Abstract
Фундаментальный вопрос в клеточной биологии, как клеточные и органелл размеры регулируются. Давно признано, что размер ядра в целом шкалы с размером ячейки, в частности, в процессе эмбриогенеза, когда происходят резкое сокращение в обеих клеточных и ядерных размеров. Механизмы регулирования размеров ядра в значительной степени неизвестны и могут иметь отношение к раку , где измененная размер ядра является ключевым диагностическим и прогностическим параметром. В естественных условиях подходы к идентификации регуляторов размера ядра осложняется существенным и сложным характером ядерной функции. В пробирке подход , описанный здесь , чтобы изучить контроль размеров ядра использует в своих нормальных сокращений ядерного размера , которые происходят во время развития Xenopus Laevis. Во- первых, ядра собраны в X. Laevis экстракт яйца. Затем эти ядра выделяют и ресуспендировали в цитоплазме от поздних эмбрионов стадии. После 30 - 90 мин инкубационного периода, площадь поверхности ядернаяуменьшается на 20 - 60%, обеспечивая полезный анализ для выявления цитоплазматических компонентов, присутствующих в поздних эмбрионов стадии, которые способствуют развития масштабированием размеров ядра. Основным преимуществом такого подхода является относительная легкость, с которой яйцо и эмбрион экстракты могут быть биохимически манипулировать, что позволяет для идентификации новых белков и деятельности, которые регулируют размер ядра. Как и при любом экстракорпоральное подходе, проверка достоверности результатов в системе в естественных условиях имеет важное значение, и микроинъекции X. Laevis эмбрионов особенно подходит для этих исследований.
Introduction
Размеры клеточных органелл обычно масштабироваться с размером ячейки, и это было возможно , лучше всего документирован для масштабирования размера ядра с размером ячейки 1-10. Это особенно верно в процессе эмбриогенеза и дифференцировки клеток, когда резкое сокращение как клетки и размера ядра часто наблюдаются 11,12. Кроме того, изменен размер ядра является ключевым параметром в диагностике рака и прогнозирования 13-17. Механизмы, которые способствуют регулированию размеров ядра в значительной степени неизвестны, отчасти из-за сложности и существенного характера ядерной структуры и функции. Описанный здесь метод был разработан как тест в пробирке для масштабирования размера ядра , который поддается биохимическому манипуляции и выяснению механизмов регулирования размеров ядра.
Xenopus Laevis яйцо экстракт является хорошо налаженная система резюмировать и изучать сложные клеточные процессы в в пробирке 18-22. Одним из ключевых преимуществ для системы является то , что экстракт X. Laevis яичные экстракты представляют собой почти неразбавленный цитоплазму, состав которого может быть легко изменен, например , путем добавления рекомбинантных белков или immunodepletion. Кроме того, он способен манипулировать основные процессы, используя методы лечения , которые в противном случае могут привести к летальному исходу в естественных условиях в контексте. Модификации процедуры экстракта яйца позволяют для выделения экстрактов из X. Laevis эмбрионов , а не яйца, и эти эмбриональные экстракты одинаково поддаются биохимическому манипуляции 23. Во время X. Laevis развития, одноклеточный оплодотворенной эмбрион (диаметром ~ 1 мм) проходит серию из двенадцати быстрых клеточных делений (этапы 1 - 8) для создания нескольких тысяч 50 μдиаметр м и более мелкие клетки, достигая стадии развития называют переход midblastula (MBT) или стадии 8 24-26. MBT характеризуется наступлением зиготического транскрипции, миграции клеток, асинхронных клеточных делений, приобретение фаз пробелов и создания ядерных стационарных размеров, а не постоянного расширения ядерной отрасли, как в эмбрионе предварительно MBT. От 4 -й стадии до гаструляции (стадии 10.5 - 12), объем отдельных ядер уменьшается более чем в 10 раз 11.
Здесь цель состоит в том, чтобы идентифицировать механизмы, ответственные за эти сокращения размеров ядра в процессе эволюционного развития. Подход должен сначала собрать ядра в X. Laevis экстракт яйца и изолировать эти ядра от цитоплазмы яйца / экстракта. Эти ядра затем ресуспендировали в цитоплазме с поздней гаструлы эмбрионов стадии. После инкубационного периода, ядра из экстракта яйца становятся меньше в конце экстракта стадии эмбриона. Мы рассуждали, что это would быть полезным тест для выявления цитоплазматических компонентов, присутствующих в поздних эмбрионов стадии, которые способствуют развития масштабированием размеров ядра. С помощью этого анализа, в сочетании с проверкой в естественных условиях, мы показали , что протеинкиназа С (ПКС) способствует сокращению развития в области ядерного размера в X. Laevis 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры Xenopus и исследования были проведены в соответствии с Руководством по СРН по уходу и использованию лабораторных животных 8 - е издание. Протоколы были одобрены в Университете Вайоминга институциональной уходу и использованию животных комитета (Обеспечение # A-3216-01).
1. Получение X. Экстракт Laevis Яйцо (адаптировано из 27,28)
- Премьер женский X. Laevis лягушки как минимум трех дней и максимум за две недели до сбора яиц с одним 100 МЕ инъекции беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG).
- За один день до эксперимента, впрыснуть грунтованные лягушки с 800 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) и место при 16 ° С в 1 л на лягушкой 1 / 3x модифицированных звонарей Марка, (MMR). Приведены в таблице 1 для всех буферных композиций.
Примечание: Некоторые лягушки не откладывают яйца или заложит плохие яйца качества. Как правило, 2 - 3 лягушки вводят, чтобы обеспечить по крайней мере один лягушка будет лежать sufficienт количество хороших яиц качества. Средняя лягушка будет лежать достаточно яиц, чтобы произвести по крайней мере, 1 мл экстракта яйца. - Готовят 1 л 1 / 3x КМС с холодной дистиллированной деионизированной водой (DDH 2 O), 500 мл буфера В, 1 л буфера С, 500 мл буфера D, и 100 мл буфера Е.
- Передача откладывали яйца в стеклянный кристаллизатор (150 х 75 мм). С помощью пластмассовой Пастера пипетку с наконечником отрезан, откуп белые пухлые активированного яйца или лизированных яйца. Только сохранить яйца с разными и равными полюсами темные животных и белых растительными полюсов.
- Приготовьте 13 х 51 мм центрифужные пробирки с 1 мл буфера Е с добавлением 355 мкМ цитохалазином D добавляют непосредственно перед использованием на стадии 1.7.
- Dejelly и мыть яйца.
- Мыть яйца на короткое время с холодным 1 / 3x MMR в стакане соответствующего размера, заменой буфера 3 - 4 раза.
- Удалить желе пальто из яиц путем инкубации с буфером B. Это займет от 3 - 10 мин. По мере того как облачное желе пальто высвобождаются из яйцас, изменение буфера.
Примечание: Dejellying завершена, когда яйца появляются плотно упакованы в углу блюдо при наклоне и вегетативные полюса ориентированы вниз. Яйца намного более хрупкими после dejellying, так что не инкубировать яйца с буфером B дольше, чем необходимо, и последующие промывки должны быть выполнены очень тщательно. - Вымойте яйца на короткое время с 3 - 4 заменами буфера С
- Вымойте яйца на короткое время с 2 заменами буфера D.
- Вымойте яйца на короткое время с 2-заменами буфера E.
- Заполните центрифужные пробирки с яйцами, используя широкий отверстие стеклянной пипетки или пластиковой капельницы. Аспирируйте от избыточного буфера. Для того, чтобы упаковать яйца и удалить как можно больше буфера, как это возможно, в центрифуге качающейся роторе при 212 мкг в течение 60 секунд, а затем при 478 мкг в течение 30 сек. Аспирируйте от избыточного буфера.
Примечание: Важно, чтобы удалить как можно больше избыточный буфер, как это возможно на данном этапе, чтобы обеспечить экстракт яйца минимально размыта. - В качается роторе, ультрацентрифуга под вакуумом в течение 15 мин при 12000 х г и 4 ° C, чтобы раздавить яйца открытыми и разделить на разные слои, с цитоплазма быть янтарного цвета слой в середине. Удалить центрифужные пробирки и место непосредственно на льду.
- Сбор экстракта.
- Используя иглу 18 калибра и шприц, проколоть центрифужную пробирку прямо над темной пигментированной слоя в нижней части трубы и снимите среднюю янтарного цвета цитоплазматический слой. Не собирать любой из верхнего липидного слоя. Соберите цитоплазму в соответствующего размера трубки.
Примечание: Как правило, 1 лягушка производит по меньшей мере, 1 мл экстракта. - Дополнение цитоплазма с 1/1000 объем 19,7 мМ цитохалазином D, 1/1000 г. объем LPC запаса, и 1/50 объем 50х из энергобаланса. Аккуратно переверните пробирку перемешать. Не чрезмерно пипеткой экстракта.
- Держите экстракт на льду и использовать его в течение 3 часов подготовки для достижения наилучших результатов.
- Используя иглу 18 калибра и шприц, проколоть центрифужную пробирку прямо над темной пигментированной слоя в нижней части трубы и снимите среднюю янтарного цвета цитоплазматический слой. Не собирать любой из верхнего липидного слоя. Соберите цитоплазму в соответствующего размера трубки.
Примечание: Объемы процедуры, представленные здесь до 8 семенников.
- Удалить 0,05% бензокаин (10% бензокаин запас, полученный в этаноле и разбавили до 0,05% в воде резервуара лягушки) от 4 ° С и нагревали до комнатной температуры. Обезболить и принести в жертву мужской X. Laevis лягушек в бензокаин растворе при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин. Обеспечить смерть отсутствием сердцебиения путем изучения и чувствует область грудной клетки, из-за отсутствия ответа на механическое раздражение, и / или путем декапитации.
- Сделайте U-образный разрез вдоль живота с. Удалите tubulated массу желтых жировых тел. В верхней части почек, найти семенники, которые овальной формы бледно - розовые массы около 1 см в длину 29. Акцизный семенники и раскатывают их на промокательную бумагу, чтобы удалить кровь и другие ткани.
- Вымойте семенники в буфере T. Используйте плотно оборудованная пестик, чтобы пропустить через мясорубку семенники с 1 мл буфераТ в 1,5 мл трубки до гомогенного состояния (10 ударов или более). Центрифуга 5 - 10 сек в мини-центрифуге и собирают супернатант, удаление больших кусков ткани. Повторите центрифугирование еще раз и собирают супернатант.
- Передача спермы раствора на пластмассовой трубке 15 мл. Увеличение объема в общей сложности до 2 мл с буфером Т. центрифуге при 1411 мкг в течение 10 мин при 16 ° С для осаждения спермы.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок в 500 мкл буферного раствора Т. центрифуге при 1411 х г в течение 10 мин при 16 ° С. Повторите этот шаг несколько раз, сколько необходимо для очистки осадок соматических и красных кровяных телец.
- Ресуспендируют осадок в 100 мкл буфера для Т и 300 мкл буфера для S. инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
Примечание: Буфер S содержит лизолецитин, который отвечает за demembranation. - Добавьте три тома буфера R (получен свежий перед использованием). Переверните трубку ровно один раз. Центрифуга при 1411 мкг в течение 15 мин при 16 &# 176; C.
- Ресуспендируют осадок в 400 мкл буфера R, а затем добавьте еще 2 мл буфера Р. центрифуге при 1411 мкг в течение 15 мин при 16 ° С.
- Ресуспендируют осадок в 50 мкл буфера для T.
- Развести 1 мкл demembranated ядер сперматозоидов с 9 мкл буфера T. Примените этот разведение к гемоцитометра. Подсчитайте количество тонких ядер спермиев S-образную форму в одном большом 4 х 4 сетки, и умножить это число на 100, чтобы получить концентрацию запаса в ядрах сперматозоидов на мкл.
- Развести запас до 100000 ядер сперматозоидов на мкл с помощью буфера T, в результате чего в 200x складе. Подготовьте 3 - 5 мкл аликвоты. Флэш-замораживание в жидком азоте и хранят при -80 ° С.
3. Ядерная Ассамблея
- Дополнение 100 мкл экстракта яиц с 1,5 мкл 35,5 мМ циклогексимид (конечная концентрация ~ 0,5 мМ), 6 мкл 20x маточного раствора кальция (конечная концентрация ~ 0,6 мм) и 0,7 мкл 200x спермы (конечная концентрация ~ 700сперматозоиды ядер / мкл). Шкала реакционного объема вверх или вниз по мере необходимости. Инверсия или слегка нажмите, чтобы перемешать.
Примечание: Извлечение из метафазы циклическое в интерфазе обеспечивает более эффективную и надежную платформу для сборки ядра. - Инкубировать в водяной бане при температуре 16 - 20 ° С в течение 90 мин. Смешать, осторожно коснувшись через каждые 15 минут, чтобы обеспечить ядра остаются взвешенными в экстракте.
- Контролировать ход сборки ядра на 45 мин путем подготовки сквош следующим образом.
- Пипеткой 2 мкл экстракта на предметное стекло и добавляют 2 мкл ядра исправить.
- Перекрытие с 22 мм 2 покровное. Изображение на эпифлуоресцентной микроскопом с использованием воды, масла или воздуха 20 - цели 100X и DAPI фильтр.
Примечание: Ядра можно визуализировать с помощью обработки изображений светлого поля, но намного легче визуализировать с помощью флуоресценции. - Используйте ядра сразу или флэш-замораживания аликвот в жидком азоте и хранят при -80 ° С.
Примечание: Добавление 4% глицерина к ядрам прIOR к замораживанию может помочь сохранить их целостность. Замороженные ядра, как правило, по-прежнему жизнеспособны и способны ядерного импорта, однако процесс замораживания может привести к разрушенными или более структурно неустойчивых ядер. Ядра до года после замораживания может быть использован.
4. Подготовка X. Экстракт Эмбрион Laevis
- Побудить женский X. Laevis лягушки откладывают яйца , как описано в 1.1 и 1.2.
- Изолировать семенники от мужского X. Laevis лягушки , как описано в разделе 2.2. Погрузитесь семенники в L15 среде с добавлением 50 МЕ / мл пенициллина и стрептомицина в стакане 35 х 10 мм чашки Петри. Хранить при температуре 4 ° С в течение до двух недель.
- Сбор и оплодотворяют яйца.
- Собрать свежие яйца, удерживая лягушки над стеклянной многоразовой Петри и способствуют яйценоскость, применяя мягкое давление на нижнюю часть спины возле клоаки. Выдавливание лягушки слишком трудно может привести к травмам, что приводит к раздутым живота и REQuiring эвтаназию 29.
- Поддерживают блюдо под углом около 45 °, позволяют яйца собирать на краю тарелки, удалите все излишки буфера, и добавить достаточно 1 / 3x MMR едва покрыть яйца. Оплодотворите яйца в течение 15 минут после сбора.
- Используйте плотно подогнана пестик вымочить и гомогенизируют на 1/4 семенника в 1,5 мл пробирку с 500 мкл высоким содержанием соли модифицированных Saline Барта (МБС с высоким содержанием соли). Добавить мацерированного семенники к яйцам и позволяют оплодотворению происходить при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин, а затем заливать яйца с 1/3-кратным MMR.
Примечание: Эффективность семенников уменьшается со временем хранения, поэтому более семенники ткани может потребоваться для успешного оплодотворения при использовании семенники, которые были сохранены в течение более одной недели. - Confirm оплодотворение путем проверки сжатия темных пигментных животных полюса и за счет вращения эмбрионов с их животных полюсами вверх, обычно около 20 - 30 мин после добавления дробленого Тестs. Ожидать первое расщепление клеток происходит в течение 90 мин.
- Используя широкий отверстие стеклянной пипетки тщательно удалить мертвые (белый и опухшие или неравномерное распределение желтка и пигмента), лизируют или неоплодотворенные яйца (то есть, не расщепляется), так как они будут быстро вызывать гибель в соседних эмбрионов.
- Где-нибудь от 1 - 2,5 ч после оплодотворения, dejelly эмбрионов в 2 - 3% цистеина, растворенного в 1/3 х MMR и доводили до рН 7,9 с помощью 10 N КОН. Выполните два изменения буфера, каждая из которых 3 - 4 мин. Тщательно мыть эмбрионов с 6 - 10 кратких изменений 1 / 3x MMR, чтобы удалить все следы цистеина.
Примечание: Dejellied эмбрионы имеют желточной оболочки и не такой хрупкий, как dejellied яйца.
- Используя широкий отверстие стеклянной пипетки переносят здоровые оплодотворенные (т.е. расщепляется) эмбрионов на чашку Петри , содержащую свежий 1 / 3x MMR и дать им развиться до желаемой стадии при комнатной температуре или, если более медленное развитие предпочтительнее, 16 ° C. Продолжить для удаления мертвых или LySED эмбрионов указывает отсутствие первого деления или белого появления пухлой.
- Проверка стадии эмбрионов путем проверки почти полного закрытия бластопора и путем сравнения с рисунками постановочных эмбрионов , доступных в справочных материалах 24.
Примечание: Эмбрионы культивировали при 16 ° C достигнет 11,5 Stage - 12 приблизительно 12 часов. - Выдержите Стадии 11,5 - 12 эмбрионов в свежем 1 / 3x MMR, дополненной 0,5 мМ циклогексемида в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы задерживать эмбрионов в конце интерфазы.
- Передача с широким отверстием стекла или пластиковой пипетки на сумму не менее 15 (предпочтительно 30 или более) межфазных арестован эмбрионов в микроцентрифужных трубки.
Примечание: 15 эмбрионов достаточны для получения примерно 20 мкл экстракта. Масштабирование по мере необходимости. - Добавляют 1 мл яичного буфер для лизиса (ELB) с добавлением 1 мкл LPC запаса. Аккуратно инвертировать промывать эмбрионы, позволяют эмбрионы падать на дно трубки, и удалите буфер. Повторите этот шаг для стирки еще два раза. </ Li>
- Ресуспендируют эмбрионов в 500 мкл УДР плюс 0,5 мкл LPC запаса по 5 мкл 19,7 мМ циклогексемида и 5 мкл 35,5 мМ цитохалазином D (ингибировать полимеризацию актина). Центрифуга при 200 х г в течение 1 мин в настольном микроцентрифуге.
- Удалите излишки буфера и использовать пестиком тщательно раздавить эмбрионов. Центрифуга в качающемся роторе в течение 10 мин при 10000 х г и 16 ° С.
- Прокол липидный слой от вершины с 200 мкл пипетки наконечник. С чистым 200 мкл пипетки наконечник, удалите средний цитоплазматический янтарного цвета слой соответствующего размера трубки.
- Эмбрион экстракт Дополнение с 1/50 объем 50х энергобалансе (чтобы обеспечить АТФ систему регенерации), 1/100 объем 35,5 мМ cyclohexamide, 1/500 объема 19,7 мМ цитохалазином D и 1/1000 г. объем LPC запас.
- Подготовьте сквош, как описано в разделе 3.3 для визуализации эндогенные эмбриональные ядер в экстракте.
Примечание: экстракт эмбрионов может быть заморожен с эндогенные ядер в этой точке. Алиготе, чтобы уменьшить замораживания / оттаивания циклов и хранят при -80 ° С. - Для удаления ядер из экстракта эмбрионов, разбавьте экстракта с равным объемом УДР, содержащей 1/50 от объема 50x различных видов энергии, 1/100 объем 35,5 мМ cyclohexamide, 1/500 объем 19,7 мМ цитохалазином D, и 1/1000 объем LPC запаса. Центрифуга в качающемся роторе при 17000 х г в течение 15 мин при 16 ° С.
- Соберите супернатант быть осторожным, чтобы избежать каких-либо оставшихся липидов в верхней части. Не беспокоить осажденные ядра в нижней части трубы. Приготовьте тыкву, как описано в разделе 3.3, чтобы гарантировать, что большинство ядер были удалены. Используйте экстракт свежих или аликвоты и хранят при -80 ° С.
- Для того, чтобы нагревать инактивированную экстракт зародышей для контрольных экспериментов, термостабилизаторы 30 - 100 мкл аликвоты экстракта при температуре 56 ° С в течение 30 мин с использованием амплификатор. Разрешить инактивированной нагреванием экстракт нагреться до комнатной температуры перед использованием.
- Изолировать ядра, собранные в экстракте яиц путем разбавления 25 - 150 мкл предварительно собранных ядер в 1 мл УДР в 1,5 мл пробирку. Центрифуга при 1600 х г в течение 3 мин при 4 ° С в настольном микроцентрифуге. Удалить буфер, соблюдая осторожность, чтобы не нарушить хрупкий осадок ядер в нижней части трубы.
- Ресуспендируют ядер в объеме экстракта зародыша, равным исходному объему экстракта яиц, используемого в 5.1. Использование ELB или инактивированной нагреванием экстракт для контрольных реакций, в зависимости от обстоятельств.
- Слегка постучите трубку, чтобы разбить осадок и ресуспендируют ядра. Инкубируют при комнатной температуре в течение 90 мин, осторожно взбалтывая пробирку, чтобы смешать каждые 15 - 30 мин. Примечание: Большая часть ядерной усадки происходит в течение первых 30 мин.
- Контролировать ход ядерной усадки путем подготовки сквош.
- Пипеткой 2 мкл экстракта на предметное стекло и добавляют 2 мкл ядра исправить.
- Накладка с 22 мм 2
- Нажмите на трубку для ресуспендирования ядер непосредственно перед добавлением 500 мкл закрепителя, состоящей из УДР, 15% глицерина и 2,6% параформальдегида. Обратить немедленно, и поместите трубку на ротатор в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Приготовьте спином вниз труб путем оснащения 15 мл с круглым дном стеклянные трубки с круглым дном пластиковыми вставками (конструкции и схемы поставляются по заказу). Добавляют 5 мл буфера ядерной подушки. Оставьте 12 мм круговой покровное в трубку, будучи уверенным, что он лежит плоско на верхней части пластиковой вставкой.
- Нежно слой раствора, содержащего неподвижными ядрами на верхней части ядерной подушки с использованием широким отверстием пипетки наконечник. Центрифуга в качающемся роторе в течение 15 мин при 1000 об XG и 16 ° С.
- С помощью аспиратора, чтобы удалить все буфера и потянуть пластиковую вставку к верхней части трубы. Удалить покровное с парой тонких щипцов, стараясь отметить стороне крышкипроскользнуть на котором ядра были свернуты. После исправления в холодном метаноле (хранили при -20 ° С) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Передача на сторону покровного ядро вверх на лист пластиковой парафиновой пленки, выстилающей большой пластиковый чашку Петри. Поместите влажные одноразовые салфетки вдоль стороны тарелки, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Увлажняет ядер на покровное с 500 мкл PBS-NP40 (1х PBS плюс 0,1% NP40) и аспирата через 5 - 10 сек.
- Тщательно слой 75 мкл PBS-3% бычьего сывороточного альбумина (БСА) на покровное. Разрешить блокировать 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° C.
- Удалить блокирующий раствор и инкубировать с первичным антителом (например, mAb414 против порового комплекса ядерного, 1: 1000) , разведенного в PBS-3% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С. Промывают пять непосредственных изменений PBS-NP40.
- Инкубируйте с вторичными антителами, разведенного в PBS-3% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре. Промывают пять непосредственных изменений PBS-NP40.
- высиживать10 мкг / мл Hoechst разводили в PBS-3% BSA в течение 5 мин при комнатной температуре. Вымойте пять раз PBS-NP40. Удалите все излишки буфера.
- Установите покровное на слайд с 5 мкл antifade монтажной среды. Уплотнение с прозрачным лаком для ногтей. Изображение сразу же с помощью эпифлуоресцентной микроскопа с 20 - 100x целей или хранить при температуре 4 ° С для последующего визуализации.
Примечание: Выполнение количественной оценки , как описано выше 23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сборка ядер в экстракте Egg
Первые шаги этого протокола подготовить X. яйцо экстракт Laevis (Протокол 1) и demembranated ядра спермы (Протокол 2). Эти реагенты затем используются для сборки ядра De Novo (протокол 3). На рисунке 1 показаны некоторые репрезентативные данные. Добавление кальция приводит в действие мейотически арестованное экстракт яйца в интерфазе и циклогексимид держит экстракт арестованного в интерфазе. К 30 - 45 мин после начала реакции, изначально тонкие ядра спермы S-образную форму должны начать сгущаться в улиток в форме хроматина масс. Успешное формирование интактной ядерной оболочки может быть оценена с помощью импорта и удержания флуоресцентно меченого импортных грузов, таких, как GST-GFP-NLS (данные не показаны), или с помощью ободка окрашивания для порового комплекса ядерного использованием mAb414, признающей FG-повтора содерNing нуклеопоринами (Рис . 1А) После того, как происходит ядерная сборка, ядерная форма должна стать более округлыми и ядерный объем должен увеличиваться по мере ядерная оболочка расширяется и ядерные белки импортируются (рис 1B-C). Несоблюдение образования интактного ядерной оболочки или ядерного роста указывает на плохое качество экстракта яиц. В этом случае, лучше всего, чтобы начать снова с новой партии яиц.
Удаление эндогенного ядер из экстракта эмбрионов
Следующим шагом является подготовка поздней стадии эмбриона экстракт (Протокол 4). После первоначального приготовления экстракта и до удаления ядер, то лучше всего подготовить Hoechst-окрашенного сквош небольшого аликвоте экстракта. Визуализация многих малых эмбриональных ядер является хорошим показателем успеха в подготовке экстракта (рис 2А). Как эндогенные эмбриональные ядра могут мешать потоку analysiс, также важно, чтобы проверить аликвоты экстракта после удаления ядра путем разбавления и центрифугирования. По сравнению с первым кабачков, очень мало ядер следует оставить в экстракте (Фигура 2В). Если есть еще много ядер, присутствующих, требуется второй раунд центрифугирования.
Ядерный Shrinking Анализ
На рисунке 3 показаны репрезентативные результаты для ядерного сокращающейся анализа (протокол 5). Ядра экстракт Egg ресуспендировали в конце экстракта стадии эмбриона становится меньше с течением времени (рис 3B). Хороший отрицательный контроль для анализа является инкубирование ядра с экстрактом эмбриона , который был инактивированной нагреванием (рис 3А). Поскольку ядра не сжиматься в инактивированной нагреванием экстракта, это дает некоторую уверенность, что наблюдается ядерная суживаемы необработанным экстрактом эмбриона не является следствием осмотических эффектов. Степень ядерного размерасокращений, наблюдаемых варьируется в зависимости от конкретной партии ядер экстракта яичного, а также качество экстракта эмбрионов. По нашему опыту, ядерная усадка всегда наблюдается (например, в более чем 40 различных экстрактов эмбрионов), однако важно , чтобы повторить эти эксперименты несколько раз с различными ядрами и экстракты для устранения естественной изменчивости анализа. Рисунок 4 показывает схематическое всего протокола.
Рисунок 1. Ядерная Время сборки курс в X. Laevis Яичный экстракт. Ядра были собраны заново в X. Laevis экстракт яичного , как описано в Протоколе 3. Аликвоты той же реакции фиксировали и визуализировали с помощью иммунофлуоресценции с использованием антитела против ядерных пор комплекса (НЭК) (mAb414) по адресу:
Рисунок 2. Удаление ядер из X. Laevis экстракт эмбриона. X. Эмбрион экстракт Laevis был получен из стадии 11,5 - 12 эмбрионов , как описано в Протоколе 4. Небольшую аликвоту экстракта фиксировали и окрашивали Hoechst: а) перед удалением ядер и б) после удаления ядер центрифугированием. Шкалы составляет 25 мкм.ом / файлов / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Представитель данных от Shrinking анализе ядерной. Ядра были собраны заново в X. Экстракт Laevis яйцо с добавлением рекомбинантного GFP-LB3 (для визуализации ядерной пластинки). Как описано в Протоколе 5, зародыши экстракт яичные выделяли и ресуспендировали в стадии 11,5 - 12 эмбрионов экстракта, из которого были удалены эндогенные эмбриональные ядер. Живая съемка в заданный промежуток времени проводили на 30-секундными интервалами в течение 90 мин. Рисунок панели показывают изображения , полученные через 6 - минутными интервалами для ядер , инкубированных в: А) поздняя стадия эмбриона экстракт (LEE), и В) инактивированной нагреванием (HI) зародышевого экстракта. Изображения от времени курсов продолжитьслева направо. Шкалы составляет 25 мкм. C) Ядерные усадке данные из 46 различных яиц и эмбрионов экстрактов. Бары показывают средства для ядер> 240. Усы являются стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схема ядерной Shrinking анализа. Каждый цветной прямоугольник представляет один протокол. Красный цвет указывает на получение X. Laevis яичный экстракт (Протокол 1). Синий цвет обозначает получение demembranated X. Laevis спермы (Протокол 2). Розовый указывает De Novo ядерную сборку в экстракте яиц (протокол 3). Зеленый цвет указывает на получение X. Эмбрион экстракт Laevis (Протокол 4). Фиолетовый указывает на ядерные Shrinking протокол анализа и иммунофлюоресценции (протокол 5). Отдельные части этого рисунка были повторно использованы с 23. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| имя буфера | состав буфера |
| Marc модифицированная Рингерс (MMR), 1 / 3x | 33 мМ NaCl, 0,7 мМ KCl, 0,3 мМ MgSO 4, 0,7 мМ CaCl 2, 1,7 мМ HEPES, рН 7,4 |
| Извлечение буфера (XB), 10x | 1 М KCl, 1 мМ CaCl 2, 10 мМ MgCl 2, 500 мМ сахарозы, 100 мМ HEPES, рН 7,8 (рН с помощью 10 N КОН, хранили при 4 ° С) |
| Буфер B | 4% цистеин растворяют в 0.8x XB (полученного с холодным DDH 2 O, рН аdjusted до 7,8 с помощью 10 N NaOH) |
| Буфер C | Смешайте 100 м 10х XB с 900 мл холодной DDH 2 O |
| Буфер D | Буфер C плюс 5 мМ EGTA и 800 мкМ MgCl 2 |
| LPC запас, 1,000x | 10 мг / мл каждого из лейпептина, пепстатина и химостатина, растворенное в ДМСО (хранили в аликвотах при -20 & deg; C) |
| Буфер E | 100 мл буфера D плюс 100 мкл LPC складе |
| Энергетическая смесь, 50x | 190 мМ креатинфосфат динатрия, 25 мМ АТФ динатриевой соли, 25 мМ хлорид магния |
| Буфер T | 15 мМ PIPES, 15 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 7 мМ MgCl 2, 80 мМ КСl, 0,2 М сахарозы, рН 7,4 (фильтр стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С) |
| Буфер S | 20 мМ мальтозы и 0,05% лизолецитин готовили в буфере T |
| Буфер R | Буфер T плюс 3% крупного рогатого скотасывороточный альбумин |
| Кальций раствор, 20x | 10 мМ CaCl 2, 0,1 М KCl, 1 мМ MgCl 2 (хранили при -20 & deg ; C) |
| Nucleus исправление | 125 мкл 2 М сахарозы, 12,5 мкл 1 М HEPES , рН 7,9, 250 мкл 37% формальдегида, 112 мкл DDH 2 O, 0,5 мкл 10 мг / мл Hoechst (хранить при комнатной температуре в течение до двух недель) |
| Измененный Барта физиологический раствор (МБС), 10x | 880 мМ NaCl, 10 мМ КСl, 50 мМ HEPES, 25 мМ NaHCO 3, рН 7,8 |
| С высоким содержанием соли MBS | 1x МБС плюс 0,7 мМ CaCl 2 и 20 мМ NaCl |
| Яйцо буфера для лизиса, ELB | 250 мМ сахарозы, 50 мМ КСl, 2,5 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES, рН 7,8 |
| Буфер Ядерный подушка | 1x ХВ, 0,2 М сахарозы, 25% глицерина (стерилизуют и хранят при температуре 4 ° С) |
Таблица 1. Буферы. Составы всех буферов , указанных в данном протоколе описаны в этой таблице.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG - Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
