Summary
Вирус коровьей оспы (VV) широко используется в медико-биологических исследований и улучшения здоровья человека. В данной статье описывается простой, очень эффективный метод для редактирования В.В. генома с использованием системы CRISPR-cas9.
Introduction
Вирус коровьей оспы (VV) представляет собой оболочечный ДНК-вирус, принадлежащий к семейству поксвирусной и играет решающую роль в одном из самых больших достижений в медицине ликвидации оспы. В после ликвидации оспы, В.В. был разработан в качестве вектора для доставки генов для вакцин против ВИЧ и других инфекционных заболеваний , 1-7, вставляя гены от различных патогенов в векторы VV. В.В. также широко используют в качестве вектора для иммунотерапии рака 8-14 особенно для развития онколитической вируса коровьей оспы с опухолью целевой репликации. Для того, чтобы создать эффективную вакцинного вектора с улучшенной селективностью в отношении раковых клеток, модификации в пределах вирусного генома необходимы, в том числе генов, делеции или введение терапевтических генов.
С развитием технологии ДНК и лучшего понимания молекулярной биологии и вирусологии, вставки чужеродной ДНК в ВВ был первоначально достиженияd с использованием гомологичной рекомбинации (HR) в 1980 - е годы 15. Этот метод до сих пор широко используется для построения векторов VV. Введение генетической модификации достигается за счет использования шатл-вектор для HR, который рекомбинирует с В.В. геном в предварительно инфицированных клетках. Тем не менее, этот метод оказался весьма неэффективным (менее 1% эффективности гомологичной рекомбинации 16) , и часто приводит к случайной вставки маркера селекции в нецелевых областей и / или потери маркера при расширении вируса.
Эффективность ДНК гомологичной рекомбинации для вставки экзогенной ДНК в геномных локусов может быть значительно повышена в присутствии двунитевых разрывов (DSBs) 17. Таким образом, технология, которая может вызвать DSBs на мишени локусов имеет большой потенциал для генной инженерии ВВ.
Недавно разработанная система CRISPR-cas9 показывает посыл для запуска DSBs в любой области гена В.В.. CRISPR-cas9 является РНК-руководствуясь нуклеазы участвует в адаптивного иммунитета против вторгшихся фагов и других зарубежных генетических материалов 18-20. Есть три CRISPR-Cas системы в диапазоне видов микроорганизмов 21. Система CRISPR-Cas типа II широко используется для редактирования генома эукариотических клеток и крупных вирусов. Он состоит из РНК - наведением cas9 эндонуклеазы (из Streptococcus Пирролидонилпептидаза), один направляющий РНК (sgRNA) и транс-активирующих crRNA (tracrRNA) 22-24. Комплекс cas9 / sgRNA распознает комплементарную 20-нуклеотидную последовательность геномной предшествующую последовательность 5'-NGG-3 'Protospacer смежный мотив (ПАМ) в клетках млекопитающих 22, 23. Она была успешно использована для эффективной генерации генетически модифицированных клеток, вирусов и животные модели 22-32.
Система CRISPR-cas9 оказалась эффективным инструментом для генома таргетирования в сочетании с гомологичной рекомбинации в цитоплазме инфицированных VV CV-1 клеткиs для создания мутантных вирусов осповакцины 33, 34. Для того чтобы расширить потенциальное применение этого метода, мы приводим подробную информацию о методологии этой системы. Описанный протокол может быть использован для создания мутанта VV с определенным делеции гена и / или руку мутантный вирус с терапевтическим трансгенов.
Protocol
1. Получение РНК-мишени и cas9 конструктов и Ремонт донора Вектор
- Клонирование gRNAs
- Разработка целевой последовательности РНК-гид , нацеленную на ген n1l вируса коровьей оспы следующий из принципа , изложенного выше 25. Совместите направляющую-РНК последовательности-мишени против генома вируса коровьей оспы (в данном случае, Листера штамм вируса коровьей оспы), чтобы исключить любые вне цели целевых gRNA последовательности.
- Обобщить и клонировать gRNA олигонуклеотиды в клонирующий вектор gRNA , как описано выше 25. Подтвердите последовательность каждого gRNA в полученном векторе Сангером секвенирования 33. Назовите полученный gRNA построить , как gRNA N2 33.
Примечание: Целевой сайт gRNA находится в пределах гена n1l, и находится в области между левой рукой и правой рукой , что вектор покрывает ремонт донорские (рисунок 1).
- Клонировать ген cas9 отсутствует сигнал ядерной локализации (NLS) в полеpST1374 вектора и обозначают конструкцию как ПСТ-cas9 33.
Примечание: Любой вектор экспрессии клонировании млекопитающих может быть использован для построения вектора экспрессии cas9. - Построение вектора ремонта донора для HR
- Используйте ген n1l ВВ в качестве целевой области для модификации 33. Убедитесь в том, что длины левых и правых руках около 500-600 пар оснований каждая, и фланговые целевой регион.
Примечание: Левая рука / правая рука может иметь до 50 пар оснований с перекрытием целевой области (рисунок 1). - Клонирование область ремонта вектор донора n1l , как описано выше 33, 34 и обозначить вектор доноров ремонт как PT-n1l.
Примечание: На рисунке 1 вектор ремонта донора и его целевого региона. Другие регионы VV могут быть направлены с использованием области (ген) -специфический gRNA (ы) и ремонт доноров вектор конкретных регионов. Любой клонирующий вектор может быть использован для построения вектора ремонта донора. </ Ол>
- Используйте ген n1l ВВ в качестве целевой области для модификации 33. Убедитесь в том, что длины левых и правых руках около 500-600 пар оснований каждая, и фланговые целевой регион.
- Расширение плазмиды
- Преобразование плазмиды в химически компетентную E. палочки в соответствии с инструкциями изготовителя. Очищают плазмиду с использованием набора для экстракции плазмидной со ссылкой на протокол от изготовителя.
2. Посев клеток (день 1)
- Поддержание CV-1 клетки (почки обезьян фибробласты) в Дульбекко модифицированной среде Игла (DMEM), дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, при 37 ° С с 5% CO 2.
- Клетки Trypsinize CV-1, которые на 80-90% сплошности
- Удалить среду для культивирования клеток, отобранных из Т-175 колбы, содержащие клетки CV-1. Промыть монослой с 5 мл стерильной PBS для удаления остаточного сыворотки и отсасывает PBS. Добавить 2,5 мл раствора 1 × трипсин-ЭДТА, чтобы покрыть клетки и колбу помещают на 37 ° C инкубаторе в течение примерно 5 минут, чтобы помочь открепления клеток.
- Добавить10 мл клеточной культуральной среды (см шаг 2.1), чтобы приостановить клетки путем осторожного действия пипетки. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Посев клеток в 6-луночные планшеты
- Семенной 2 × 10 5 CV-1 клеток в 2 мл среды для культивирования клеток в каждую лунку 6-луночного планшета за день до трансфекции.
Примечание: Дополнительный этап центрифугирования для удаления трипсин не требуется.
- Семенной 2 × 10 5 CV-1 клеток в 2 мл среды для культивирования клеток в каждую лунку 6-луночного планшета за день до трансфекции.
3. Трансфекция cas9 плазмиды и gRNA плазмиды (2-й день)
- Клетки трансфекцию CV-1 (полученного на стадии 2.2.3.1) с 0,5 мкг ПСТ-cas9 плазмиды и 0,5 мкг gRNA N2 плазмиды с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Инкубируйте клетки в течение 24 ч в инкубаторе (37 ° С с 5% СО 2), а затем заменить среду с 2 мл свежей среды для культивирования клеток (описано в шаге 2.1).
4. Заражение CV-1 клеток и Shuttle доноров VЭктор Трансфекция для HR (3-й день)
- Развести магистральную VVL15 вирус с DMEM среде для культивирования клеток в концентрации 2 × 10 5 БОЕ / мл. 24 ч после трансфекции cas9 и gRNA плазмид, добавьте 100 мкл разбавленного вируса в каждую лунку трансфицированных клеток CV-1.
- 2 ч после вирусной инфекции, трансфекции 1,0 мкг вектора доноров трансфер в VVL15-инфицированных клеток для HR с использованием реагента для трансфекции в соответствии с инструкциями изготовителя. Поместите трансфектированных клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч.
5. Сбор урожая Рекомбинантный Вирус (4-й день)
- Через 24 ч после трансфекции с вектором донорского шатл для HR в шаге 4.2, отсоединить трансфектированных клеток CV-1 с помощью мобильного скребок. Сбор суспензии клеток в криопробирку и хранить при температуре -80 ° C для дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вытрите среда для культивирования клеток разлитую жидкость с дезинфицирующим средством немедленно, а затем еще раз протрите 70% Этанол.
6. Очистка Modified В.В. (I тур)
- На 1 -й день, 15 семян 6-луночные планшеты с 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку.
- На 2-й день, оттаивают замороженную клеточной суспензии, полученной на стадии 5.1, в водяной бане при температуре 37 ° С в течение 3 мин и вихревого криопробирки энергично в течение 30 с для получения клеточного лизата без удаления остатков клеток.
- Для заражения одного 6-луночный планшет из CV-1 клеток, разбавленные 1 мкл лизата клеток с 3 мл DMEM и добавляют 0,5 мл разведенной клеточного лизата в каждую лунку 6-луночного планшета, на верхней части медиа уже настоящее время. Зараженные 6-луночные планшеты, приготовленным на стадии 6.1.
Примечание: Удаление остатков клеток не требуется. - После двух дней после заражения (т.е. на 4 -й день), определить RFP-положительных бляшек под флуоресцентным микроскопом с использованием 10X объектива и маркировать бляшки под пластиной с помощью маркера перо, обведя расположение зубного налета.
ПРИМЕЧАНИЕ: См- Подготовьте шесть меченых криопробирки, содержащие 200 мкл бессывороточной DMEM среда для культивирования клеток, чтобы подобрать шесть различных RFP-положительных бляшек. Аспирируйте среда для культивирования клеток из скважины с меченым бляшки (ы) (шаг 6.3). Прикрепите наконечник 200 мкл на P200 пипетки, установите громкость на 30 мкл и принять ~ 10 мкл среды для культивирования клеток из одного криопробирку.
- Удерживайте кнопку пипетка толчок, не отпуская среды и использовать наконечник, чтобы почесать область одной меченой бляшки. Отпустите кнопку пипетка толчок, чтобы поднять отдельные клетки и передать его в криопробирку, содержащую 190 мкл бессывороточной DMEM.
- Возьмите еще 10 мкл среды из флакона с поцарапанных клетками (от последнего шага) и повторите процедуру собирания тот же RFP-положительных зубного налета три раза, чтобы собрать как можно больше клеток с царапинами, как это возможно. Перенос всех клеток в тот же флакон и хранить флакон при температуре -80 ° С.
7. Очистка Modified В.В. (II тур)
- Семенной 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку шесть 6-луночные планшеты и культуры клеток в течение 24 часов.
- Разморозить замороженные криопробирки (со стадии 6.3.3) в 37 ° С на водяной бане в течение 3 мин, а затем вихрь криопробирки энергично в течение 30 секунд, чтобы получить клеточный лизат.
- Добавить 0,5 мкл смешанного клеточного лизата в одну лунку 6-луночного планшета. Infect один 6-луночный планшет для каждой доски. Инкубируйте VV-инфицированных 6-луночные планшеты при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 2 -х дней (второй очистки круглый налет). Затем повторите раздел 6.3.
Примечание: Более шести RFP-положительных бляшек может быть подобран; два или более 6-луночные планшеты могут быть использованы для очистки каждого зубного налета.
- Добавить 0,5 мкл смешанного клеточного лизата в одну лунку 6-луночного планшета. Infect один 6-луночный планшет для каждой доски. Инкубируйте VV-инфицированных 6-луночные планшеты при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 2 -х дней (второй очистки круглый налет). Затем повторите раздел 6.3.
8. Дальнейшие раунды игрока Налет Пурификации
- Продолжайте еще от трех до пяти раундов очистки следуя тем же протоколом, описанных в пункте 7, пока все бляшки, образованные из одной положительной бляшки, как представляется, ЗП-положительным под микроскопом.
Примечание: Эта табличка затем считается чистой. - После того , как зубной налет является чистой (рис 4, все инфицированные клетки , экспрессирующие RFP), урожай положительный налет в криопробирку и хранить при температуре -80 ° С , как описано в разделе 6.3. Проверьте зубной налет в соответствии с протоколом, описанным в шаге 9 и 10.
9. Разверните Очищенная Налет (ы)
- Семенной 3 × 10 5 CV-1 клеток в каждую лунку 6-луночного планшета за один день до заражения вирусом.
- Разморозить замороженный криопробирку с 8,2 в водяной бане C 37 ° в течение 3 мин для получения клеточного лизата. Добавьте все лизат (без удаления остатков клеток) в одну лунку 6-луночного планшета клеток CV-1 (высевают на шаге 9.1). Инкубируйте инфицированных CV-1 клеток при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 3 дней.
- Развернуть все очищенные бляшками (по крайней мере, три бляшки).
Примечание: Время инфекция варьируется от 1-3 дней в зависимости от количества вируса в лизате.
- Развернуть все очищенные бляшками (по крайней мере, три бляшки).
- Урожай VV-инфицированных клеток с помощью клеточного скребка, когда более 50% клеток показывают цитопатический эффект наблюдаемый под микроскопом (клетки округляются, легко отсоединяется и RFP положительный). Собрать обособленные клетки вместе с клеточной культуральной среды в пробирку 15 мл.
- Гранул клетки центрифугированием при 300 г в течение 3 мин. Удалить супернатант и держать осадок клеток при -80 ° С до дальнейшего использования или сразу же использовать клеточный осадок на стадии 10.
10. Проверка модификации Mutant В.В. при помощи ПЦР
- Извлечение ДНК В.В из клеточного осадка, полученного на стадии 9.3.1 с использованием набора для экстракции ДНК в соответствии с протоколом производителя. Элюции ДНК с 200 мкл дважды дистиллированной воды.
Примечание: Используйте половину объема гранул, чтобы извлечь ДНК и сохранить остальные для вирусного производства, если клон проверяется как содержащий правильной модификации / вставки. - Проверка удаления гена n1l и вставки гена RFP в n1l области.
- Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающий ген n1l (L025) и L026 гена с использованием праймеров, сконструированных против гена n1l. Amplify ген RFP с использованием праймеров RFP-специфических. Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающую контроль A52R методом ПЦР с использованием A52R специфических праймеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: См Перечень материалов для специфических праймеров.- Выполните ПЦР с использованием набора мастер-микс ПЦР. Установка 25 мкл ПЦР-реакции с использованием 2 мкл ДНК-матрицы, денатурации реакции ПЦР при 94 ° С в течение 2 мин, а затем запустить 30 циклов ПЦР, выполнив следующие действия: денатурации ДНК при 94 ° С в течение 15 секунд, затем отжигают праймеры к ДНК-матриц, при 52 ° C в течение 15 с продлить ПЦР-реакции при 72 ° с в течение 30 сек.
- Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающий ген n1l (L025) и L026 гена с использованием праймеров, сконструированных против гена n1l. Amplify ген RFP с использованием праймеров RFP-специфических. Амплифицировать фрагмент ДНК, охватывающую контроль A52R методом ПЦР с использованием A52R специфических праймеров.
- Устранить ПЦР - продуктов с использованием гель 1% -ном агарозном 33. Захват изображения геля с использованием УФ-гель док. Если n1l ПЦР отрицательный и A52R и RFP ДЗП положительны, то налет правильно изменено в n1l области.
Representative Results
Для строительства нового вектора VV, ключевой отправной точкой является проектирование и строительство челночный вектор донор, который может предназначаться для конкретного региона генома. В этом исследовании, ген В.В. n1l был использован в качестве примера цели. Кассета челночного вектора донора для рекомбинации и целевой области в VV показаны на рисунке 1. Для повышения эффективности гомологичной рекомбинации, плазмиды , экспрессирующие cas9 и n1l-специфическую gRNA котрансфицируют в CV -1 клетки 48 ч до проведения гомологичной рекомбинации 33. Однажды (24 ч) после трансфекции, была выражена RFP в клетках CV-1 (рисунок 2). После заражения CV-1 клеток со всей лизата из гомологичной рекомбинации (этап 5), ЗП-положительные и отрицательные бляшки и наблюдали в клетках CV-1 (рисунок 3). После протокола очистки, описанный, чистый со бляшка ÜLD быть получен после того, как 3-5 раундов очистки. Как показано на рисунке 4, все бляшки после инфицирования клеточного лизата , полученного из чистого бляшки с мутантным вирусом осповакцины представил сигнал RFP. Для того, чтобы проверить , является ли чистый мутант В.В. имел правильную модификацию гена, использовали ПЦР , чтобы подтвердить отсутствие гена - мишени n1l, как показано на рисунке 5. ПЦР - модифицированного вируса показали положительный сигнал для ЗП и отсутствующий сигнал для n1l ( на рисунке 5 полоса AG), в то время как результаты ПЦР n1l для контрольного вируса (КТР) с интактным n1l области положительна. Фрагменты ДНК управления A52R были положительными для всех рекомбинантных вирусов и вируса Ctr. Эффективность HR в RFP-положительных бляшек составляет 100% (6/6) в этом эксперименте (это было до 94% в предыдущей работе 34). Описанный в настоящем документе способ улучшило эффективность рекомбинации более чем в 100 раз по сравнению с обычными протоколами 33, 34.
Содержание "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 ">
Рисунок 1:. Кассета из челночного вектора донора для гомологичной рекомбинации, а целевая область в геноме В.В. Очистку маркерный ген RFP управляется промотором H5. Вектор ремонта донор ориентированных на результаты региона n1l в гене RFP включаются в n1l области после гомологичной рекомбинации. 'X' указывает на гомологичную последовательность в векторе донора ремонта , который заменит ту же последовательность на геном вируса осповакцины. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: Визуализация CV-1 клеток через один день после гомологичной рекомбинации Однажды Afteг гомологичной рекомбинации, клетки , инфицированные VV и трансфицированные вектором донора ремонта являются RFP-положительным A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: ПНП-позитивных бляшек в первом раунде очистки мутантного вируса В первом раунде очистки мутантного вируса, ЗП-положительные бляшки (обведено красной линией) с удалением целевой области окружены бляшек , образованных вирус дикого типа (обведено желтой линией) A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: флуоресценция микрoscopy изображение (исходное увеличение 100X). Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 4: Чистый мутант В.В. Через 3-5 раундов очистки, чистые бляшки были получены , как и все бляшки были RFP-положительными A:. Фазовый контраст изображения (исходное увеличение 100X . ) B: люминесцентной микроскопии изображение (исходное увеличение 100X) , Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Verificatioп чистого мутант VV. ДНК экстрагировали из VV инфицированных CV-1 клеток. Удаление целевой области n1l была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров n1l, введение ЗП в n1l области была подтверждена с помощью ПЦР с использованием праймеров, RFP. Дорожки AF соответствуют шесть очищенных бляшек, полоса G является контрольным табличка с n1l удаление подтверждено в предыдущей работе 33, полоса Ctr (контроль) является диким типом вируса коровьей оспы (с n1l области нетронутыми). A52R ген амплифицировали в качестве контрольного гена для всех образцов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Есть две основные цели, касающиеся модификации VV в терапевтических целях. Одним из них является, чтобы удалить конкретный ген, такой как ген тимидинкиназы (ТК) для ослабления вируса для противоопухолевого терапевтического применения. Другой вооружить VV с желаемого терапевтического гена (например, GM-CSF) или маркерный ген (например, ген люциферазы). Достижение любого из них включает в себя удаление целевого региона / гена. Способ лигирования прямой ДНК 35 и в пробирке методом 36 упаковки использовались ранее для создания мутантных вирусов осповакцины с изменениями гена TK. Тем не менее, эти способы имеют ограниченное применение в отношении мутации других областей в геноме из-за отсутствия уникальных сайтов рестрикции по всему геному. В настоящее время подход к созданию мутантный В.В. включает трансфекцию челнока (донор) вектора с маркером селекции (RFP или GFP) в CV-1 клеток через два часа после заражения VV для индукции гомологичной рекомбинации incorporatiнг на маркер селекции в целевом регионе. Выбор маркера положительных бляшек следуют их очистки 24 ч после трансфекции. Процесс очистки зубного налета может занять до 10 раундов, последние 3-4 недели и часто приводит к нежелательным рекомбинантных вирусов с маркерами селекции, вставленных в офф-целевых регионах. ДНК двухцепочечной разрывы могут эффективно индуцировать гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих 37, а также путем использования этого механизма, эффективность генерации мутантного VV может быть значительно улучшена. GRNA наведением система cas9 успешно применяется при редактировании генома и повышает эффективность гомологичной рекомбинации в эукариотических организмах 22, 25. В последнее время в клетках - хозяевах геномы аденовируса и типа I вируса простого герпеса , отредактированные с помощью gRNA-управляемой cas9 система 24. Недавно было показано, что система CRISPR cas9 является мощным инструментом для эффективного редактирования VV генома и конструирования вектора В. В. для выраженияконкретный ген.
Оба n1l gRNA наведением cas9 и метод традиционной гомологичной рекомбинации (HR) привело к успешных HR-событий на одном целевом сайте n1l. Интересно, однако gRNA наведением cas9 индуцированный HR на более высоких уровнях эффективности, чем традиционный метод управления персоналом. Таким образом, использование gRNA-управляемой cas9 устраняет необходимость очистить как можно больше бляшек для получения мутантных VVS. В этой работе, мы значительно повысили эффективность и временные рамки для генерации мутантного VV с использованием gRNA-управляемой системы cas9 33. Следует отметить, что один важный шаг для достижения высокой эффективности гомологичной рекомбинации для трансфекции клеток CV-1 с помощью плазмид, экспрессирующих cas9 и gRNA в течение 24 ч перед выполнением обычной гомологичной рекомбинации. Интервал 24 ч позволяет cas9 и gRNA быть выражены на приемлемом уровне. Кроме того, последовательность gRNA ориентации конкретного гена может должны быть оптимизированы, как мы обнаружили, что различные gRNA последовательности тГен argeting n1l варьировалась в их эффективности 33, 34.
Ограничение для CRISPR / cas9 при редактировании VV является низкая скорость RFP-положительных бляшек в первом раунде рекомбинации. Для того, чтобы получить достаточное количество RFP-положительных бляшек, содержащих рекомбинантный вирус, как правило, по меньшей мере, десять 6-луночные планшеты необходимы, что делает первый круглый скрининг утомительным. Следовательно, по-прежнему существует потребность в оптимизации протокола, чтобы преодолеть это ограничение.
Небольшой размер RFP-положительных бляшек является еще одной потенциальной проблемой, что связано с большим объемом лизата, используемого для заражения 6-луночного планшета с. Чтобы преодолеть эту проблему, меньший объем лизата должен быть использован для заражения 6-луночный планшет для получения больший размер RFP-положительные бл шки. Используя меньший объем лизата также позволит для лучшего разделения RFP-положительных бляшек из ППК-отрицательных. Следовательно, меньшее количество раундов очистки бляшек необходимы для получения чистых RFP-положительных бляшек.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
| pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
| pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
| Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
| fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
| penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
| Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
| Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
| fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
| Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
| 10 cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
| 6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
| cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
| 1x Trypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
| Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
| Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
| N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
| N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
| A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
| A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
| RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
| Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
| G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |
References
- Baroudy, B. M., Venkatesan, S., Moss, B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. Cell. 28, 315-324 (1982).
- Madigan, M. T., Martinko, J. M., Parker, J., Brock, T. D. Brock biology of microorganisms, 9th edn. , Prentice Hall. Upper Saddle River, NJ. (2000).
- Cooney, E. L., et al. Safety of and immunological response to a recombinant vaccinia virus vaccine expressing HIV envelope glycoprotein. Lancet. 337, 567-572 (1991).
- Mackett, M., Yilma, T., Rose, J. K., Moss, B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. Science. 227, 433-435 (1985).
- Legrand, F. A., et al. Induction of potent humoral and cell-mediated immune responses by attenuated vaccinia virus vectors with deleted serpin genes. J Virol. 78, 2770-2779 (2004).
- Panicali, D., Davis, S. W., Weinberg, R. L., Paoletti, E. Construction of live vaccines by using genetically engineered poxviruses: biological activity of recombinant vaccinia virus expressing influenza virus hemagglutinin. Proc Natl Acad Sci. 80, 5364-5368 (1983).
- Wiktor, T. J., et al. Protection from rabies by a vaccinia virus recombinant containing the rabies virus glycoprotein gene. Proc Natl Acad Sci. 81, 7194-7198 (1984).
- Gallucci, S., Matzinger, P. Danger signals: SOS to the immune system. Curr Opin Immunol. 13, 114-119 (2001).
- Matzinger, P. The danger model: a renewed sense of self. Science. 296, 301-305 (2002).
- Guo, Z. S., Bartlett, D. L. Vaccinia as a vector for gene delivery. Expert Opin Biol Ther. 4, 901-917 (2004).
- Kwak, H., Horig, H., Kaufman, H. L. Poxviruses as vectors for cancer immunotherapy. Curr Opin Drug Discov Devel. 6, 161-168 (2003).
- Tysome, J. R., et al. Lister strain of vaccinia virus armed with endostatin-angiostatin fusion gene as a novel therapeutic agent for human pancreatic cancer. Gene Ther. 16, 1223-1233 (2009).
- Kirn, D. H., Wang, Y., Liang, W., Contag, C. H., Thorne, S. H. Enhancing poxvirus oncolytic effects through increased spread and immune evasion. Cancer Res. 68, 2071-2075 (2008).
- Park, B. H., et al. Use of a targeted oncolytic poxvirus, JX-594, in patients with refractory primary or metastatic liver cancer: a phase I trial. Lancet Oncol. 9, 533-542 (2008).
- Panicali, D., Paoletti, E. Construction of poxviruses as cloning vectors: insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex virus into the DNA of infectious vaccinia virus. Proc Natl Acad Sci. 79, 4927-4931 (1982).
- Ball, L. A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA. J Virol. 61, 1788-1795 (1987).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Mol Cell Biol. 14, 8096-8106 (1994).
- Jansen, R., Embden, J. D., Gaastra, W., Schouls, L. M. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol Microbiol. 43, 1565-1575 (2002).
- Brouns, S. J., et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
- van der Oost, J., Jore, M. M., Westra, E. R., Lundgren, M., Brouns, S. J. CRISPR-based adaptive and heritable immunity in prokaryotes. Trends Biochem Sci. 34, 401-407 (2009).
- Jinek, M., et al. Structures of Cas9 endonucleases reveal RNA-mediated conformational activation. Science. 343, 1247997 (2014).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Bi, Y., et al. High-efficiency targeted editing of large viral genomes by RNA-guided nucleases. PLoS Pathog. 10, 1004090 (2014).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Yang, L., et al. Optimization of scarless human stem cell genome editing. Nucleic Acids Res. 41, 9049-9061 (2013).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31, 827-832 (2013).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154, 1380-1389 (2013).
- Niu, Y., et al. Generation of gene-modified cynomolgus monkey via Cas9/RNA-mediated gene targeting in one-cell embryos. Cell. 156, 836-843 (2014).
- Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat Biotechnol. 32, 551-553 (2014).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153, 910-918 (2013).
- Ma, Y., et al. Generating rats with conditional alleles using CRISPR/Cas9. Cell Res. 24, 122-125 (2014).
- Yuan, M., et al. Efficiently editing the vaccinia virus genome by using the CRISPR-Cas9 system. J Virol. 89, 5176-5179 (2015).
- Yuan, M., et al. A marker-free system for highly efficient construction of vaccinia virus vectors using CRISPR Cas9. Mol Ther Methods Clin Dev. 2, 15035 (2015).
- Merchlinsky, M., Moss, B. Introduction of foreign DNA into the vaccinia virus genome by in vitro ligation: recombination-independent selectable cloning vectors. Virology. 190, 522-526 (1992).
- Timiryasova, T. M., Chen, B., Fodor, N., Fodor, I. Construction of recombinant vaccinia viruses using PUV-inactivated virus as a helper. Biotechniques. 31, 534-540 (2001).
- Johnson, R. D., Jasin, M. Double-strand-break-induced homologous recombination in mammalian cells. Biochem Soc Trans. 29, 196-201 (2001).
