Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En cellefri assay under anvendelse af Published: August 8, 2016 doi: 10.3791/54173
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biology, University of Wyoming

Abstract

Et grundlæggende spørgsmål i cellebiologi er, hvordan celle- og organel størrelser er reguleret. Det har længe været erkendt, at størrelsen af ​​kernen generelt skalerer med størrelsen af ​​cellen, navnlig under embryogenese når dramatiske reduktioner i både celle og nukleart størrelser forekommer. Mekanismer for regulering nukleare størrelse er stort set ukendt, og kan være relevante for kræft, hvor ændrede nukleare størrelse er en vigtig diagnostisk og prognostisk parameter. In vivo tilgange til at identificere regulatorer nukleare størrelse kompliceres af de væsentlige og komplekse karakter af nuklear funktion. In vitro fremgangsmåde beskrevet her for at studere nuklear størrelse drager fordel af de normale reduktioner i nuklear størrelse, der opstår under Xenopus laevis udvikling. Først kerner samles i X. laevis æggeekstrakt. Derefter er disse kerner isoleret og resuspenderet i cytoplasma fra sent embryoer. Efter en 30 - 90 min inkubationsperiode nuklear overfladearealfalder med 20 - 60%, hvilket giver en nyttig analyse for at identificere cytoplasmatiske komponenter i sene stadier embryoner, der bidrager til udviklingsmæssige nukleare størrelse skalering. En stor fordel ved denne fremgangsmåde er den relative lethed, hvormed de æg og embryoner ekstrakter kan biokemisk manipuleres, hvilket tillader identifikation af hidtil ukendte proteiner og aktiviteter, der regulerer nuklear størrelse. Som en in vitro fremgangsmåde, validering af resultater i et in vivo system er vigtig, og mikroinjektion af X. laevis embryoner er yderst velegnede til disse undersøgelser.

Introduction

Størrelserne af cellulære organeller typisk skaleres med størrelsen af cellen, og dette er blevet måske bedst dokumenteret for skalering af nuklear størrelse med cellestørrelse 1-10. Dette gælder især under embryogenese og celledifferentiering, når dramatiske reduktioner i både celle og nuklear størrelse ses ofte 11,12. Endvidere ændres nuklear størrelse er en vigtig parameter i cancer diagnose og prognose 13-17. Mekanismer, der bidrager til regulering nukleare størrelse er stort set ukendt, dels på grund af kompleksiteten og væsentlige karakter af nukleare struktur og funktion. Den her beskrevne metode blev udviklet som et in vitro-assay for nuklear størrelse skalering som er modtagelig for biokemisk manipulation og belysning af mekanismer for regulering nukleare størrelse.

Xenopus laevis æg ekstrakt er et veletableret system til at rekapitulere og studere komplekse cellulære processer i en in vitro 18-22. En vigtig fordel til ekstraktet er, at X. laevis æg ekstrakter repræsenterer en næsten ufortyndet cytoplasma hvis sammensætning kan nemt ændres, for eksempel ved tilsætning af rekombinante proteiner eller immunodepletion. Endvidere er man i stand til at manipulere væsentlige processer ved at anvende behandlinger, der ellers ville være dødelig i en in vivo kontekst. Ændringer af æg ekstrakt procedure giver mulighed for isolering af ekstrakter fra X. laevis embryoner snarere end æg, og disse embryo ekstrakter er lige modtagelige for biokemisk manipulation 23. Under X. laevis udvikling, encellede befrugtet embryo (~ 1 mm diameter) gennemgår en serie af tolv hurtige celledelinger (punkt 1 - 8) til at generere flere tusinde 50 μm diameter og mindre celler, og nåede et udviklingsstadiet betegnet midblastula overgang (MBT) eller trin 24 til 26 august. MBT er karakteriseret ved indtræden af ​​zygotisk transkription, cellemigrering, asynkrone celledelinger, erhvervelse af gap faser, og etablering af nukleare steady-state størrelser snarere end kontinuerlig nukleare ekspansion som i før-MBT embryo. Fra scenen 4 til gastrulation (iscenesætter 10,5-12), nedsætter mængden af individuelle kerner med mere end 10-fold 11.

Her er målet at finde mekanismer, der er ansvarlige for disse reduktioner i nukleare størrelse under udviklingsmæssige progression. Den fremgangsmåde er først at samle kerner i X. laevis æg ekstrakt og at isolere de kerner fra ægget cytoplasma / ekstrakt. Disse kerner derefter resuspenderes i cytoplasma fra slutningen gastrula embryoer. Efter en inkubationsperiode, kernerne fra æggeekstrakt bliver mindre i sent stadium embryo ekstrakt. Vi ræsonnerede, at denne would være et nyttigt assay til at identificere cytoplasmatiske komponenter i sene stadier embryoner, der bidrager til udviklingsmæssige nukleare størrelse skalering. Anvendelse af dette assay, kombineret med in vivo validering, demonstrerede vi, at proteinkinase C (PKC) bidrager til udviklingsmæssige reduktioner i nuklear størrelse i X. laevis 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle Xenopus procedurer og undersøgelser blev gennemført i overensstemmelse med NRC Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr 8. udgave. Protokoller blev godkendt af University of Wyoming Institutional Animal Care og brug Udvalg (Assurance # A-3216-01).

1. Fremstilling af X. laevis Egg Uddrag (tilpasset fra 27,28)

  1. Prime kvindelige X. laevis frøer mindst tre dage og højst to uger før ægudtagning med en enkelt 100 IE injektion af drægtig hoppe serum gonadotropin (PMSG).
  2. En dag før forsøget injiceres primede frøer med 800 IE humant choriongonadotropin (HCG) og sted ved 16 ° C i 1 l pr frog på 1 / 3x Marcs modificerede ringers (MMR). Se tabel 1 for alle buffer-sammensætninger.
    Bemærk: Nogle frøer vil ikke lægge æg, eller vil lægge dårlig kvalitet æg. Typisk 2 - 3 frøer injiceres for at sikre mindst én frøen vil lægge sufficient antal god kvalitet æg. Den gennemsnitlige Frøen vil lægge nok æg til at producere mindst 1 ml æg ekstrakt.
  3. Forbered 1 L 1 / 3x MMR med koldt destilleret deioniseret vand (Hedeselskabet 2 O), 500 ml puffer B, 1 L buffer C, 500 ml puffer D og 100 ml puffer E.
  4. Overførsel lagt æg til et glas krystalliseringsskål (150 x 75 mm). Ved hjælp af en plastik Pasteur-pipette med spidsen skåret af, bortforpagte hvide oppustede aktiverede æg eller lyserede æg. bevarer kun æg med tydelige og lige mørke dyr poler og hvide vegetabilsk poler.
  5. Forbered 13 x 51 mm centrifugerør med 1 ml buffer E suppleret med 355 uM cytochalasin D tilsættes umiddelbart før anvendelse i trin 1.7.
  6. Dejelly og vaske æggene.
    1. Vask æg kortvarigt med koldt 1 / 3x MMR i en passende størrelse bæger, ændre bufferen 3 - 4 gange.
    2. Fjern gelé frakker fra æggene ved inkubering med puffer B. Dette vil tage alt fra 3 - 10 min. Som overskyet gelé frakker frigives fra æggets, ændre bufferen.
      Bemærk: Dejellying er afsluttet, når æggene synes tæt pakket i hjørnet af skålen, når det vippes og vegetabilske poler er orienteret nedad. Æg er langt mere skrøbelige efter dejellying, så ikke inkuberes æg med puffer B i længere tid end nødvendigt og efterfølgende vaske skal udføres meget omhyggeligt.
    3. Vask æg kortvarigt med 3 - 4 ændringer i Buffer C.
    4. Vask æg kortvarigt med 2 ændringer af buffer D.
    5. Vask æg kortvarigt med 2 ændringer af Buffer E.
  7. Fyld centrifugerør med æg ved hjælp af en bred boring glas pipette eller plast dropper. Aspirer overskydende buffer. At pakke æggene og fjerne så meget puffer som muligt, centrifugeres i svingende spand-rotor ved 212 xg i 60 sek og derefter ved 478 x g i 30 sek. Aspirer overskydende buffer.
    Bemærk: Det er vigtigt at fjerne så meget overskydende buffer som muligt på dette trin for at sikre ægget ekstrakt minimalt fortyndet.
  8. I en svingende bucket rotor, ultracentrifuge under vakuum i 15 minutter ved 12.000 xg og 4 ° C for at knuse æg åbne og skille i forskellige lag, med cytoplasmaet er den ravfarvet lag i midten. Fjern centrifugerør og sted umiddelbart på is.
  9. Saml ekstraktet.
    1. Ved anvendelse af en 18 gauge nål og sprøjte, punktere centrifugerøret lige over den mørke pigmenterede lag på bunden af ​​røret og fjern den midterste ravfarvet cytoplasmatisk lag. Du må ikke indsamle nogen af ​​de øverste lipid lag. Saml cytoplasmaet i en passende størrelse rør.
      Bemærk: Generelt en frø producerer mindst 1 ml ekstrakt.
    2. Supplement cytoplasma med 1/1000 mængden af ​​19,7 mM cytochalasin D, 1/1000 mængden af ​​LPC bestand, og 1/50 volumen 50x energimix. Vend forsigtigt røret for at blande. Ikke overdrevent pipetteres ekstraktet.
    3. Hold ekstrakt på is og bruge det inden for 3 timer til forberedelse for de bedste resultater.
_title "> 2. Udarbejdelse af Demembranated X. laevis Sperm (tilpasset fra 29)

Bemærk: Proceduren mængder præsenteres her er for op til 8 testikler.

  1. Fjern 0,05% benzocain (10% benzocain lager fremstilledes i ethanol og fortyndet til 0,05% i frog akvarium vand) fra 4 ° C og opvarmes til stuetemperatur. Bedøver og ofre mandlige X. laevis frøer i benzocain opløsning ved stuetemperatur i 20 - 30 min. Sørg døden ved fravær af hjerteslag ved at undersøge og føle brystet, ved manglende respons på mekanisk stimulation, og / eller ved halshugning.
  2. Foretag en U-formet indsnit langs maven. Fjern tubulated masse af gule fedtstoffer organer. På toppen af nyrerne, lokalisere testiklerne, som er ovalformede blegrøde masserne omkring 1 cm i længden 29. Udskære testiklerne og rulle den på trækpapir til fjernelse blod og andet væv.
  3. Vask testikler i Buffer T. Brug en stram monteret støder til hakkekød testikler med 1 ml bufferT i et 1,5 ml rør indtil homogenitet (10 slag eller mere). Centrifuger 5 - 10 sekunder i en mini-centrifuge og indsamle supernatanten, fjerne store stykker af væv. Der centrifugeres igen og indsamle supernatanten.
  4. Overfør sperm-holdige opløsning til en 15 ml plastrør. Forøg lydstyrken til i alt 2 ml med puffer T. Centrifuger ved 1.411 xg i 10 minutter ved 16 ° C for at pelletere sperm.
  5. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 500 pi buffer T. Centrifuger ved 1.411 xg i 10 minutter ved 16 ° C. Gentag dette trin en eller to gange som nødvendigt for at rense pellet af somatiske og røde blodlegemer.
  6. Pellet resuspenderes i 100 pi Buffer T og 300 pi Buffer S. Der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
    Bemærk: Buffer S indeholder lysolecithin, som er ansvarlig for demembranation.
  7. Tilføj tre bind af Buffer R (forberedt frisk før brug). Invert rør præcis én gang. Centrifuger ved 1.411 xg i 15 minutter ved 16 &# 176; C.
  8. Pellet resuspenderes i 400 pi Buffer R og derefter tilføje yderligere 2 ml buffer R. Centrifuger ved 1.411 xg i 15 minutter ved 16 ° C.
  9. Pellet resuspenderes i 50 pi Buffer T.
  10. Fortynd 1 gl demembranated sædceller kerner med 9 pi Buffer T. Anvend denne fortynding til et hæmocytometer. Tæl antallet af tynde S-formede sædceller kerner i én stor 4 x 4 gitter, og formere sig, at antallet med 100 for at få koncentrationen af ​​bestanden i sædceller kerner pr pl.
  11. Fortynd bestanden til 100.000 sædceller kerner per pi med Buffer T, hvilket resulterer i et 200x lager. Forbered 3 - 5 pi alikvoter. Flash fryse i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.

3. Nuklear Assembly

  1. Supplement 100 pi æg ekstrakt med 1,5 pi 35,5 mM cycloheximid (slutkoncentration ~ 0,5 mM), 6 pi 20x calcium stamopløsning (endelig koncentration ~ 0,6 mM), og 0,7 pi 200x sædceller (slutkoncentration ~ 700sperm kerner / pl). Skaler reaktionen lydstyrken op eller ned efter behov. Vend eller forsigtigt tryk på for at blande.
    Note: Uddrag cyklede fra metafase i interfase giver en mere robust og pålidelig platform for nuklear samling.
  2. Inkuber i et vandbad ved 16 - 20 ° C i 90 minutter. Bland ved forsigtigt at banke hver 15 min for at sikre kerner forbliver suspenderet i ekstraktet.
  3. Overvåg fremskridt af nuklear samling på 45 min ved at forberede en squash som følger.
    1. Pipette 2 pi ekstrakt onto en glasplade og tilsættes 2 pi kerne fix.
    2. Overlay med en 22 mm 2 dækglas. Billede på en epifluorescensmikroskop ved hjælp af vand, olie eller luft 20 - 100X mål, og et DAPI-filter.
      Bemærk: Kerner kan visualiseres ved lysfeltsbillede billeddannelse, men er meget lettere at visualisere ved fluorescens.
    3. Brug kerner straks eller flash fryse portioner i flydende nitrogen og opbevares ved -80 ° C.
      Bemærk: Tilføjelse 4% glycerol til kerner PRIOR til frysning kan bidrage til at bevare deres integritet. Frosne kerner er generelt stadig levedygtig og i stand til nukleare import, men indefrysning processen kan føre til forstyrret eller flere strukturelt skrøbelige kerner. Kerner op til et år efter frysning kan anvendes.

4. Fremstilling af X. laevis Embryo Uddrag

  1. Fremkald kvindelige X. laevis frøer at lægge æg, som beskrevet i afsnit 1.1 og 1.2.
  2. Isoler testikler fra mandlige X. laevis frøer som beskrevet i 2.2. Sænk testikler i L15 medier suppleret med 50 IU / ml penicillin og streptomycin i et glas 35 x 10 mm petriskål. Opbevar ved 4 ° C i op til to uger.
  3. Indsamle og befrugte æg.
    1. Saml nylagte æg ved at holde frøer over et glas genbruges petriskål og fremme æglægning ved at anvende let tryk på lænden nær kloakken. Klemme frøen for hårdt, kan resultere i skader, der fører til en oppustet mave og requiring eutanasi 29.
    2. Prop fadet på en omtrentlig 45 ° vinkel, tillader æg til at indsamle i kanten af ​​skålen, fjerne alle overskydende buffer, og tilføje nok 1 / 3x MMR til knap dække æggene. Gød æg inden for 15 minutter efter opsamling.
    3. Brug en stramt støder til udblødte og homogeniseres 1/4 af en testis i et 1,5 ml rør med 500 pi højsalt Modificerede Barths Saline (højt saltindhold MBS). Tilføj macererede testikler til æggene og muliggøre fertilisering at forekomme ved stuetemperatur i 15 - 20 min, derefter oversvømme æg med 1 / 3x MMR.
      Bemærk: Effektiviteten af ​​testiklerne falder med opbevaringstid, derfor kan det være nødvendigt mere testiklerne væv for en vellykket befrugtning ved brug af testikler, der har været opbevaret i mere end en uge.
    4. Bekræft befrugtning ved at kontrollere for sammentrækning af mørke pigmenterede dyr stang og ved rotation af embryonerne med deres dyr poler vender opad, sædvanligvis ca. 20 - 30 minutter efter tilsætning af knust testes. Venter den første celle spaltning at forekomme inden 90 min.
    5. Ved hjælp af en bred boring glaspipette flittigt fjerne døde (hvid og oppustede eller ujævn fordeling af blomme og pigment), lyseret, eller ubefrugtede æg (dvs. ikke spaltet), da de hurtigt vil inducere død i tilstødende embryoer.
    6. Anywhere 1-2,5 timer efter befrugtning, dejelly embryoner i 2 - 3 i% cystein opløst i 1/3 x MMR og justeret til pH 7,9 med 10 N KOH. Udføre to buffer-ændringer, der er hver 3 - 4 min. Vask grundigt embryoner med 6 - 10 korte ændringer i 1 / 3x MMR at fjerne alle spor af cystein.
      Bemærk: Dejellied embryoner har en vitellinmembranen og er ikke så skrøbelig som dejellied æg.
  4. Ved hjælp af en bred boring glas pipette sunde befrugtede (dvs. spaltes) embryoer til en petriskål indeholdende frisk 1 / 3x MFR og tillade dem at udvikle sig til det ønskede stadium ved stuetemperatur eller, hvis langsommere udvikling foretrækkes, 16 ° C. Fortsæt med at fjerne døde eller lySED embryoner angivet med mangel på første division eller hvid puffy udseende.
  5. Kontroller den fase af embryonerne ved at kontrollere for næsten fuldstændig lukning af blastopore og ved at sammenligne med tegninger af iscenesatte embryoner til rådighed i referencematerialer 24.
    Bemærk: Embryoner dyrket ved 16 ° C vil nå fase 11.5 - 12 i ca. 12 timer.
  6. Inkuber fase 11,5 - 12 embryoer i frisk 1 / 3x MMR suppleret med 0,5 mM cycloheximid i 1 time ved stuetemperatur, til at standse embryoner i slutningen interfase.
  7. Transfer med bred boring glas eller plastik pipette mindst 15 (helst 30 eller flere) interfase-arresteret embryoner til et mikrocentrifugerør.
    Bemærk: 15 embryoer er tilstrækkelige til at producere ca. 20 pi ekstrakt. Skalere op efter behov.
  8. Tilsæt 1 ml æg lysispuffer (ELB) suppleret med 1 pi LPC lager. Vend forsigtigt at vaske embryoner, tillade embryoner til at falde til bunden af ​​røret, og fjern pufferen. Gentag dette vasketrin to gange mere. </ Li>
  9. Resuspender embryoner i 500 pi ELB plus 0,5 pi LPC lager, 5 pi 19,7 mM cycloheximid, og 5 pi 35,5 mM cytochalasin D (for at inhibere actinpolymerisation). Centrifuger ved 200 x g i 1 min i en bordplade mikrocentrifuge.
  10. Fjern overskydende buffer og bruge en støder til grundigt knuse embryoer. Centrifuge i en svingende spand-rotor i 10 minutter ved 10.000 xg og 16 ° C.
  11. Punktere lipid lag fra toppen med en 200 pi pipettespids. Med en ren 200 pi pipettespids, fjerne den midterste cytoplasmatiske rav-farvet lag til en passende størrelse rør.
  12. Supplement embryo ekstrakt med 1/50 volumen 50x energimix (for at tilvejebringe et ATP regenerationssystem), 1/100 volumen af ​​35,5 mM cyclohexamid, 1/500 volumen af ​​19,7 mM cytochalasin D, og ​​1 / 1.000 mængden af LPC lager.
  13. Forbered en squash, som beskrevet i 3.3 at visualisere endogene embryonale kerner i ekstraktet.
    Bemærk: Embryo ekstrakt kan fryses med de endogene kerner på dette punkt. Portion for at reducere fryse / tø cykler og opbevares ved -80 ° C.
  14. At fjerne kerner fra embryonet ekstrakt, fortyndes ekstrakten med et tilsvarende volumen af ​​ELB indeholdende 1/50 volumen 50x energimix, 1/100 volumen af ​​35,5 mM cyclohexamid, 1/500 volumen af ​​19,7 mM cytochalasin D, og 1 / 1.000 mængden af ​​LPC lager. Centrifuge i en svingende spand-rotor ved 17.000 xg i 15 minutter ved 16 ° C.
  15. Saml supernatanten være omhyggelig med at undgå enhver resterende lipid på toppen. Ikke forstyrrer de pelleterede kerner i bunden af ​​røret. Forbered en squash, som beskrevet i 3.3 for at sikre, at de fleste kerner er fjernet. Brug ekstraktet friske eller alikvot og opbevares ved -80 ° C.
  16. At opvarme inaktivere embryo ekstrakt til kontrolforsøg, varme- 30 - 100 pi alikvoter af ekstrakt ved 56 ° C i 30 minutter under anvendelse af en termisk cykliseringsapparat. Tillad varmeinaktiveret ekstrakt for at vende tilbage til stuetemperatur før brug.
_title "> 5. Nuklear Krympning Assay og Immunofluorescens

  1. Isoler kerner samlet i æg ekstrakt ved at fortynde 25 - 150 ul formonterede kerner i 1 ml ELB i et 1,5 ml rør. Centrifuger ved 1.600 xg i 3 minutter ved 4 ° C i en bordplade mikrocentrifuge. Fjern buffer, og pas på ikke at forstyrre den skrøbelige pellet af kerner i bunden af ​​røret.
  2. Resuspender kerner i et volumen på embryo ekstrakt svarende til det oprindelige volumen af ​​æg ekstrakt anvendes i 5.1. Brug ELB eller varme inaktiveret ekstrakt for kontrol reaktioner, som er relevant.
  3. Bank forsigtigt på røret for at bryde op pellet og resuspenderes kerner. Der inkuberes ved stuetemperatur i 90 minutter, forsigtigt at banke på glasset for at blande hver 15 - 30 min. Bemærk: De fleste af de nukleare krympning sker inden for de første 30 min.
  4. Overvåg fremskridt af nuklear krympning ved at forberede en squash.
    1. Pipette 2 pi ekstrakt onto en glasplade og tilsættes 2 pi kerne fix.
    2. Overlay med en 22 mm 2
  5. Tap på røret for at resuspendere kernerne lige før tilsætning 500 pi fiksativ bestående af ELB, 15% glycerol og 2,6% paraformaldehyd. Invert straks, og glasset anbringes på en rotator i 15 minutter ved stuetemperatur.
  6. Forbered spin ned rør ved aptering 15 ml runde bund glasrør med runde bund kunststof (design og skemaer kan rekvireres). Der tilsættes 5 ml nukleare pude buffer. Drop en 12 mm cirkulær dækglas i røret, og sørg for den ligger fladt på toppen af ​​den plastindsats.
  7. Forsigtigt lag opløsningen indeholdende faste kerner på toppen af ​​den nukleare pude under anvendelse af en stor indvendig diameter pipettespids. Centrifuge i en svingende spand-rotor i 15 minutter ved 1.000 xg og 16 ° C.
  8. Brug et sug til at fjerne alle bufferen og træk plastikindsats til toppen af ​​røret. Fjern dækglasset med et par fine tænger, være omhyggelig med at bemærke den side af dæksletglide på hvilken kernerne blev centrifugeret. Post-fix i kold methanol (opbevaret ved -20 ° C) i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Overfør dækglasset kerne opad på et stykke plast paraffin film foring af et stor plastik petriskål. Placer våde engangsklude langs siden af ​​skålen for at undgå dehydrering.
  10. Rehydrere kerner på dækglasset med 500 pi PBS-NP40 (1x PBS plus 0,1% NP40) og aspirat efter 5 - 10 sek.
  11. lag omhyggeligt 75 pi PBS-3% bovint serumalbumin (BSA) på dækglasset. Tillad til blok 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
  12. Fjern blokeringsopløsning, og inkuberes med primært antistof (f.eks mAb414 mod nukleare pore kompleks, 1: 1.000) fortyndet i PBS-3% BSA i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Vask med fem umiddelbare ændringer af PBS-NP40.
  13. Inkuber med sekundært antistof fortyndet i PBS-3% BSA i 1 time ved stuetemperatur. Vask med fem umiddelbare ændringer af PBS-NP40.
  14. inkubermed 10 ug / ml Hoechst fortyndet i PBS-3% BSA i 5 minutter ved stuetemperatur. Vask fem gange med PBS-NP40. Fjern al overskydende buffer.
  15. Monter dækglasset på et dias med 5 pi antiblegemiddel montering medium. Seal med klar neglelak. Billede straks ved hjælp af et epifluorescensmikroskop med 20 - 100x mål eller opbevares ved 4 ° C til senere billeddannelse.
    Bemærk: Udfør kvantificering som tidligere beskrevet 23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Montering af Kerner i Egg Uddrag

De første skridt i denne protokol er at forberede X. laevis æg ekstrakt (protokol 1), og demembranated sperm kerner (protokol 2). Disse reagenser anvendes derefter til at samle kerner de novo (protokol 3). Figur 1 viser nogle repræsentative data. Tilsætning af calcium driver meiotisk anholdt æg ekstrakt i interfase og cycloheximid holder ekstrakt anholdt i interfase. Ved 30 - 45 min efter initiering af reaktionen, bør begynde med tynde S-formede sædceller kerner begynder at blive tykkere i slug-formet kromatin masserne. Vellykket dannelse af et intakt nuklear kappe kan vurderes ved indførsel og fastholdelse af en fluorescens-mærket import fragt, såsom GST-GFP-NLS (data ikke vist), eller ved rand farvning for den nukleare pore kompleks under anvendelse mAb414 som genkender FG-repeat beholdere underning nucleoporins (figur 1A). Efter opstår nukleare forsamling, bør nukleare form blive mere afrundet og den nukleare volumen bør stige som det nukleare kuvert udvider og nukleare proteiner importeres (figur 1B-C). Manglende overholdelse dannelse af en intakt nukleare kuvert eller nuklear vækst indikerer en dårlig kvalitet æg ekstrakt. I dette tilfælde er det bedst at starte forfra med et nyt parti af æg.

Fjernelse af Endogen Kerner fra Embryo Uddrag
Det næste trin er at fremstille et sent tidspunkt embryo ekstrakt (protokol 4). Efter indledende fremstilling af ekstrakten og før fjernelse af kerner, er det bedst at fremstille et Hoechst-farvet squash af en lille prøve af ekstrakten. Visualisering af mange små embryonale kerner er en god indikation af succes i udarbejdelsen af ekstrakt (figur 2A). Som endogene embryonale kerner kan forstyrre den nedstrøms analysis, er det også vigtigt at kontrollere en prøve af ekstrakten efter fjernelse kerner ved fortynding og centrifugering. Sammenlignet med den første squash, bør meget få kerner efterlades i ekstraktet (figur 2B). Hvis der stadig er mange kerner til stede, er en anden runde af centrifugering påkrævet.

Nuklear Krympning Assay
Figur 3 viser repræsentative resultater af nukleare skrumpende assay (Protokol 5). Egg ekstrakt kerner resuspenderes i sent stadium embryo ekstrakt bliver mindre over tid (figur 3B). En god negativ kontrol for assayet er at inkubere kerner med embryo ekstrakt, der er blevet varmeinaktiveret (figur 3A). Som kerner undlader at skrumpe i varme inaktiveret ekstrakt, dette giver en vis tillid, der blev observeret nukleare krympning med ubehandlet embryo ekstrakt er ikke en konsekvens af osmotiske effekter. Omfanget af nukleare størrelsereduktioner set varierer afhængigt af det særlige parti æggeekstrakt kerner samt kvaliteten af ​​embryonet ekstrakt. Det er vores erfaring, er nuklear krympning altid observeret (fx i mere end 40 forskellige embryo ekstrakter), men det er vigtigt at gentage disse forsøg flere gange med forskellige kerner og udtrækker at løse for de variationer af assayet. Figur 4 viser et skematisk af hele protokollen.

figur 1
Figur 1. Nuclear Assembly Time Kursus i X. laevis æggeekstrakt. Kerner blev samlet de novo i X. laevis æg ekstrakt som beskrevet i protokol 3. Alikvoter fra den samme reaktion blev fikseret og visualiseret ved immunofluorescens ved anvendelse af et antistof mod den nukleare pore kompleks (NPC) (mAb414) hos: > A) 30 min, B) 60 min, og C) 90 min efter indledningen af nukleare samlinger. Den immunofluorescens protokol er beskrevet i protokol 5. Målestokken er 25 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Fjernelse af Kerner fra X. laevis Embryo Uddrag. X. laevis embryo ekstrakt blev fremstillet fra trin 11,5 - 12 embryoer som beskrevet i protokol 4. En lille prøve af ekstrakten blev fikseret og farvet med Hoechst: A) før fjernelse af kerner, og B) efter fjernelse af kerner ved centrifugering. Skalaen bar er 25 um.about / filer / ftp_upload / 54.173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3. Repræsentant data fra Nuclear Krympning-analysen. Kerner blev samlet de novo i X. laevis æg ekstrakt suppleret med rekombinant GFP-LB3 (for at visualisere den nukleare lamina). Som beskrevet i protokol 5, blev æggeekstrakt kerner isoleret og resuspenderet i trin 11,5-12 embryo ekstrakt hvorfra endogene embryonale kerner var blevet fjernet. Levende time-lapse billeddannelse blev udført ved 30 sek intervaller i 90 min. Figur paneler vise billeder erhvervet ved 6 minutters intervaller for kerner inkuberet i: A) sent tidspunkt embryo ekstrakt (LEE), og B) varme-inaktiveret (HI) embryo ekstrakt. Billeder fra tidsforløb fortsættefra venstre mod højre. Skalaen bar er 25 um. C) Nuclear skrumpende data fra 46 forskellige æg og embryoner ekstrakter. Søjler viser organerne til> 240 kerner. Fejl barer er standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Skematisk af Nuclear Krympning-analysen. Hver farvet boks repræsenterer en protokol. Rød indikerer fremstilling af X. laevis æg ekstrakt (Protokol 1). Blå angiver udarbejdelse af demembranated X. laevis sæd (protokol 2). Pink viser de novo nukleare samling i æg ekstrakt (protokol 3). Grøn angiver fremstilling af X. laevis embryo ekstrakt (protokol 4). Lilla angiver nukleare shrinking assay-protokol og immunofluorescens (Protokol 5). Dele af dette tal er blevet genbrugt fra 23. Klik her for at se en større version af dette tal.

Buffer navn buffer sammensætning
Marc modificerede Ringers (MMR), 1 / 3x 33 mM NaCl, 0,7 mM KCI, 0,3 mM MgSO4, 0,7 mM CaCl2, 1,7 mM HEPES, pH 7,4
Ekstrakt puffer (XB), 10x 1 M KCI, 1 mM CaCl2, 10 mM MgCl2, 500 mM sucrose, 100 mM HEPES, pH 7,8 (pH justeret med 10 N KOH, opbevaret ved 4 ° C)
puffer B 4% cystein opløst i 0,8x XB (fremstillet med kold Hedeselskabet 2 O, pH adjusted til 7,8 med 10 N NaOH)
buffer C Bland 100 m 10x XB med 900 ml kold Hedeselskabet 2 O
buffer D Buffer C plus 5 mM EGTA og 800 uM MgCl2
LPC lager, 1.000 x 10 mg / ml af hver af leupeptin, pepstatin og chymostatin opløst i DMSO (opbevaret i portioner ved -20 ° C)
buffer E 100 ml buffer D plus 100 pi LPC lager
Energimix, 50x 190 mM creatinphosphat dinatrium, 25 mM ATP-dinatriumsalt, 25 mM magnesiumchlorid
Buffer T 15 mM PIPES, 15 mM NaCl, 5 mM EDTA, 7 mM MgCl2, 80 mM KCI, 0,2 M saccharose, pH 7,4 (filter sterilisere og opbevaret ved 4 ° C)
Buffer S 20 mM maltose og 0,05% lysolecithin fremstillet i Buffer T
Buffer R Buffer T plus 3% bovintserumalbumin
Calcium stamopløsning, 20x 10 mM CaCl2, 0,1 M KCI, 1 mM MgCl2 (opbevaret ved -20 ° C)
nucleus fix 125 pi 2 M saccharose, 12,5 pi 1 M HEPES pH 7,9, 250 pi 37% formaldehyd, 112 pi Hedeselskabet 2 O, 0,5 pi 10 mg / ml Hoechst (opbevares ved stuetemperatur i op til to uger)
Modificeret Barths Saline (MBS), 10x 880 mM NaCl, 10 mM KCI, 50 mM HEPES, 25 mM NaHCO3, pH 7,8
Højt saltindhold MBS 1x MBS plus 0,7 mM CaCl2 og 20 mM NaCl
Egg lyseringsbuffer, ELB 250 mM sucrose, 50 mM KCI, 2,5 mM MgCl2, 10 mM HEPES, pH 7,8
Nuklear pude buffer 1x XB, 0,2 M saccharose, 25% glycerol (filtersteriliseret og opbevaret ved 4 ° C)

Tabel 1. Buffere. Kompositioner af alle buffere er nævnt i denne protokol, er beskrevet i denne tabel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG Molecular Probes A10037
ATP disodium salt Sigma Aldrich A2383
Benzocaine Sigma Aldrich E1501
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A3059
CaCl2 Sigma Aldrich C3306
Centrifuge Beckman J2-21M
Centrifuge rotor Beckman JS 13.1
chymostatin Sigma Aldrich C7268
creatine phosphate disodium Calbiochem 2380
cycloheximide Sigma Aldrich C6255
cytochalasin D Sigma Aldrich C8273
disposable wipes (kimwipes) Sigma Aldrich Z188956
L-cysteine Sigma Aldrich W326306
EGTA Sigma Aldrich E4378
Formaldehyde Sigma Aldrich F8775
Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) VWR 89090-662
Glycerol Macron 5094-16
HEPES Sigma Aldrich H4034
Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma Aldrich B2261
HCG - Human Chorionic Gonadotropin  Prospec hor-250-c
L15 Media Sigma Aldrich L4386
leupeptin Sigma Aldrich L2884
Lysolecithin Sigma Aldrich L1381
mAb414 Abcam ab24609
MgCl2 EMD MX0045-2
MgSO4 Sigma Aldrich M9397
Maltose Sigma Aldrich M5885
NP40 BDH 56009
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Penicillin + Streptomycin Sigma Aldrich Pp0781
pepstatin Sigma Aldrich P5318
PIPES Sigma Aldrich P6757
Plastic paraffin film (parafilm) Sigma Aldrich P7793
KCl Sigma Aldrich P9541
KH2PO4 Mallinckrodt 70100
KOH Baker 5 3140
PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec hor-272-a
NaCl Sigma Aldrich S3014
NaHCO3 Fisher BP328
Na2HPO4 EMD SX0720-1
NaOH EMD SX0590
Pestle Thomas Scientific 3411D56
Round bottom glass tubes, 15 ml Corex 8441
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) ThermoFisher A10037
sucrose Calbiochem 8550
thermal cycler Bio-Rad T100
Ultracentrifuge Beckman L8-80M
Ultracentrifuge rotor Beckman SW 50.1
Vectashield (anti-fade mounting medium) Vector H-1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
  2. Wilson, E. B. The Cell in Development and Heredity. , The Macmillan Company. 727-733 (1925).
  3. Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
  4. Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
  5. Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
  6. Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
  7. Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
  8. Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
  9. Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
  10. Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
  11. Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
  12. Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
  13. Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
  14. Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
  15. Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
  16. Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
  17. Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
  18. Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
  19. Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
  20. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  21. Edens, L. J., Levy, D. L. Xenopus Development. Kloc, M., Kubiak, J. Z. , John Wiley & Sons, Inc. 325-345 (2014).
  22. Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
  23. Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
  24. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , 2nd edn, North-Holland Publishing Company. (1967).
  25. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
  26. Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
  27. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  28. Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
  29. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
  30. Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
  31. Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
  32. Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
  33. Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
  34. Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
  35. Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
  36. Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
  37. Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
  38. Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
  39. MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
  40. Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
  41. Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
  42. Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
  43. Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).

Tags

Cellular Biology , Embryo-ekstrakt regulering nukleare størrelse udvikling nuklear skrumpende assay, Organel størrelse skalering
En cellefri assay under anvendelse af<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embryo Uddrag at studere Mekanismer for Nuclear Size forordning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Edens, L. J., Levy, D. L. A… More

Edens, L. J., Levy, D. L. A Cell-Free Assay Using Xenopus laevis Embryo Extracts to Study Mechanisms of Nuclear Size Regulation. J. Vis. Exp. (114), e54173, doi:10.3791/54173 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter