فحص خلية مجاني عن طريق<em> القيطم المورق</em> الأجنة مقتطفات لدراسة آليات الحجم رقابة النووية
Summary
Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Abstract
والسؤال الأساسي في بيولوجيا الخلية هو كيف يتم تنظيم أحجام الخلية وعضية. منذ فترة طويلة كان من المسلم به أن حجم النواة جداول عموما مع حجم الخلية، لا سيما خلال مرحلة التطور الجنيني عندما تحدث تخفيضات كبيرة في كل خلية والأحجام النووية. آليات تنظيم حجم النووي غير معروفة إلى حد كبير ويمكن أن تكون ذات صلة السرطان حيث حجم النووي غيرت معلمة التشخيص والنذير الرئيسية. المجراة النهج لتحديد المنظمين حجم النووية تعقيدا بسبب الطبيعة الأساسية والمعقدة من وظيفة النووية. النهج المتبع في المختبر الموصوفة هنا لدراسة مراقبة حجم النووية يستفيد من التخفيضات طبيعية في حجم النووي التي تحدث أثناء تطور المورق القيطم. أولا، يتم تجميع نوى في اكس. المورق استخراج البيض. ثم، يتم عزل هذه النوى ومعلق في السيتوبلازم من الأجنة مرحلة متأخرة. بعد 30 – فترة الحضانة 90 دقيقة، مساحة النووييقلل من 20-60٪، وتوفير الفحص المفيد تحديد مكونات هيولية الموجودة في الأجنة المرحلة المتأخرة التي تساهم في تنموي حجم النووي التحجيم. والميزة الرئيسية لهذا النهج هو مرفق النسبي الذي مقتطفات البيض والجنين يمكن التلاعب بها كيميائيا، مما يسمح للتعرف على البروتينات والأنشطة الجديدة التي تنظم حجم النووي. كما هو الحال مع أي في نهج المختبر، التحقق من النتائج في نظام في الجسم الحي هو المهم، وMicroinjection من X. الأجنة المورق مناسبة بشكل خاص لهذه الدراسات.
Introduction
أحجام العضيات الخلوية تحجيم عادة مع حجم الخلية، وهذا قد ربما أفضل موثقة لتدرج حجم النووي مع حجم الخلية 1-10. هذا صحيح بشكل خاص خلال مرحلة التطور الجنيني وتمايز الخلايا، عندما غالبا ما يلاحظ تخفيضات كبيرة في كل خلية وحجم النووي 11،12 هذا. وعلاوة على ذلك، تغيير حجم النووي معلمة رئيسية في تشخيص السرطان والتشخيص 13-17. الآليات التي تساهم في تنظيم حجم النووي غير معروفة إلى حد كبير، ويرجع ذلك جزئيا إلى التعقيد والطبيعة الأساسية للبنية النووي وظيفة. وقد تم تطوير هذا الأسلوب هو موضح هنا بمثابة فحص في المختبر لحجم النووي التحجيم التي هي قابلة للتلاعب البيوكيميائية وتوضيح آليات التنظيم حجم النووي.
القيطم المورق البيض استخراج هو نظام راسخ أن ألخص ودراسة العمليات الخلوية المعقدة في في المختبر </em> السياق. وقد كشفت هذه مقتطفات المعلومات الأساسية الجديدة عن العديد من العمليات الخلوية بما في ذلك تجميع ووظيفة المغزل الإنقسامية، الشبكة الإندوبلازمية، ونواة 18-22. واحد الميزة الرئيسية لنظام استخراج هي أن اكس. تمثل المورق مقتطفات بيضة السيتوبلازم مخفف تقريبا التي يمكن تغييرها بسهولة، على سبيل المثال من خلال إضافة بروتينات المؤتلف أو immunodepletion التكوين. وعلاوة على ذلك، هو واحد قادرا على التعامل مع العمليات الأساسية عن طريق استخدام العلاجات التي قد تكون على خلاف ذلك قاتلة في سياق في الجسم الحي. إدخال تعديلات على إجراءات استخراج البيض تسمح لعزل مقتطفات من X. الأجنة المورق بدلا من البيض، وهذه مقتطفات الجنين قابلة بالتساوي للتلاعب البيوكيميائية 23. خلال X. المورق التنمية، والمخصبة جنين وحيدة الخلية (~ مم 1) يخضع لسلسلة من اثني عشر الانقسامات الخلوية السريعة (المراحل 1-8) لتوليد عدة آلاف من 50 μم وقطرها أصغر الخلايا وصلت إلى مرحلة تنموية يطلق الانتقال midblastula (MBT) أو مرحلة 24-26 أغسطس. تتميز الدبابة مع بداية النسخ اقحي، الهجرة الخلية، الانقسامات الخلوية غير متزامن، واقتناء مراحل الفجوة، وإنشاء أحجام ثابتة للدولة نووية بدلا من التوسع النووي المستمر كما هو الحال في الجنين قبل الدبابة. من المرحلة 4 إلى المعيدة (مراحل 10،5 حتي 12)، وحجم النواة الفردية ينخفض بأكثر من 10 أضعاف (11).
هنا، فإن الهدف هو تحديد الآليات المسؤولة عن هذه التخفيضات في حجم النووي خلال التقدم التنموي. هذا النهج هو لتجميع أول نواة في اكس. المورق استخراج البيض وعزل تلك النواة من بويضة السيتوبلازم / استخراج. ثم يتم معلق هذه النوى في السيتوبلازم من الأجنة مرحلة متأخرة المعيدة. بعد فترة الحضانة، ونوى من استخراج البيض تصبح أصغر في أواخر استخراج مرحلة الجنين. نحن مسبب أن هذا عواد يكون فحص مفيدة لتحديد مكونات هيولية الموجودة في الأجنة المرحلة المتأخرة التي تساهم في تنموي حجم النووي التحجيم. باستخدام هذا الاختبار، بالإضافة إلى التحقق من صحة في الجسم الحي، أثبتنا أن بروتين كيناز C (بي كي سي) يساهم في خفض النمو في حجم النووي في اكس. المورق 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Materials
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
