Vacciniavirus (VV) har vært mye brukt i biomedisinsk forskning og forbedring av menneskers helse. Denne artikkelen beskriver en enkel, svært effektiv metode for å redigere VV genomet ved hjelp av en CRISPR-Cas9 system.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
Vacciniavirus (VV) er en omhyllet DNA-virus som tilhører poxvirus familien og har spilt en avgjørende rolle i en av de største prestasjonene i medisin for utrydding av kopper. I post-utrydding æra av kopper, har VV blitt utviklet som en vektor for å levere gener for vaksiner mot HIV og andre smittsomme sykdommer 1-7 ved å sette inn gener fra ulike patogener i VV vektorer. VV har også blitt mye brukt som en vektor for cancer immunoterapi, spesielt 8-14 for utviklingen av tumormålrettet replikerende onkolytisk vacciniavirus. For å skape en effektiv vaksine vektor med forbedret selektivitet for kreftceller, blir modifikasjoner innenfor det virale genom som kreves, inkludert genet delesjoner eller innføring av terapeutiske gener.
Med utviklingen av DNA-teknologi, og en bedre forståelse av molekylær biologi og virologi, innsettingen av fremmed DNA inn i VV ble opprinnelig oppnåd hjelp homolog rekombinasjon (HR) i 1980 15. Denne metoden er fortsatt mye brukt for å konstruere VV vektorer. Innføring av den genetiske modifikasjon blir oppnådd ved hjelp av en pendelvektor for HR, som rekombinerer med VV genomet i pre-infiserte celler. Imidlertid har denne metode vist seg å være svært ineffektive (mindre enn 1% homolog rekombinasjon effektivitet 16) og resulterer ofte i tilfeldig innsetting av seleksjonsmarkøren inn i ikke-målrettede regioner og / eller tap av markøren på viruset ekspansjon.
Effektiviteten av DNA homolog rekombinasjon for innsetting av eksogent DNA i genomisk loci kan bli dramatisk forbedret i nærvær av dobbelttrådsbrudd (DSB) 17. Derfor er teknologi som kan indusere DSB sin på målet loci har et stort potensiale for genom prosjektering av VV.
Det nyutviklede CRISPR-Cas9 system viser løfte om å utløse DSB sin i noen VV genet regionen. CRISPR-Cas9 er en RNA-guidet nuklease involvert i adaptiv immunitet mot invaderende fager og andre utenlandske genetisk materiale 18-20. Det er tre CRISPR-Cas systemer i en rekke mikrobielle arter 21. Den type II CRISPR-Cas system er mye brukt for redigering av genomet av eukaryote celler og store virus. Det består av RNA-styrt Cas9 endonuklease (fra Streptococcus pyogenes), en enkelt hjelpe RNA (sgRNA) og trans-aktiverende crRNA (tracrRNA) 22-24. Den Cas9 / sgRNA kompleks gjenkjenner den komplementære 20-nukleotid-genomisk sekvens foregående en 5'-NGG-3 'Protospacer tilstøtende motiv (PAM) sekvens i pattedyrceller 22, 23. Det har vært brukt med hell for effektiv generering av genetisk modifiserte celler, virus og dyremodeller 22-32.
Den CRISPR-Cas9 system har vist seg å være et effektivt verktøy for genom målretting i kombinasjon med homolog rekombinasjon i cytoplasma av VV infiserte CV-1-celles å generere mutante vacciniavirus 33, 34. For å øke den potensielle anvendelsen av denne metoden, presenterer vi detaljert informasjon om dette system metodikk. Den beskrevne protokoll kan benyttes for å skape en mutant VV med et bestemt gen delesjon og / eller arm mutant-viruset med et terapeutisk transgen.
Det er to hovedmålene om lempning av VV for terapeutiske formål. Det ene er å slette en bestemt gen, slik som tymidinkinase (TK) genet for å svekke viruset for anti-tumor terapeutiske anvendelse. Den andre er å arm VV med en ønsket terapeutisk gen (slik som GM-CSF) eller et markør-gen (slik som luciferase-genet). Oppnå en av disse innebærer sletting av en målområdet / genet. En direkte DNA-ligeringsmetode 35 og en in vitro metode for innpakning 36 har tidligere blitt benyttet for å generere mutante vaccinia virus med tk-genet modifikasjoner. Imidlertid har disse fremgangsmåter begrenset anvendelse av mutasjon i andre regioner i genomet på grunn av mangel av unike restriksjonsenzymseter i hele genomet. Den nåværende tilnærming til å skape mutant VV innebærer transfeksjon av en shuttle (donor) vektor med en seleksjonsmarkør (RFP eller GFP) i CV-1 celler to timer etter infeksjon med VV å indusere en homolog rekombinasjon incorporating seleksjonsmarkøren inn i målområdet. Valg av markør-positive plakk blir etterfulgt av deres rensing 24 timer etter transfeksjon. Plaketten Renseprosessen kan ta opptil 10 runder, siste 3-4 uker, og ofte fører til uønskede rekombinante virus med seleksjonsmarkører satt inn i off-target regioner. DNA-dobbeltstrengbrudd effektivt kan indusere homolog rekombinasjon i pattedyrceller 37, og ved å utnytte denne mekanismen, kan effektiviteten av å generere mutant VV være vesentlig forbedret. Den gRNA styrt Cas9 systemet har blitt ansatt i genomet redigering og forbedrer effektiviteten av homolog rekombinasjon i eukaryote organismer 22, 25. Nylig i vertsceller genomene til adenovirus og type I herpes simplex virus ble redigert av gRNA styrt Cas9 system 24. Det har nylig blitt vist at CRISPR Cas9 system er et kraftig verktøy for effektivt å redigere VV genomet og konstruere en VV vektor for å uttrykke enbestemt gen.
Både N1L gRNA styrt Cas9 og den tradisjonelle homolog rekombinasjon (HR) metoden resulterte i vellykkede HR hendelser på samme målområde av N1L. Interessant, men gRNA styrt Cas9 indusert HR ved mye høyere nivåer av effektivitet enn den tradisjonelle metoden HR. Således, ved bruk av gRNA styrte Cas9 eliminerer behovet for å rense så mange plaques for å oppnå mutant VVS. I dette arbeidet har vi effektivisert og tidsramme for generering av mutant VV bruker gRNA styrt Cas9 system 33 betydelig. Av notatet, en kritisk steg for å oppnå en høy virkningsgrad homolog rekombinasjon er å transfektere CV-1 celler med plasmidene uttrykker Cas9 og gRNA for 24 timer før du utfører den konvensjonelle homolog rekombinasjon. Den 24-timers intervall gir Cas9 og gRNA til å bli uttrykt på et rimelig nivå. Videre kan gRNA sekvens målrettet mot et spesielt gen må være optimalisert som vi har funnet at de forskjellige gRNA sekvenser tålrettingsvalg N1L gen varieres i deres effektivitet 33, 34.
Begrensningen for CRISPR / Cas9 i redigering VV er den lave frekvensen av RFP-positive plakk i den første runden av rekombinasjon. For å oppnå et tilstrekkelig antall RFP-positiv plakk inneholdende rekombinant virus, som regel minst ti 6-brønns plater er nødvendig, noe som gjør første runde screening langtekkelig. Derfor er det fortsatt et behov for å optimalisere protokollen for å overvinne denne begrensningen.
Den lille størrelsen på RFP-positive plakk er et annet potensielt problem, noe som skyldes et høyt volum av lysat som brukes til å infisere en 6-brønns plate. For å overvinne dette, bør et mindre volum av lysat anvendes for å infisere en 6-brønns plate for å oppnå større format RFP-positive plaques. Ved hjelp av et mindre volum av lysat vil også gjøre det mulig for bedre separasjon av RFP-positive plakk fra RFP-negative. Følgelig færre runder med plakkrensing er nødvendig for å få rene RFP-positive plakk.
<pclass = "jove_content"> Off-target effekter er alltid en uønsket problem i genet redigering. CRISPR-Cas9 har vist off-target effekter. Men med forsiktig design av gRNA, off-target effekter kan unngås ved redigering av VV genomer 33, 34. Dette er særlig nytte av å bruke gRNA styrt Cas9 system for redigering av genomet til VV. Gitt løfter VV, ved hjelp av CRISPR / Cas9 systemet vil fremskynde utviklingen av mutant VVS for biomedisinsk forskning og i translasjonell medisin. I tillegg vil et slikt system også fremskynde funn i cellebiologi, som disseksjon av de signalveier som brukes ved VV for sin aktin-baserte motilitet.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |