Summary
virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.
Introduction
virus vaccinico (VV) è un virus a DNA con involucro appartenente alla famiglia poxvirus e ha svolto un ruolo cruciale in uno dei più grandi successi nel campo della medicina della eradicazione del vaiolo. Nell'era post-eradicazione del vaiolo, VV è stato sviluppato come un vettore per la consegna di geni per i vaccini contro l'HIV e altre malattie infettive 1-7 con l'inserimento di geni provenienti da vari agenti patogeni in vettori VV. VV è anche stato ampiamente utilizzato come vettore per l'immunoterapia del cancro 8-14 particolare per lo sviluppo del virus vaccinia oncolytic tumore targeting replica. Al fine di creare un vettore di vaccino efficace con migliorata selettività per le cellule tumorali, sono necessarie modifiche all'interno del genoma virale, compresa gene delezioni o introduzione di geni terapeutici.
Con lo sviluppo della tecnologia del DNA e una migliore comprensione della biologia molecolare e virologia, inserimento di DNA estraneo in VV originariamente conseguired utilizzando la ricombinazione omologa (HR) nel 1980 15. Questo metodo è ancora ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori VV. Introduzione della modificazione genetica si ottiene utilizzando un vettore shuttle HR, che ricombina con il genoma VV di cellule pre-infettate. Tuttavia, questo metodo ha dimostrato di essere altamente inefficiente (meno dell'1% dell'efficienza ricombinazione omologa 16) e si traduce spesso in inserzione casuale del marcatore di selezione in regioni e / o perdita del marcatore all'espansione virus non mirati.
L'efficienza del DNA ricombinazione omologa per l'inserimento del DNA esogeno in loci genomici può essere notevolmente migliorata in presenza di rotture del doppio filamento (DSB) 17. Pertanto, la tecnologia che può indurre a DSB loci bersaglio ha un grande potenziale per l'ingegneria del genoma di VV.
Il sistema CRISPR-Cas9 recentemente sviluppato mostra la promessa per l'attivazione DSB in qualsiasi regione del gene VV. CRISPR-Cas9 è un RNAnucleasi guidata coinvolti nella immunità adattativa contro fagi invasori e altri materiali genetici estranei 18-20. Ci sono tre sistemi CRISPR-Cas in una vasta gamma di specie microbiche 21. Il sistema CRISPR-Cas tipo II è ampiamente usato per modificare il genoma delle cellule eucariotiche e grandi virus. Si tratta del Cas9 endonucleasi RNA-guida (da Streptococcus pyogenes), una sola guida di RNA (sgRNA) e la trans-attivazione crRNA (tracrRNA) 22-24. Il complesso Cas9 / sgRNA riconosce l'complementare 20-nucleotide sequenza genomica che precede una sequenza 5'-NGG-3 'Protospacer motivo adiacente (PAM) in cellule di mammifero 22, 23. E' stato usato con successo per un efficace generazione di cellule geneticamente modificate, virus e modelli animali 22-32.
Il sistema CRISPR-Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento efficace per il targeting genoma in combinazione con ricombinazione omologa nel citoplasma della cellula infettata VV CV-1s per generare virus vaccinia mutanti 33, 34. Al fine di estendere il potenziale applicazione di questo metodo, vi presentiamo informazioni dettagliate sulla metodologia di questo sistema. Il protocollo descritto può essere usato per creare un VV mutante con un particolare gene delezione e / o un braccio il virus mutante con un transgene terapeutico.
Protocol
1. Preparazione di Target RNA e Cas9 costrutti e riparazione donatore vettore
- Clonazione di gRNAs
- Progettare una guida-RNA sequenza bersaglio mira il gene N1L di virus del vaccino seguendo il principio affermato in precedenza 25. Allineare la sequenza bersaglio guida-RNA contro il genoma del virus del vaccino (in questo caso, Lister ceppo di virus del vaccino) per escludere eventuali sequenze bersaglio gRNA centra la porta.
- Sintetizzare e clonare oligos gRNA in un vettore di clonaggio gRNA come descritto in precedenza 25. Confermare la sequenza di ogni singolo gRNA nel vettore risultante dal sequenziamento Sanger 33. Nome risultante gRNA costruire come gRNA N2 33.
NOTA: Il sito target gRNA è all'interno del gene N1L, ed è nella regione tra il braccio sinistro e il braccio destro che le coperture vettore riparazione donatori (vedi Figura 1).
- Clonare il gene Cas9 manca il segnale di localizzazione nucleare (NLS) nelpST1374 vettoriale e designare il costrutto come PST-Cas9 33.
NOTA: Qualsiasi mammiferi espressione vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore di espressione Cas9. - Costruzione di vettore di riparazione dei donatori per HR
- Utilizzare il gene N1L di VV come la regione di destinazione per la modifica 33. Assicurarsi che le lunghezze dei bracci destro e sinistro sono circa 500-600 bp ciascuno, e che fiancheggia la regione di destinazione.
NOTA: Il braccio / braccio destro sinistro può avere fino a 50 bp sovrapposizione con la regione di destinazione (vedi figura 1). - Clonare la regione di riparazione vettore donatore N1L come descritto in precedenza 33, 34 e designare il vettore donatore di riparazione come PT-N1L.
NOTA: Vedere la Figura 1 per il vettore di riparazione donatore e la sua regione di destinazione. Altre regioni del VV possono essere mirati utilizzando regione (gene) SPECIFICI gRNA (s) e vettoriale riparazione donatore specifici per regione. Qualsiasi vettore di clonaggio può essere utilizzato per la costruzione del vettore riparazione donatore. </ Ol>
- Utilizzare il gene N1L di VV come la regione di destinazione per la modifica 33. Assicurarsi che le lunghezze dei bracci destro e sinistro sono circa 500-600 bp ciascuno, e che fiancheggia la regione di destinazione.
- L'espansione del plasmide
- Trasformare il plasmide in E. chimicamente competente coli secondo le istruzioni del produttore. Purificare il plasmide usando un kit di estrazione plasmide riferimento al protocollo fornito dal produttore.
2. Le cellule Semina (Giorno 1)
- Mantenere CV-1 cellule (fibroblasti di rene di scimmia) in Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con siero 5% bovino fetale (FBS), 100 U / mL di penicillina, e 100 mg / streptomicina mL, a 37 ° C con 5% di CO 2.
- Trypsinize CV-1 le cellule che sono 80-90% confluenti
- Rimuovere il terreno di coltura cellulare dal pallone T-175 contenenti cellule CV-1. Risciacquare il monostrato con 5 ml di PBS sterile per rimuovere il siero residuo e aspirare il PBS. Aggiungere 2,5 mL di soluzione 1 × tripsina-EDTA per coprire le cellule e mettere il pallone in 37 ° C incubatore per circa 5 minuti per aiutare il distacco delle cellule.
- Aggiungere10 ml di terreno di coltura cellulare (vedi punto 2.1) di sospendere le cellule delicata azione pipetta. Contare le numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Semina cellule in 6 pozzetti
- Seed 2 × 10 5 CV-1 cellule in 2 ml di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione.
NOTA: Un passo ulteriore centrifugazione per rimuovere tripsina non è richiesta.
- Seed 2 × 10 5 CV-1 cellule in 2 ml di mezzo di coltura cellulare in ciascun pozzetto di una piastra da 6 pozzetti il giorno prima della transfezione.
3. Trasfezione di Cas9 plasmidi e gRNA plasmidi (2 ° giorno)
- Trasfezione CV-1 le cellule (previste al punto 2.2.3.1) con 0,5 mcg PST-Cas9 plasmide e 0,5 mg gRNA N2 plasmide usando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore.
- Incubare le cellule per 24 h in un incubatore (37 ° C con 5% CO 2), e quindi sostituire il mezzo con 2 ml di terreno di coltura cellulare fresca (descritto nel passaggio 2.1).
4. L'infezione di CV-1 le cellule e navetta donatore Vettore Transfection per HR (3 ° giorno)
- Diluire il virus VVL15 backbone con terreno di coltura cellulare DMEM ad una concentrazione di 2 x 10 5 pfu / ml. 24 ore dopo la trasfezione di Cas9 e gRNA plasmidi, aggiungere 100 ml di virus diluito in ciascun pozzetto del CV-1 cellule transfettate.
- infezioni post-virus di 2 h, trasfezione 1,0 mcg navetta vettore nelle cellule del donatore VVL15 infette per HR utilizzando un reagente di trasfezione in base alle istruzioni del produttore. Collocare le cellule trasfettate in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 per 24 h.
5. raccogliere il virus ricombinante (4 ° giorno)
- Dopo 24 ore di trasfezione con il vettore shuttle donatori per HR nella fase 4.2, staccare le cellule trasfettate CV-1 con un raschietto cellulare. Raccogliere la sospensione cellulare in un esageratamente e conservare a -80 ° C per un uso futuro.
NOTA: Rimuovere eventuali fuoriuscite di coltura cellulare di media con un disinfettante immediatamente e quindi pulire di nuovo con il 70% Ethanolo.
6. Purificazione della VV Modified (primo turno)
- Il giorno 1, seminare 15 6 pozzetti con 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto.
- Il giorno 2, scongelare la sospensione di cellule congelate dal punto 5.1 in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 min e agitare le cryovials vigorosamente per 30 s per ottenere lisato cellulare senza rimuovere detriti cellulari.
- Per l'infezione di una piastra da 6 pozzetti di CV-1 cellule, diluire 1 ml di lisato cellulare con 3 ml di DMEM e aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare diluita in ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti, sulla parte superiore del supporto già presente. Infettare tutti i 6 pozzetti previste al punto 6.1.
NOTA: La rimozione di detriti cellulari non è necessaria. - Dopo due giorni di infezione (vale a dire, il giorno 4), identificare le placche RFP-positivi sotto un microscopio a fluorescenza utilizzando 10X lente obiettiva ed etichettare le placche sotto la piastra utilizzando un pennarello cerchiando la posizione della placca.
NOTA: Vedere- Preparare sei cryovials etichettati contenenti 200 microlitri DMEM mezzo di coltura cellulare senza siero per raccogliere sei diverse placche RFP-positivo. Aspirare il terreno di coltura cellulare dal pozzo con targa marcato (s) (passo 6.3). Fissare una punta di 200 microlitri di una pipetta P200, impostare il volume a 30 ml e prendere ~ 10 microlitri terreno di coltura cellulare da un esageratamente.
- Tenere premuto il pulsante pipetta spinta senza rilasciare il medio e utilizzare la punta di graffiare la superficie di una placca etichettati. Rilasciare il tasto pipetta spinta per sollevare le cellule staccate e trasferirlo nel esageratamente contenente 190 ml di DMEM senza siero.
- Prendere un altro 10 microlitri di media dalla fiala con le cellule graffiati (da ultimo passo) e ripetere la procedura di prendere in mano la stessa RFP-positivo targa tre volte quello di raccogliere il maggior numero di cellule graffiati possibile. Trasferire tutte le celle nella stessa fiala e conservare il flacone a -80 ° C.
7. Purificazione della VV Modified (secondo turno)
- Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di sei 6 pozzetti e la cultura le cellule per 24 h.
- Scongelare i cryovials congelati (dal punto 6.3.3) a 37 ° C bagnomaria per 3 minuti, poi vortice i cryovials vigorosamente per 30 secondi per ottenere lisato cellulare.
- Aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare mista ad un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Infettare un 6-pozzetti per ogni placca. Incubare le piastre 6 pozzetti VV-infettati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Seconda purificazione placca turno). Quindi ripetere paragrafo 6.3.
NOTA: Più di sei placche RFP-positivi possono essere ritirati; due o più piastre da 6 pozzetti possono essere utilizzati per la purificazione di ogni placca.
- Aggiungere 0,5 ml di lisato cellulare mista ad un pozzetto di una piastra da 6 pozzetti. Infettare un 6-pozzetti per ogni placca. Incubare le piastre 6 pozzetti VV-infettati a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 giorni (Seconda purificazione placca turno). Quindi ripetere paragrafo 6.3.
8. cicli di placca Purizione
- Continuare altri tre a cinque cicli di purificazione seguendo lo stesso protocollo descritto nel passaggio 7 finché tutte le placche formate da una placca positiva sembrano essere RFP-positive al microscopio.
NOTA: Questa targa, allora è considerato puro. - Una volta che la placca è pura (figura 4, tutte le cellule infette che esprimono RFP), raccogliere una targa positivo in un esageratamente e conservare a -80 ° C, come descritto nel paragrafo 6.3. Verificare la placca secondo il protocollo descritto nella fase 9 e 10.
9. Espandere la placca purificata (s)
- Seed 3 × 10 5 CV-1 le cellule in ciascun pozzetto di un 6-pozzetti un giorno prima infezione da virus.
- Scongelare il esageratamente congelata da 8,2 in un bagno d'acqua a 37 ° C per 3 minuti per ottenere lisato cellulare. Aggiungere tutto il lisato (senza rimuovere i detriti cellulari) in un pozzetto di un 6-pozzetti di CV-1 le cellule (testa di serie nella fase 9.1). Incubare il CV-1 le cellule infette a 37 ° C con 5% CO 2 per 3 giorni.
- Espandere tutte le targhe pulite (almeno tre placche).
NOTA: Il tempo di infezione varia da 1-3 giorni a seconda della quantità di virus nel lisato.
- Espandere tutte le targhe pulite (almeno tre placche).
- Raccogliere le cellule VV-infettate con un raschietto cellulare quando più di 50 cellule% mostrano effetto citopatico osservato al microscopio (le cellule sono arrotondati, facilmente distaccato e RFP positivo). Raccogliere le cellule staccate insieme con mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml.
- Agglomerare le cellule per centrifugazione a 300 g per 3 min. Rimuovere il surnatante e mantenere il pellet cellulare a -80 ° C fino all'utilizzo o utilizzare il pellet cellulare immediatamente passaggio 10.
10. Verifica della modifica di Mutant VV Usando PCR
- Estratto VV DNA dal pellet cellulare preparato al punto 9.3.1 utilizzando un kit di estrazione del DNA seguendo il protocollo del produttore. Eluire il DNA con 200 ml di acqua bidistillata.
NOTA: utilizzare metà del volume del pellet per estrarre DNA e tenere il resto per la produzione virale se il clone è verificato come contenente la corretta modifica / inserimento. - Verifica della delezione del gene N1L e l'inserimento di geni RFP nella regione N1L.
- Amplificare un frammento di DNA che attraversa il gene N1L (L025) e la L026 gene utilizzando primer disegnati contro il gene N1L. Amplificare il gene RFP utilizzando primer specifico d'RFP. Amplificare un frammento di DNA di controllo si estende A52R mediante PCR utilizzando primer specifici A52R.
NOTA: vedere elenco dei materiali per primer specifici.- Eseguire la PCR utilizzando un kit master mix PCR. Impostare 25 microlitri di reazione PCR utilizzando 2 ml di DNA stampo, denaturare la reazione di PCR a 94 ° C per 2 minuti, e quindi eseguire 30 cicli di PCR seguendo questi passaggi: denaturare il DNA a 94 ° C per 15 s, poi ricottura i primer ai modelli di DNA a 52 ° C per 15 s estendono la reazione PCR a 72 ° C per 30 s.
- Amplificare un frammento di DNA che attraversa il gene N1L (L025) e la L026 gene utilizzando primer disegnati contro il gene N1L. Amplificare il gene RFP utilizzando primer specifico d'RFP. Amplificare un frammento di DNA di controllo si estende A52R mediante PCR utilizzando primer specifici A52R.
- Risolvere i prodotti di PCR utilizzando un gel 1% 33. Acquisire l'immagine del gel utilizzando un documento di gel UV. Se il N1L PCR è negativo e A52R e RFP PCR sono positivi, allora la placca viene correttamente modificata nella regione N1L.
Representative Results
Per la costruzione di un nuovo vettore VV, il punto di partenza fondamentale è quello di progettare e costruire un vettore shuttle donatore che può avere come bersaglio una particolare regione del genoma. In questo studio, il gene VV N1L stato usato come bersaglio esempio. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione e la regione mirato nel VV sono mostrati in Figura 1. Al fine di migliorare l'efficienza della ricombinazione omologa, plasmidi esprimenti Cas9 e N1L specifico gRNA state co-trasfettate in CV -1 celle 48 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa 33. Un giorno (24 ore) post-trasfezione, RFP è stata espressa in cellule CV-1 (Figura 2). Dopo infezione di CV-1 cellule con l'intero lisato dalla ricombinazione omologa (fase 5), RFP-positivi e placche negativi sono stati osservati sia nelle cellule CV-1 (Figura 3). A seguito del protocollo di purificazione descritto, una targa co puro ULD essere ottenuto dopo 3-5 giri di purificazione. Come mostrato in figura 4, tutti placche dopo l'infezione con lisato cellulare derivata da una placca puro con il virus vaccinia mutante presentato un segnale RFP. Per verificare se il mutante puro VV aveva modificazione genetica corretta, la PCR è stata utilizzata per confermare l'assenza del gene N1L bersaglio, come mostrato in Figura 5. PCR del virus modificato ha mostrato un segnale positivo per RFP e un segnale assente per N1L ( Figura 5 corsia AG), mentre i risultati di PCR della N1L del virus di controllo (Ctr) con una regione N1L intatto è positivo. I frammenti di DNA di controllo di A52R sono stati positivi per tutti i virus ricombinanti e il virus Ctr. L'efficienza delle risorse umane nelle placche RFP-positivi è del 100% (6/6) in questo esperimento (era fino al 94% nel lavoro precedente 34). Il metodo qui descritto è migliorata l'efficienza di ricombinazione di più di 100 volte rispetto ai protocolli convenzionali 33, 34.
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Figura 1:. La cassetta del vettore shuttle donatori per la ricombinazione omologa, e la regione di destinazione nel genoma VV La purificazione gene marcatore RFP è guidata dal promotore H5. Il vettore di riparazione donatore mira i risultati regione N1L nel gene RFP viene incorporato nella regione N1L dopo ricombinazione omologa. 'X' indica la sequenza omologa nel vettore donatore di riparazione che andrà a sostituire la stessa sequenza sul genoma del virus vaccino. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Imaging del CV-1 le cellule un giorno dopo la ricombinazione omologa Un giorno afteR ricombinazione omologa, le cellule infettate con VV e trasfettate mediante riparazione vettore donatore sono RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Una targa RFP-positivo nel primo depurazione turno di virus mutante nella purificazione primo turno del virus mutante, la placca RFP-positivi (cerchiato con linea rossa) con la regione di destinazione eliminazione sono circondati da placche formate da virus selvaggio di tipo (cerchiato con linea gialla). A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X) B:. fluorescenza MICRimmagine oscopy (originale ingrandimento 100X). Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4:. Il mutante pura VV Dopo 3-5 giri di purificazione, placche puri sono stati ottenuti come tutte le targhe erano RFP-positivi. A: contrasto di fase immagine (originale ingrandimento 100X). B: immagini di microscopia a fluorescenza (originale ingrandimento 100X) . Barra di scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Verification della pura mutante VV. DNA è stato estratto da VV infettato CV-1 cellule. La delezione della regione bersaglio N1L è stata verificata mediante PCR utilizzando primer N1L, l'inserimento di RFP in regione N1L stata confermata mediante PCR utilizzando primer RFP. Lanes AF corrisponde a sei placche purificati, corsia G è una placca di controllo con l'eliminazione N1L verificato nel precedente lavoro 33, corsia Ctr (controllo) è il virus di tipo selvaggio vaccino (con la regione N1L intatto). A52R gene è stato amplificato come il gene di controllo per tutti i campioni. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Ci sono due obiettivi principali di modifica della VV a fini terapeutici. Uno è quello di eliminare un particolare gene, come il gene della timidina chinasi (TK) per attenuare virus per antitumorale uso terapeutico. L'altro è di armare VV con un gene desiderato terapeutico (come GM-CSF) o un gene marcatore (ad esempio gene luciferasi). Il raggiungimento di uno di questi comporta la soppressione di una regione bersaglio / gene. Un metodo di legatura del DNA diretto 35 e un metodo in vitro confezione 36 sono state usate in precedenza per generare virus vaccinia mutanti con modifiche gene TK. Tuttavia, questi metodi hanno limitato l'applicazione relativa mutazione altre regioni del genoma a causa della mancanza di siti di enzimi di restrizione unici in tutto il genoma. L'attuale approccio per la creazione di VV mutante comporta trasfezione di un vettore shuttle (donatore) con un indicatore di selezione (RFP o GFP) in CV-1 le cellule due ore dopo l'infezione con VV per indurre una incorporati ricombinazione omologang il marcatore di selezione nella regione di destinazione. Selezione di placche marcatori positivi è seguito da loro purificazione 24 h post-trasfezione. Il processo di purificazione placca può durare fino a 10 giri, ultime 3-4 settimane e spesso porta a virus ricombinanti indesiderate con marcatori di selezione inseriti nelle regioni fuori bersaglio. DNA rotture del doppio filamento possono indurre efficacemente ricombinazione omologa in cellule di mammifero 37, e sfruttando questo meccanismo, l'efficienza di generazione VV mutante possono essere notevolmente migliorate. Il sistema Cas9 gRNA-guidato è stato impiegato con successo in editing genoma e migliora l'efficienza di ricombinazione omologa in organismi eucarioti 22, 25. Recentemente, in cellule ospiti il genoma di adenovirus e tipo I virus dell'herpes simplex è stato curato dal Cas9 gRNA-guidata sistema 24. E 'stato recentemente dimostrato che il sistema CRISPR Cas9 è un potente strumento per la modifica in modo efficiente il genoma VV e la costruzione di un vettore VV per esprimere unparticolare gene.
Sia il metodo tradizionale ricombinazione omologa (HR) Cas9 N1L gRNA-guidato e portato a eventi HR di successo nello stesso sito di destinazione di N1L. È interessante notare, tuttavia gRNA guidato Cas9 HR indotta a livelli molto più elevati di efficienza rispetto al metodo tradizionale HR. Pertanto, l'uso di Cas9 gRNA guidata elimina la necessità di purificare altrettanti placche avere VVs mutanti. In questo lavoro, abbiamo migliorato significativamente l'efficienza e la lasso di tempo per la generazione di VV mutante utilizzando il sistema gRNA guidato Cas9 33. Da segnalare, un passo fondamentale per l'ottenimento di una elevata efficienza della ricombinazione omologa è trasfezione le cellule CV-1 con i plasmidi che esprimono Cas9 e la gRNA per 24 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa convenzionale. L'intervallo di 24 ore permette Cas9 e gRNA ad essere espressi ad un livello ragionevole. Inoltre, potrebbe essere necessario ottimizzare la sequenza gRNA mira un particolare gene, come abbiamo scoperto che il diverso gRNA sequenze targeting N1L gene variato nella loro efficienza 33, 34.
La limitazione per il CRISPR / Cas9 in editing VV è il basso tasso di placche RFP-positivo nel primo turno di ricombinazione. Per ottenere un numero sufficiente di placche RFP-positivi contenenti virus ricombinante, di solito almeno una decina sono necessari 6 pozzetti, che rende al primo round di screening noioso. Quindi, vi è ancora la necessità di ottimizzare il protocollo per superare questa limitazione.
La piccola dimensione delle placche RFP-positivo è un altro problema potenziale, che è causa di un elevato volume di lisato utilizzato per infettare una piastra da 6 pozzetti. Per ovviare a questo, un minor volume di lisato deve essere usato per infettare una piastra da 6 pozzetti per ottenere dimensioni più grandi placche RFP-positive. Utilizzando un minor volume di lisato consentirà anche una migliore separazione delle placche RFP-positivi da quelli RFP-negativo. Di conseguenza, un minor numero di giri di purificazione placca devono ottenere placche puri RFP-positivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
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