vírus vaccinia (VV) tem sido amplamente utilizada na investigação biomédica e da melhoria da saúde humana. Este artigo descreve um método simples, altamente eficiente para editar o genoma VV utilizando um sistema CRISPR-Cas9.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
vírus vaccinia (VV) é um vírus DNA envelopado, pertencente à família poxvírus e tem desempenhado um papel crucial em uma das maiores conquistas da medicina da erradicação da varíola. Na era pós-erradicação da varíola, VV foi desenvolvido como um vetor para a entrega de genes para as vacinas contra o HIV e outras doenças infecciosas 1-7 através da inserção de genes de vários patógenos em vectores VV. VV também tem sido amplamente utilizado como um vector para a imunoterapia do cancro 8-14 especialmente para o desenvolvimento de vírus de vaccinia oncolítico replicar-alvo do tumor. A fim de criar um vector de vacina eficiente com uma selectividade melhorada para as células cancerígenas, são necessárias modificações dentro do genoma viral, incluindo deleções de genes ou introdução de genes terapêuticos.
Com o desenvolvimento da tecnologia de ADN e uma melhor compreensão da biologia molecular e virologia, a inserção de ADN estranho em VV foi originalmente atingird usando recombinação homóloga (HR) em 1980 15. Este método ainda é amplamente utilizado para a construção de vectores VV. Introdução da modificação genética, é conseguido através de um vector de transporte para a AR, que se recombina com o genoma de VV em células pré-infectados. No entanto, este método tem provado ser altamente ineficiente (inferior a 1% de eficiência de recombinação homóloga 16) e muitas vezes resulta na inserção aleatória do marcador de selecção em regiões e / ou perda do marcador sobre a expansão do vírus não-alvo.
A eficiência de ADN de recombinação homóloga para introduzir ADN exógeno em loci genómico pode ser dramaticamente aumentada na presença de quebras de cadeias duplas (DSB) 17. Portanto, a tecnologia que pode induzir LAP em loci alvo tem um grande potencial para a engenharia de genoma de VV.
O sistema CRISPR-Cas9 recentemente desenvolvido mostra a promessa para o desencadeamento de LAP em qualquer região do gene VV. CRISPR-Cas9 é uma RNA-nuclease guiada envolvidos na imunidade adaptativa contra invasores fagos e outros materiais genéticos estranhos 18-20. Existem três sistemas CRISPR-cas em uma variedade de espécies microbianas 21. O sistema CRISPR-cas tipo II é amplamente utilizado para a edição do genoma de células eucarióticas e vírus de grandes dimensões. Consiste na Cas9 endonuclease guiada por ARN (de Streptococcus pyogenes), um ARN de guia (sgRNA) e o crRNA trans-activação (tracrRNA) 22-24. O complexo Cas9 / sgRNA reconhece a sequência genómica de 20 nucleótidos complementares anterior uma sequência 5'-NGG-3 'Protospacer motivo adjacente (PAM) em células de mamífero 22, 23. Ela tem sido usada com sucesso para a geração eficaz de células, vírus geneticamente modificados e modelos animais 22-32.
O sistema CRISPR-Cas9 tem provado ser uma ferramenta eficiente para a segmentação genoma em combinação com recombinação homóloga no citoplasma de VV infectadas células CV-1s para gerar vírus vaccinia mutantes 33, 34. A fim de alargar o potencial de aplicação deste método, apresentamos informações detalhadas sobre metodologia deste sistema. O protocolo descrito pode ser usado para criar um mutante de VV com uma deleção do gene particular e / ou armar o vírus mutante com um transgene terapêutico.
Há dois objetivos principais relativamente à modificação da VV para fins terapêuticos. Uma consiste em eliminar um gene particular, tal como o gene da timidina quinase (TK) para atenuar o vírus para o anti-tumoral uso terapêutico. A outra é o braço VV com um gene terapêutico desejado (por exemplo, GM-CSF) ou um gene marcador (por exemplo, gene da luciferase). Atingir qualquer um destes envolve a eliminação de uma região alvo / gene. Um método de ligação directa de ADN 35 e um método de empacotamento in vitro 36 Foram utilizados anteriormente para gerar vírus vaccinia mutantes com alterações do gene TK. No entanto, estes métodos têm aplicação limitada em relação a mutação de outras regiões do genoma, devido à falta de locais de enzimas de restrição exclusivos, em todo o genoma. A actual abordagem para a criação de VV mutante envolve a transfecção de um vector de transporte (dador) com um marcador de selecção (RFP ou GFP) em células CV-1 de duas horas após a infecção com VV para induzir uma incorpor recombinação homólogang do marcador de selecção para a região alvo. Colecção de placas de marcadores positivos é seguida por sua h pós-transfecção de purificação 24. O processo de purificação de placa pode levar até 10 rodadas, últimas 3-4 semanas e, muitas vezes leva a vírus recombinantes com marcadores de selecção indesejáveis inseridas em regiões fora do alvo. ADN quebras de cadeia dupla pode efectivamente induzir a recombinação homóloga em células de mamíferos 37, e do aproveitamento deste mecanismo, a eficiência de geração de VV mutante pode ser bastante melhorada. O sistema Cas9 gRNA-guiada tem sido empregada com sucesso na edição do genoma e aumenta a eficiência de recombinação homóloga em organismos eucarióticos 22, 25. Recentemente, em células hospedeiras os genomas de adenovírus e tipo I vírus herpes simplex foram editadas pelo Cas9 gRNA-guiada sistema de 24. Foi demonstrado recentemente que o sistema CRISPR Cas9 é uma ferramenta poderosa para a edição de forma eficiente no genoma VV e construção de um vector para a expressão de um VVgene particular.
Ambos N1L gRNA-guiada ao método tradicional recombinação homóloga (HR) Cas9 e resultou em eventos bem sucedidas de RH no mesmo local alvo de N1L. É interessante notar, no entanto gRNA-guiado Cas9 AR induzida em níveis muito mais elevados de eficiência do que o método tradicional de RH. Assim, a utilização de Cas9 gRNA-guiado elimina a necessidade de purificar o maior número de placas para obter mutantes VV. Neste trabalho, nós melhorou significativamente a eficiência e prazo para geração de VV mutante usando o sistema Cas9 gRNA-guiada 33. De nota, um passo crítico para a obtenção de uma elevada eficiência da recombinação homóloga é para transfectar células CV-1 com os plasmídeos que expressam Cas9 e o gRNA durante 24 h antes de realizar a recombinação homóloga convencional. O intervalo de 24 h permite Cas9 e gRNA a ser expressa em um nível razoável. Além disso, a sequência de direccionamento gRNA de um determinado gene pode ter de ser optimizada, uma vez que descobrimos que os diferentes sequências t gRNAgene argeting N1L variar na sua eficácia 33, 34.
A limitação para a CRISPR / Cas9 na edição VV é a baixa taxa de placas RFP positivo na primeira rodada de recombinação. Para se obter um número suficiente de placas RFP-positivo contendo vírus recombinante, geralmente, pelo menos, dez placas de 6 poços são necessárias, o que torna primeira ronda de rastreio tedioso. Assim, ainda existe uma necessidade para optimizar o protocolo de ultrapassar esta limitação.
O pequeno tamanho de placas RFP-positivo é um outro problema potencial, o que é devido a um elevado volume de lisado utilizado para infectar uma placa de 6 poços. Para superar isto, um menor volume de lisado deve ser utilizado para infectar uma placa de 6 poços para se obter placas de tamanho maior RFP-positiva. Usando um pequeno volume de lisado permitirá também para uma melhor separação das placas RFP-positivo de os RFP-negativo. Consequentemente menos rondas de purificação de placas são necessários para obter placas RFP-positivos puros.
<pclass = "jove_content"> Off-alvo efeitos são sempre um problema indesejado na edição gene. CRISPR-Cas9 tem mostrado efeitos fora do alvo. No entanto, com design cuidadoso de gRNA, longe do alvo efeitos podem ser evitados durante a edição do VV genomas 33, 34. Este é o benefício particular de usar o sistema Cas9 gRNA-guiada para editar o genoma de VV. Dadas as promessas de VV, usando o sistema CRISPR / Cas9 irá acelerar o desenvolvimento de VV mutantes para a investigação biomédica e em medicina translacional. Além disso, um sistema deste tipo também iria acelerar descobertas em biologia celular, tais como a dissecção das vias de sinalização utilizadas por VV para a sua motilidade à base de actina.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |