virus vaccinico (VV) è stato ampiamente utilizzato nella ricerca biomedica e il miglioramento della salute umana. Questo articolo descrive un metodo semplice e altamente efficiente per modificare il genoma VV utilizzando un sistema CRISPR-Cas9.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
virus vaccinico (VV) è un virus a DNA con involucro appartenente alla famiglia poxvirus e ha svolto un ruolo cruciale in uno dei più grandi successi nel campo della medicina della eradicazione del vaiolo. Nell'era post-eradicazione del vaiolo, VV è stato sviluppato come un vettore per la consegna di geni per i vaccini contro l'HIV e altre malattie infettive 1-7 con l'inserimento di geni provenienti da vari agenti patogeni in vettori VV. VV è anche stato ampiamente utilizzato come vettore per l'immunoterapia del cancro 8-14 particolare per lo sviluppo del virus vaccinia oncolytic tumore targeting replica. Al fine di creare un vettore di vaccino efficace con migliorata selettività per le cellule tumorali, sono necessarie modifiche all'interno del genoma virale, compresa gene delezioni o introduzione di geni terapeutici.
Con lo sviluppo della tecnologia del DNA e una migliore comprensione della biologia molecolare e virologia, inserimento di DNA estraneo in VV originariamente conseguired utilizzando la ricombinazione omologa (HR) nel 1980 15. Questo metodo è ancora ampiamente utilizzato per la costruzione di vettori VV. Introduzione della modificazione genetica si ottiene utilizzando un vettore shuttle HR, che ricombina con il genoma VV di cellule pre-infettate. Tuttavia, questo metodo ha dimostrato di essere altamente inefficiente (meno dell'1% dell'efficienza ricombinazione omologa 16) e si traduce spesso in inserzione casuale del marcatore di selezione in regioni e / o perdita del marcatore all'espansione virus non mirati.
L'efficienza del DNA ricombinazione omologa per l'inserimento del DNA esogeno in loci genomici può essere notevolmente migliorata in presenza di rotture del doppio filamento (DSB) 17. Pertanto, la tecnologia che può indurre a DSB loci bersaglio ha un grande potenziale per l'ingegneria del genoma di VV.
Il sistema CRISPR-Cas9 recentemente sviluppato mostra la promessa per l'attivazione DSB in qualsiasi regione del gene VV. CRISPR-Cas9 è un RNAnucleasi guidata coinvolti nella immunità adattativa contro fagi invasori e altri materiali genetici estranei 18-20. Ci sono tre sistemi CRISPR-Cas in una vasta gamma di specie microbiche 21. Il sistema CRISPR-Cas tipo II è ampiamente usato per modificare il genoma delle cellule eucariotiche e grandi virus. Si tratta del Cas9 endonucleasi RNA-guida (da Streptococcus pyogenes), una sola guida di RNA (sgRNA) e la trans-attivazione crRNA (tracrRNA) 22-24. Il complesso Cas9 / sgRNA riconosce l'complementare 20-nucleotide sequenza genomica che precede una sequenza 5'-NGG-3 'Protospacer motivo adiacente (PAM) in cellule di mammifero 22, 23. E' stato usato con successo per un efficace generazione di cellule geneticamente modificate, virus e modelli animali 22-32.
Il sistema CRISPR-Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento efficace per il targeting genoma in combinazione con ricombinazione omologa nel citoplasma della cellula infettata VV CV-1s per generare virus vaccinia mutanti 33, 34. Al fine di estendere il potenziale applicazione di questo metodo, vi presentiamo informazioni dettagliate sulla metodologia di questo sistema. Il protocollo descritto può essere usato per creare un VV mutante con un particolare gene delezione e / o un braccio il virus mutante con un transgene terapeutico.
Ci sono due obiettivi principali di modifica della VV a fini terapeutici. Uno è quello di eliminare un particolare gene, come il gene della timidina chinasi (TK) per attenuare virus per antitumorale uso terapeutico. L'altro è di armare VV con un gene desiderato terapeutico (come GM-CSF) o un gene marcatore (ad esempio gene luciferasi). Il raggiungimento di uno di questi comporta la soppressione di una regione bersaglio / gene. Un metodo di legatura del DNA diretto 35 e un metodo in vitro confezione 36 sono state usate in precedenza per generare virus vaccinia mutanti con modifiche gene TK. Tuttavia, questi metodi hanno limitato l'applicazione relativa mutazione altre regioni del genoma a causa della mancanza di siti di enzimi di restrizione unici in tutto il genoma. L'attuale approccio per la creazione di VV mutante comporta trasfezione di un vettore shuttle (donatore) con un indicatore di selezione (RFP o GFP) in CV-1 le cellule due ore dopo l'infezione con VV per indurre una incorporati ricombinazione omologang il marcatore di selezione nella regione di destinazione. Selezione di placche marcatori positivi è seguito da loro purificazione 24 h post-trasfezione. Il processo di purificazione placca può durare fino a 10 giri, ultime 3-4 settimane e spesso porta a virus ricombinanti indesiderate con marcatori di selezione inseriti nelle regioni fuori bersaglio. DNA rotture del doppio filamento possono indurre efficacemente ricombinazione omologa in cellule di mammifero 37, e sfruttando questo meccanismo, l'efficienza di generazione VV mutante possono essere notevolmente migliorate. Il sistema Cas9 gRNA-guidato è stato impiegato con successo in editing genoma e migliora l'efficienza di ricombinazione omologa in organismi eucarioti 22, 25. Recentemente, in cellule ospiti il genoma di adenovirus e tipo I virus dell'herpes simplex è stato curato dal Cas9 gRNA-guidata sistema 24. E 'stato recentemente dimostrato che il sistema CRISPR Cas9 è un potente strumento per la modifica in modo efficiente il genoma VV e la costruzione di un vettore VV per esprimere unparticolare gene.
Sia il metodo tradizionale ricombinazione omologa (HR) Cas9 N1L gRNA-guidato e portato a eventi HR di successo nello stesso sito di destinazione di N1L. È interessante notare, tuttavia gRNA guidato Cas9 HR indotta a livelli molto più elevati di efficienza rispetto al metodo tradizionale HR. Pertanto, l'uso di Cas9 gRNA guidata elimina la necessità di purificare altrettanti placche avere VVs mutanti. In questo lavoro, abbiamo migliorato significativamente l'efficienza e la lasso di tempo per la generazione di VV mutante utilizzando il sistema gRNA guidato Cas9 33. Da segnalare, un passo fondamentale per l'ottenimento di una elevata efficienza della ricombinazione omologa è trasfezione le cellule CV-1 con i plasmidi che esprimono Cas9 e la gRNA per 24 ore prima di eseguire la ricombinazione omologa convenzionale. L'intervallo di 24 ore permette Cas9 e gRNA ad essere espressi ad un livello ragionevole. Inoltre, potrebbe essere necessario ottimizzare la sequenza gRNA mira un particolare gene, come abbiamo scoperto che il diverso gRNA sequenze targeting N1L gene variato nella loro efficienza 33, 34.
La limitazione per il CRISPR / Cas9 in editing VV è il basso tasso di placche RFP-positivo nel primo turno di ricombinazione. Per ottenere un numero sufficiente di placche RFP-positivi contenenti virus ricombinante, di solito almeno una decina sono necessari 6 pozzetti, che rende al primo round di screening noioso. Quindi, vi è ancora la necessità di ottimizzare il protocollo per superare questa limitazione.
La piccola dimensione delle placche RFP-positivo è un altro problema potenziale, che è causa di un elevato volume di lisato utilizzato per infettare una piastra da 6 pozzetti. Per ovviare a questo, un minor volume di lisato deve essere usato per infettare una piastra da 6 pozzetti per ottenere dimensioni più grandi placche RFP-positive. Utilizzando un minor volume di lisato consentirà anche una migliore separazione delle placche RFP-positivi da quelli RFP-negativo. Di conseguenza, un minor numero di giri di purificazione placca devono ottenere placche puri RFP-positivo.
<pclass = "jove_content"> Off-bersaglio effetti sono sempre un problema indesiderato in editing gene. CRISPR-Cas9 ha mostrato effetti off-target. Tuttavia, con un'attenta progettazione di gRNA, fuori bersaglio effetti possono essere evitati quando si modifica la VV genomi 33, 34. Questo è il particolare vantaggio di utilizzare il sistema di Cas9 gRNA-guida per modificare il genoma di VV. Date le promesse di VV, utilizzando il sistema CRISPR / Cas9 accelererà lo sviluppo di VVs mutanti per la ricerca biomedica e nella medicina traslazionale. Inoltre, un simile sistema è inoltre accelerare scoperte in biologia cellulare, come dissezione delle vie di segnalazione utilizzati da VV per la sua motilità actina-based.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |