryovials inneholdende 200 ul serumfritt DMEM cellekulturmedium for å plukke opp seks forskjellige RFP-positive plaques. Aspirer cellekulturmediet fra brønnen med merkede plakk (e) (trinn 6.3). Fest en 200 mL tips til en P200 pipette, sett volumet på 30 ul og ta ~ 10 mL cellekulturmedium fra en kryoampulle.
- Hold pipetten knappen uten å slippe medium og bruk spissen for å lage riper i området av en merket plakk. Slipp pipette knappen for å løfte opp frittliggende celler og overføre den til kryoampulle inneholder 190 mL av serumfritt DMEM.
- Ta en annen 10 mL medium fra hetteglasset med riper celler (fra siste trinn) og gjenta prosedyren for å plukke opp den samme RFP-positive plakk tre ganger for å samle så mange riper celler som mulig. Overfør alle cellene i den samme flasken og lagre flasken ved -80 ° C.
7. Rensing av Modified VV (Second Round)
- Seed 3 x 10 5 CV-1-celler i hver brønn av seks til 6-brønns plater og kultur cellene i 24 timer.
- Tine frosne cryovials (fra trinn 6.3.3) i 37 ° C vannbad i 3 min, deretter vortex de cryovials kraftig i 30 sekunder for å oppnå cellelysat.
- Tilsett 0,5 mL av den blandede cellelysat til en brønn i en 6-brønns plate. Infisere en seks-brønns plate for hver plakk. Inkuber VV-infiserte 6-brønners plater ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dager (Andre runde plakkrensing). Deretter gjentar avsnitt 6.3.
MERK: Mer enn seks RFP-positive plakk kan plukkes opp; to eller flere 6-brønns plater kan benyttes for rensing av hver enkelt plakk.
- Tilsett 0,5 mL av den blandede cellelysat til en brønn i en 6-brønns plate. Infisere en seks-brønns plate for hver plakk. Inkuber VV-infiserte 6-brønners plater ved 37 ° C med 5% CO2 i 2 dager (Andre runde plakkrensing). Deretter gjentar avsnitt 6.3.
8. Flere runder med Plaque Purifiser
- Bærer på en ytterligere tre til fem runder med rensing ved å følge samme protokoll som er beskrevet i trinn 7 til alle de plakk som dannes fra en positiv plakk synes å være RFP-positive under et mikroskop.
MERK: Dette plakett da anses ren. - Når plakk er ren (figur 4, alle infiserte celler som uttrykker RFP), høste en positiv plakett til en kryoampulle og oppbevares ved -80 ° C som beskrevet i kapittel 6.3. Kontroller plakett følge protokollen beskrevet i trinn 9 og 10.
9. Utvid Renset Plakk (s)
- Seed 3 x 10 5 CV-1 celler til hver brønn i en 6-brønns plate en dag før virusinfeksjon.
- Tine frosne kryoampulle fra 8,2 i et 37 ° C vannbad i 3 minutter for å oppnå cellelysat. Legg alle lysatet (uten å fjerne celleavfall) inn i en brønn i en 6-brønns plate med CV-1-celler (sådd i trinn 9.1). Inkuber infiserte CV-1-celler ved 37 ° C med 5% CO 2 i inntil tre dager.
- Utvid alle de rensede plaketter (minst tre plaketter).
MERK: infeksjon Tiden varierer fra 1-3 dager, avhengig av mengden av virus i lysatet.
- Utvid alle de rensede plaketter (minst tre plaketter).
- Høste VV-infiserte celler ved anvendelse av en celleskrape når mer enn 50% celler viser cytopatisk effekt observeres under et mikroskop (celler er avrundet, lett frittliggende og RFP positiv). Samle de frigjorte celler sammen med cellekulturmedium inn i et 15 ml rør.
- Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 g i 3 min. Fjern supernatanten og holde cellepelleten ved -80 ° C inntil videre anvendelse eller bruk cellepelleten umiddelbart etter trinn 10.
10. Verifisering av Modifisering av Mutant VV Ved hjelp av PCR
- Utdrag VV DNA fra cellepelleten fremstilt i trinn 9.3.1 ved anvendelse av en DNA-ekstraksjon sensoren ved å følge produsentens protokoll. Elueres DNA med 200 ul dobbeltdestillert vann.
MERK: Bruk halvparten av volumet av pelleten for å ekstrahere DNA og holde resten for virusproduksjon dersom klon er bekreftet å inneholde de korrekte modifikasjon / innsetting. - Verifisering av delesjon av genet N1L og innsetting av RFP gen i N1L regionen.
- Amplifisere et DNA-fragment som strekker seg over N1L genet (L025) og L026-genet ved anvendelse av primere konstruert mot N1L genet. Forsterke RFP gen ved hjelp av RFP-spesifikke primere. Amplifisere et kontroll-DNA-fragment som strekker seg over A52R ved PCR ved anvendelse av A52R-spesifikke primere.
MERK: Se liste over materialer for spesifikke primere.- Utfør PCR ved hjelp av en PCR-mester mix kit. Sett opp 25 mL av PCR-reaksjon ved hjelp av to mL av DNA mal, denaturere PCR reaksjonen ved 94 ° C i 2 minutter, og deretter kjøre 30 sykluser av PCR følgende fremgangsmåte: denaturering av DNA ved 94 ° C i 15 s, deretter gløding primere til DNA-templater ved 52 ° C i 15 s strekker seg PCR-reaksjonen ved 72 ° C i 30 sek.
- Amplifisere et DNA-fragment som strekker seg over N1L genet (L025) og L026-genet ved anvendelse av primere konstruert mot N1L genet. Forsterke RFP gen ved hjelp av RFP-spesifikke primere. Amplifisere et kontroll-DNA-fragment som strekker seg over A52R ved PCR ved anvendelse av A52R-spesifikke primere.
- Løse PCR-produkter ved å bruke en 1% agarosegel 33. Fang gel bildet ved hjelp av en UV gel doc. Dersom N1L PCR er negativ og A52R og RFP PCR er positive, så plakk er riktig modifisert i N1L regionen.
Representative Results
For bygging av en ny VV vektor, er nøkkelen utgangspunkt for å designe og konstruere en donor shuttle vektor som kan målrette en bestemt region av genomet. I denne studien ble den VV N1L-genet brukt som et eksempel målet. Kassetten av donor shuttle-vektoren for rekombinasjon og målrettet region i VV er vist i figur 1. For å forbedre effektiviteten av den homologe rekombinasjon, plasmider som uttrykker Cas9 og en N1L-spesifikk gRNA ble ko-transfektert inn i CV- -1 celler 48 timer før du utfører homolog rekombinasjon 33. En dag (24 timer) etter transfeksjon, RFP ble uttrykt i CV-1 celler (figur 2). Etter infeksjon av CV-1-celler med hele lysat fra homolog rekombinasjon (trinn 5), RFP-positive og negative plakker ble begge observert i CV-1-celler (figur 3). Etter rensing protokollen beskrevet, en ren plaque co uld oppnås etter 3-5 runder med rensing. Som vist i figur 4, er alle plakk etter infeksjon med cellelysat som stammer fra en ren plaque med det mutante vacciniavirus presentert en RFP signal. For å verifisere hvorvidt den rene mutant VV hadde riktig genet modifikasjon, ble PCR anvendt for å bekrefte fraværet av den målrettede N1L-genet, som vist i figur 5. PCR av det modifiserte virus viste et positivt signal for RFP og en fraværende signal for N1L ( Figur 5 lane AG), mens PCR resultatene av N1L for kontroll virus (Ctr) med en intakt N1L region er positiv. Kontroll DNA-fragmenter av A52R var positive for alle rekombinante virus og Ctr virus. HR effektivitet i RFP-positive plaques er 100% (6/6) i dette forsøket (det var opp til 94% i tidligere arbeid 34). Fremgangsmåten som her er beskrevet har forbedret effektivitet rekombinasjon med mer enn 100 ganger sammenlignet med konvensjonelle protokoller 33, 34.
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Fig. 1: Kassetten av donor pendelvektor for homolog rekombinasjon og målrettet region i genomet VV Rensingen markørgen RFP er drevet av H5 promoter. Reparasjonen donor vektor rettet mot de N1L regionen resultatene i RFP gen blir innlemmet i N1L regionen etter homolog rekombinasjon. 'X' indikerer homolog sekvens i reparasjons donor vektor som vil erstatte den samme sekvensen på vacciniavirus genomet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Imaging av CV-1-celler en dag etter homolog rekombinasjon En dag etter homolog rekombinasjon, celler infisert med VV og transfektert ved reparasjon donor vektoren er RFP-positive A.: Fase kontrastrikt bilde (opprinnelig forstørrelse 100X) B:. Fluorescensmikroskopi bilde (opprinnelig forstørrelse 100X). Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: En RFP-positive plakk i den første runden rensing av mutant-viruset i den første runde rensing av det mutante viruset, er det RFP-positive plakk (markert med rød linje) med målområdet slettingen omgitt av plakk dannet ved villtype virus (innringet med gul linje.) A: Phase kontrast (original forstørrelse 100X) B:. Fluorescens microscopy bilde (original forstørrelse 100X). Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. VV Etter 3-5 runder med rensing, ble rene plaketter oppnådd som alle plaketter ren muterte var RFP-positive A:. Fase kontrast (original forstørrelse 100X) B:. Fluorescensmikroskopi bilde (original forstørrelse 100X) . Scale bar = 50 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Verification av det rene mutant VV. DNA ble ekstrahert fra VV infiserte CV-1-celler. Slettingen av målområdet N1L ble bekreftet ved PCR ved anvendelse av primere N1L, ble innsetting av RFP inn i N1L region bekreftet ved PCR ved anvendelse av primere RFP. Lanes AF tilsvare seks rensede plakk, er kjørefelt G en kontroll plakett med N1L sletting bekreftet i tidligere arbeid 33, lane Ctr (kontroll) er den villtype vacciniavirus (med N1L region intakt). A52R genet ble forsterket som kontrollen genet for alle prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er to hovedmålene om lempning av VV for terapeutiske formål. Det ene er å slette en bestemt gen, slik som tymidinkinase (TK) genet for å svekke viruset for anti-tumor terapeutiske anvendelse. Den andre er å arm VV med en ønsket terapeutisk gen (slik som GM-CSF) eller et markør-gen (slik som luciferase-genet). Oppnå en av disse innebærer sletting av en målområdet / genet. En direkte DNA-ligeringsmetode 35 og en in vitro metode for innpakning 36 har tidligere blitt benyttet for å generere mutante vaccinia virus med tk-genet modifikasjoner. Imidlertid har disse fremgangsmåter begrenset anvendelse av mutasjon i andre regioner i genomet på grunn av mangel av unike restriksjonsenzymseter i hele genomet. Den nåværende tilnærming til å skape mutant VV innebærer transfeksjon av en shuttle (donor) vektor med en seleksjonsmarkør (RFP eller GFP) i CV-1 celler to timer etter infeksjon med VV å indusere en homolog rekombinasjon incorporating seleksjonsmarkøren inn i målområdet. Valg av markør-positive plakk blir etterfulgt av deres rensing 24 timer etter transfeksjon. Plaketten Renseprosessen kan ta opptil 10 runder, siste 3-4 uker, og ofte fører til uønskede rekombinante virus med seleksjonsmarkører satt inn i off-target regioner. DNA-dobbeltstrengbrudd effektivt kan indusere homolog rekombinasjon i pattedyrceller 37, og ved å utnytte denne mekanismen, kan effektiviteten av å generere mutant VV være vesentlig forbedret. Den gRNA styrt Cas9 systemet har blitt ansatt i genomet redigering og forbedrer effektiviteten av homolog rekombinasjon i eukaryote organismer 22, 25. Nylig i vertsceller genomene til adenovirus og type I herpes simplex virus ble redigert av gRNA styrt Cas9 system 24. Det har nylig blitt vist at CRISPR Cas9 system er et kraftig verktøy for effektivt å redigere VV genomet og konstruere en VV vektor for å uttrykke enbestemt gen.
Både N1L gRNA styrt Cas9 og den tradisjonelle homolog rekombinasjon (HR) metoden resulterte i vellykkede HR hendelser på samme målområde av N1L. Interessant, men gRNA styrt Cas9 indusert HR ved mye høyere nivåer av effektivitet enn den tradisjonelle metoden HR. Således, ved bruk av gRNA styrte Cas9 eliminerer behovet for å rense så mange plaques for å oppnå mutant VVS. I dette arbeidet har vi effektivisert og tidsramme for generering av mutant VV bruker gRNA styrt Cas9 system 33 betydelig. Av notatet, en kritisk steg for å oppnå en høy virkningsgrad homolog rekombinasjon er å transfektere CV-1 celler med plasmidene uttrykker Cas9 og gRNA for 24 timer før du utfører den konvensjonelle homolog rekombinasjon. Den 24-timers intervall gir Cas9 og gRNA til å bli uttrykt på et rimelig nivå. Videre kan gRNA sekvens målrettet mot et spesielt gen må være optimalisert som vi har funnet at de forskjellige gRNA sekvenser tålrettingsvalg N1L gen varieres i deres effektivitet 33, 34.
Begrensningen for CRISPR / Cas9 i redigering VV er den lave frekvensen av RFP-positive plakk i den første runden av rekombinasjon. For å oppnå et tilstrekkelig antall RFP-positiv plakk inneholdende rekombinant virus, som regel minst ti 6-brønns plater er nødvendig, noe som gjør første runde screening langtekkelig. Derfor er det fortsatt et behov for å optimalisere protokollen for å overvinne denne begrensningen.
Den lille størrelsen på RFP-positive plakk er et annet potensielt problem, noe som skyldes et høyt volum av lysat som brukes til å infisere en 6-brønns plate. For å overvinne dette, bør et mindre volum av lysat anvendes for å infisere en 6-brønns plate for å oppnå større format RFP-positive plaques. Ved hjelp av et mindre volum av lysat vil også gjøre det mulig for bedre separasjon av RFP-positive plakk fra RFP-negative. Følgelig færre runder med plakkrensing er nødvendig for å få rene RFP-positive plakk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
