Abstract
Une question fondamentale en biologie cellulaire est de savoir comment la taille des cellules et des organites sont réglementés. Il est depuis longtemps reconnu que la taille du noyau des échelles généralement à la taille de la cellule, notamment lors de l'embryogenèse alors que des réductions spectaculaires dans les deux cellules et les tailles nucléaires se produisent. Mécanismes de régulation nucléaire de taille sont largement inconnus et peuvent être pertinents pour le cancer où la taille nucléaire modifié est un paramètre diagnostique et pronostique clé. In vivo approches pour identifier les régulateurs nucléaires de taille sont compliquées par la nature essentielle et complexe de la fonction nucléaire. L'approche in vitro décrit ici pour étudier le contrôle nucléaire de taille profite des réductions de taille normale nucléaire qui se produisent au cours du développement de Xenopus laevis. Tout d' abord, les noyaux sont assemblés en X. laevis extrait d'oeufs. Ensuite, ces noyaux sont isolés et resuspendus dans le cytoplasme des embryons à un stade avancé. Au bout d'un 30-90 min période d'incubation, la surface nucléairediminue de 20-60%, en fournissant un essai utile pour identifier les composants cytoplasmiques présents dans les embryons à un stade avancé de développement qui contribuent à la taille nucléaire mise à l'échelle. Un avantage majeur de cette approche est la facilité relative avec laquelle les extraits d'ovules et d'embryons peuvent être manipulés biochimiquement, permettant l'identification de nouvelles protéines et des activités qui régulent la taille nucléaire. Comme pour toute approche in vitro, la validation des résultats dans un système in vivo est importante, et la micro - injection de X. embryons laevis est particulièrement approprié pour ces études.
Introduction
Les tailles des organites cellulaires échelle , en général avec la taille de la cellule, ce qui a été peut - être mieux documenté pour la mise à l' échelle de la taille nucléaire avec la taille des cellules 10/01. Cela est particulièrement vrai lors de l' embryogenèse et la différenciation cellulaire, lorsque des réductions spectaculaires dans les deux cellules et la taille nucléaire sont souvent observées 11,12. En outre, la taille nucléaire modifié est un paramètre clé dans le diagnostic du cancer et le pronostic 13-17. Les mécanismes qui contribuent à la réglementation nucléaire de taille sont largement inconnus, en partie en raison de la complexité et de la nature essentielle de la structure et la fonction nucléaire. La méthode décrite ici a été développé comme un test in vitro pour la taille nucléaire mise à l' échelle qui se prête à la manipulation biochimique et l' élucidation des mécanismes de régulation nucléaire de taille.
Xenopus laevis extrait d'œuf est un système bien établi pour récapituler et étudier les processus cellulaires complexes in vitro 18-22. Un des principaux avantages du système d'extraction est que X. extraits d'œufs de laevis représentent un cytoplasme presque pur , dont la composition peut être facilement modifié, par exemple par addition de protéines ou immunodéplétion recombinantes. Par ailleurs, on est en mesure de manipuler les processus essentiels en utilisant des traitements qui seraient autrement létale dans un contexte in vivo. Les modifications de la procédure d'extrait d'oeufs permettent d'isoler des extraits de X. embryons laevis plutôt que des œufs, et ces extraits d'embryons sont également prêtent à la manipulation biochimique 23. Pendant X. laevis développement, l'embryon fécondé unicellulaire (~ 1 mm de diamètre) est soumis à une série de douze divisions cellulaires rapides (étapes 1-8) pour générer plusieurs milliers de 50 μm de diamètre et de plus petites cellules, atteignant un stade de développement appelé la transition midblastula (MBT) ou le stade 24 au 26 août. Le MBT est caractérisée par l'apparition de la transcription zygotique, la migration cellulaire, des divisions cellulaires asynchrones, acquisition de phases d'écart, et l'établissement de tailles en régime permanent nucléaire plutôt que l'expansion nucléaire continue comme dans l'embryon pré-MBT. De l' étape 4 à la gastrulation (étapes de 10,5 à 12), le volume des noyaux individuels diminue de plus de 10 fois 11.
Ici, le but est d'identifier les mécanismes responsables de ces réductions de la taille nucléaire au cours de la progression du développement. L'approche consiste à assembler d' abord les noyaux dans X. laevis extrait d'oeufs et d'isoler les noyaux du cytoplasme d'oeuf / extrait. Ces noyaux sont ensuite remises en suspension dans le cytoplasme à partir d'embryons à un stade avancé de gastrula. Après une période d'incubation, les noyaux à partir de l'extrait d'œuf deviennent plus petits dans un extrait d'embryon de fin de scène. Nous avons pensé que ce would être un test utile pour identifier les composants cytoplasmiques présents dans les embryons à un stade avancé de développement qui contribuent à la taille nucléaire mise à l'échelle. L' utilisation de ce test, couplé à la validation in vivo, nous avons démontré que la protéine kinase C (PKC) contribue à la réduction du développement de la taille nucléaire de X. laevis 23.
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Protocol
Toutes les procédures et les études Xenopus ont été menées en conformité avec le Guide pour les soins et l' utilisation des animaux de laboratoire 8e édition du CNRC. Les protocoles ont été approuvés par l'Université du Wyoming Institutional Animal Care et l'utilisation Comité (Assurance # A-3216-01).
1. Préparation de X. Extrait laevis Egg (adapté de 27,28)
- X. femme Premier laevis grenouilles un minimum de trois jours et un maximum de deux semaines avant la collecte des œufs avec une seule injection de 100 UI de gonadotrophine de sérum de jument gravide (PMSG).
- Un jour avant l'expérience, injecter des grenouilles apprêtées avec 800 UI de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) et lieu à 16 ° C dans 1 litre par grenouille de 1 / 3x sonneries modifiés de Marc (ROR). Voir le tableau 1 pour toutes les compositions tampons.
Note: Certaines grenouilles ne pondent des œufs ou vont pondre des œufs de mauvaise qualité. Typiquement 2 - 3 grenouilles sont injectés pour assurer au moins une grenouille jetteront suffisannuméros de t de œufs de bonne qualité. La grenouille moyenne pond suffisamment d'oeufs pour produire au moins 1 ml d'extrait d'oeuf. - Préparer 1 L 1 / 3x ROR avec de l' eau déminéralisée distillée froide (ddH 2 O), 500 ml de tampon B, 1 litre de tampon C, 500 ml de tampon D et 100 ml de tampon E.
- Transfert pondu à un cristallisoir en verre (150 x 75 mm). En utilisant une pipette Pasteur en plastique avec la pointe coupée, affermer bouffis activé œufs blancs ou des œufs lysées. Ne conserver que les oeufs avec des pôles d'animaux sombres distincts et égaux et pôles végétaux blancs.
- Préparer 13 x 51 mm des tubes de centrifugeuse avec 1 ml de tampon E additionné de 355 uM de cytochalasine D ajouté juste avant l'utilisation à l'étape 1.7.
- Dejelly et laver les oeufs.
- Lavez les œufs brièvement avec le froid 1 / 3x MMR dans un bécher de taille appropriée, en changeant le tampon 3 - 4 fois.
- Retirer les couches de la gelée des oeufs par incubation avec le tampon B. Cela prendra entre 3 - 10 min. Comme les couches de gelée nuageux sont libérés de l'œufs, changer le tampon.
Remarque: Dejellying est terminée lorsque les oeufs apparaissent serrés dans le coin du plat lorsqu'il est incliné et les pôles végétaux sont orientés vers le bas. Les œufs sont beaucoup plus fragiles après dejellying, alors n'incubent les œufs avec le tampon B pendant plus de lavages nécessaires et suivantes doivent être effectuées très soigneusement. - Lavez les oeufs brièvement avec 3 - 4 changements de tampon C.
- Lavez les oeufs brièvement avec 2 changements de tampon D.
- Lavez les oeufs brièvement avec 2 changements de tampon E.
- Remplir des tubes de centrifugeuses avec des oeufs à l'aide d'une pipette de verre d'alésage large ou compte-gouttes en plastique. Aspirer l'excès de tampon. Pour emballer les oeufs et éliminer autant que possible tampon, centrifugeuse oscillant rotor à godets à 212 xg pendant 60 secondes, puis à 478 g pendant 30 sec. Aspirer l'excès de tampon.
Note: Il est important d'éliminer autant que possible l'excès de tampon à cette étape pour assurer l'extrait d'oeufs est peu dilué. - Dans un balancement godet rotor, ultracentrifugeuse sous vide pendant 15 min à 12 000 x g et 4 ° C pour écraser des oeufs ouverte et séparée en différentes couches, avec le cytoplasme étant la couche de couleur ambre dans le milieu. Retirer les tubes de centrifugeuse et immédiatement sur la glace.
- Recueillir l'extrait.
- En utilisant une aiguille de calibre 18 et une seringue, perforer le tube de centrifugation au-dessus de la couche pigmentée noire au fond du tube et enlever la couche du milieu cytoplasmique de couleur ambre. Ne pas recueillir toute la couche lipidique supérieure. Recueillir le cytoplasme dans un tube de taille appropriée.
Remarque: En règle générale, 1 grenouille produit au moins 1 ml d'extrait. - Supplément cytoplasme avec 1/1000 du volume de 19,7 mM cytochalasine D, 1/1000 du volume de LPC actions, et 1/50 du volume de 50x mix énergétique. inverser doucement le tube pour mélanger. Ne pas pipeter excessivement l'extrait.
- Gardez l'extrait sur la glace et de l'utiliser à moins de 3 heures de préparation pour obtenir les meilleurs résultats.
- En utilisant une aiguille de calibre 18 et une seringue, perforer le tube de centrifugation au-dessus de la couche pigmentée noire au fond du tube et enlever la couche du milieu cytoplasmique de couleur ambre. Ne pas recueillir toute la couche lipidique supérieure. Recueillir le cytoplasme dans un tube de taille appropriée.
Remarque: Les volumes de procédure présentés ici sont pour un maximum de 8 testicules.
- Retirer 0,05% benzocaïne (10% benzocaïne mère préparée dans l'éthanol et dilué à 0,05% dans l'eau du réservoir de grenouille) de 4 ° C et chaud à la température ambiante. Anesthetize et sacrifier mâle X. laevis grenouilles dans une solution de benzocaïne à la température ambiante pendant 20 - 30 min. Veiller à la mort par absence de rythme cardiaque en examinant et en sentant la région de la poitrine, par le manque de réponse à la stimulation mécanique, et / ou par décapitation.
- Faire une incision en forme de U le long de l'abdomen. Retirer la masse tubulée des corps gras jaunes. Au - dessus des reins, de localiser les testicules, qui sont des masses de roses pâles d' environ 1 cm de longueur 29 de forme ovale. Exciser les testicules et les rouler sur du papier buvard pour éliminer le sang et d'autres tissus.
- Laver les testicules dans le tampon T. Utilisez un pilon serré équipé pour hacher les testicules avec 1 ml de tamponT dans un tube de 1,5 ml jusqu'à homogénéité (10 coups ou plus). Centrifuger 5 - 10 secondes dans une mini-centrifugeuse et recueillir le surnageant, l'élimination de gros morceaux de tissu. Répétez la centrifugation une fois de plus et de recueillir le surnageant.
- Transférer la solution contenant des spermatozoïdes dans un tube en plastique de 15 ml. Augmenter le volume à un total de 2 ml avec tampon T. Centrifuger à 1411 xg pendant 10 min à 16 ° C pour sédimenter le sperme.
- Retirer le surnageant et remettre le culot dans 500 ul de tampon T. Centrifuger à 1411 xg pendant 10 min à 16 ° C. Répéter cette opération une ou deux fois si nécessaire pour nettoyer la pastille de globules rouges et somatiques.
- Reprendre le culot dans 100 ul de tampon T et 300 pi de tampon S. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
Remarque: la mémoire tampon contient de la lysolécithine, qui est responsable de demembranation. - Ajouter trois volumes de tampon R (préparé frais avant utilisation). Inversez le tube exactement une fois. Centrifuger à 1411 xg pendant 15 min à 16 ans &# 176; C.
- Reprendre le culot dans 400 ul de tampon R, puis ajouter un supplément de 2 ml de tampon R. Centrifuger à 1411 xg pendant 15 min à 16 ° C.
- Reprendre le culot dans 50 ul de tampon T.
- Diluer 1 pl demembranated sperme noyaux avec 9 ul de tampon T. Appliquer cette dilution à un hémocytomètre. Comptez le nombre de spermatozoïdes minces noyaux en forme de S dans une grande grille de 4 x 4, et multipliez ce nombre par 100 pour obtenir la concentration du stock dans les noyaux de spermatozoïdes par ml.
- Diluer le stock de 100.000 noyaux de spermatozoïdes par ml avec tampon T, résultant dans un 200x stock. Préparer 3 - 5 aliquotes. Un gel rapide dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.
3. Nuclear Assembly
- Supplément 100 ul d'extrait d'œuf avec 1,5 pi 35,5 cycloheximide mM (concentration finale ~ 0,5 mM) 6 pl 20x solution mère de calcium (concentration finale ~ 0,6 mM) et 0,7 pi de sperme 200x (concentration finale ~ 700spermatozoïdes noyaux / ul). L'échelle le volume de réaction vers le haut ou vers le bas si nécessaire. Inversez ou appuyez doucement pour mélanger.
Note: Extrait pédalé de métaphase en interphase fournit une plate-forme plus robuste et fiable pour l'assemblage nucléaire. - Incuber dans un bain d'eau à 16 - 20 ° C pendant 90 min. Mélanger en tapotant doucement toutes les 15 min pour assurer les noyaux restent en suspension dans l'extrait.
- Surveiller les progrès de l'assemblage nucléaire à 45 min en préparant une courge comme suit.
- Pipet 2 pl d'extrait sur une lame de verre et ajouter 2 pl noyau fix.
- Superposition avec une lamelle de 22 mm 2. Image sur un microscope à épifluorescence en utilisant l'eau, l'huile ou de l'air 20 - objectifs 100X et un filtre DAPI.
Note: Nuclei peut être visualisée par imagerie à champ lumineux, mais sont beaucoup plus faciles à visualiser par fluorescence. - Utilisez les noyaux immédiatement ou aliquotes de congélation flash dans de l'azote liquide et conserver à -80 ° C.
Note: Ajout de 4% de glycérol à la pr noyauxIOR à la congélation peut aider à maintenir leur intégrité. noyaux congelés sont généralement encore viable et capable d'import nucléaire, mais le processus de congélation peut conduire à des noyaux fragiles perturbées ou plus structurellement. Les noyaux jusqu'à un an après la congélation peut être utilisé.
4. Préparation de X. laevis Extrait Embryo
- Provoquer X. femme laevis grenouilles de pondre des œufs , comme décrit dans 1.1 et 1.2.
- Isoler les testicules de X. mâle laevis grenouilles comme décrit dans 2.2. Immerger testicules dans les médias L15 supplémenté avec 50 UI / ml de pénicilline et de la streptomycine dans un verre 35 plat x 10 mm Petri. Conserver à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines.
- Recueillir et féconder les oeufs.
- Collecter les œufs fraîchement pondus par la tenue des grenouilles sur une boîte de Petri réutilisables en verre et de promouvoir la ponte en appliquant une légère pression sur le bas du dos près du cloaque. Serrant la grenouille trop dur peut entraîner des blessures, conduisant à un abdomen ballonné et requiring euthanasie 29.
- Prop le plat à un angle de 45 ° environ, permettent de recueillir des oeufs dans le bord de l'assiette, supprimer tous les excès de tampon, et ajouter assez 1 / 3x MMR pour couvrir à peine les œufs. Fertiliser oeufs dans les 15 min de collection.
- Utilisez un pilon bien équipé macérer et homogénéiser 1/4 d'un testicule dans un tube de 1,5 ml avec 500 pi de sel élevé Modifié Saline de Barth (High Salt MBS). Ajouter testicules macérées aux oeufs et permettre la fécondation de se produire à la température ambiante pendant 15 - 20 min, puis inonder les oeufs avec 1 / 3x MMR.
Note: Efficacité des testicules diminue avec le temps de stockage, donc plus de tissus des testicules peut être nécessaire pour une fécondation réussie lors de l'utilisation des testicules qui ont été stockées pendant plus d'une semaine. - Confirmer la fécondation en contrôlant la contraction du pôle animal pigmentée et par la rotation des embryons avec leurs pôles d'animaux vers le haut, habituellement d'environ 20 - 30 minutes après l'addition de pilée testes. Attendez-vous à la première coupure de la cellule de se produire dans les 90 min.
- En utilisant une grande pipette en verre de forage retirer diligemment morts (blanc et bouffi ou la distribution inégale de jaune et de pigment), lysées, ou des œufs non fécondés (ie, non fendues), car ils vont rapidement induire la mort des embryons voisins.
- Partout 1 à 2,5 heures après la fécondation, les embryons dejelly à 2 - 3% cystéine dissous dans 1/3 x ROR et ajusté à pH 7,9 avec 10 N KOH. Effectuer deux changements de tampon qui sont chacun 3 - 4 min. Laver soigneusement les embryons avec 6 - 10 brèves modifications de 1 / 3x MMR pour éliminer toute trace de cystéine.
Remarque: les embryons Dejellied ont une membrane vitelline et ne sont pas aussi fragiles que les œufs dejellied.
- En utilisant une grande pipette en verre d'alésage, transférer fécondés (ie, clivés) embryons sains à une boîte de Pétri contenant fraîche 1 / 3x ROR et leur permettre de développer à l'étape souhaitée à la température ambiante ou, si le développement plus lent est préférable, 16 ° C. Continuer à supprimer morts ou lyembryons sed indiqué par le manque de première division ou l'apparence de bouffi blanc.
- Vérifiez la scène des embryons en vérifiant la fermeture presque complète du blastopore et en comparant les dessins d'embryons mis en scène disponibles dans les matériaux de référence 24.
Note: Embryons en culture à 16 ° C va atteindre le stade de 11,5 à 12 à environ 12 h. - Incuber stade 11.5 - 12 embryons frais 1 / 3x MMR supplémenté avec 0,5 mM cycloheximide pendant 1 heure à température ambiante, pour arrêter des embryons à la fin de l'interphase.
- Transfert avec grand verre d'alésage ou d'une pipette en plastique un minimum de 15 (de préférence de 30 ou plus) embryons de interphase-arrêté à un tube de microcentrifugeuse.
Note: 15 embryons sont suffisantes pour produire environ 20 ul d'extrait. Intensifier au besoin. - Ajouter 1 ml de tampon de lyse d'oeuf (ELB) additionné de 1 pl de LPC stock. Retourner doucement pour laver les embryons, permettre à des embryons à tomber au fond du tube, et retirer le tampon. Répétez cette étape de lavage deux fois. </ Li>
- embryons Resuspendre dans 500 pi de ELB, plus 0,5 pi de LPC actions, 5 pi de cycloheximide mM 19,7 et 5 pi de 35,5 mM cytochalasine D (pour inhiber la polymérisation de l'actine). Centrifuger à 200 xg pendant 1 min dans une microcentrifugeuse de table.
- Retirer l'excès de tampon et d'utiliser un pilon pour écraser complètement les embryons. Centrifugeuse dans un seau rotor oscillant pendant 10 min à 10 000 xg et 16 ° C.
- Piquer la couche lipidique du haut avec une pointe de pipette 200 pi. Avec une pointe de pipette 200 pi propre, enlever la couche de couleur ambre cytoplasmique milieu à un tube de taille appropriée.
- Supplément extrait d'embryon avec 1/50 du volume de 50x mélange d'énergie (pour fournir un système de régénération d'ATP), 1/100 le volume de cyclohexamide 35,5 mM, 1/500 le volume de cytochalasine D 19,7 mM et 1/1000 le volume de LPC stock.
- Préparer une courge comme décrit dans 3.3 pour visualiser les noyaux embryonnaires endogènes dans l'extrait.
Note: extrait de Embryo peut être congelé avec les noyaux endogènes à ce stade. Aliquote à réduire cycles de gel / dégel et conserver à -80 ° C. - Pour éliminer les noyaux de l'extrait d'embryon, on dilue l'extrait avec un volume égal de ELB contenant 1/50 du volume de 50x mix énergétique, 1/100 le volume de 35,5 mM cyclohexamide, 1/500 le volume de 19,7 mM cytochalasine D, et 1/1000 du volume de LPC stock. Centrifugeuse dans un seau rotor oscillant à 17.000 xg pendant 15 min à 16 ° C.
- Recueillir le surnageant en prenant soin d'éviter tout lipide restant au sommet. Ne pas déranger les noyaux en culot au fond du tube. Préparer une courge comme décrit dans 3.3 à veiller à ce que la plupart des noyaux ont été enlevés. Utilisez l'extrait frais ou aliquote et conserver à -80 ° C.
- Pour chauffer inactivent extrait d'embryon pour des expériences de contrôle, la chaleur 30 - 100 aliquotes d'extrait à 56 ° C pendant 30 min en utilisant un cycleur thermique. Laisser extrait inactivé à la chaleur pour revenir à la température ambiante avant utilisation.
- Isoler les noyaux assemblés dans l'extrait d'œuf en diluant 25 - 150 ul de noyaux pré-assemblés dans 1 ml ELB dans un tube de 1,5 ml. Centrifuger à 1600 g pendant 3 min à 4 ° C dans une microcentrifugeuse de table. Retirer le tampon, en faisant attention de ne pas perturber le culot fragile des noyaux au fond du tube.
- La remise en suspension des noyaux dans un volume d'extrait d'embryon égal au volume initial de l'extrait d'oeuf utilisé en 5.1. Utilisez ELB ou extrait inactivé à la chaleur pour les réactions de contrôle, selon le cas.
- Tapoter doucement le tube pour briser le culot et remettre les noyaux. Incuber à température ambiante pendant 90 min, tapotant doucement le tube pour mélanger toutes les 15 - 30 min. Note: La plupart du rétrécissement nucléaire survient dans les 30 premières minutes.
- Surveiller les progrès du rétrécissement nucléaire en préparant une courge.
- Pipet 2 pl d'extrait sur une lame de verre et ajouter 2 pl noyau fix.
- Overlay avec un 22 mm 2
- Appuyez sur le tube pour remettre en suspension les noyaux juste avant l'ajout de 500 pi de fixateur constitué de ELB, 15% de glycérol, et 2,6% de paraformaldehyde. Inversez immédiatement, et placer le tube sur un rotateur pendant 15 min à température ambiante.
- Préparer centrifuger tubes en équipant 15 ml tubes de verre à fond rond avec des inserts en plastique fond rond (conception et des schémas disponibles sur demande). Ajouter 5 ml de tampon de coussin nucléaire. Déposez une lamelle circulaire de 12 mm dans le tube, en étant sûr qu'il repose à plat sur le dessus de l'insert en plastique.
- couche doucement la solution contenant des noyaux fixes sur le dessus du coussin nucléaire en utilisant une pointe de pipette de gros calibre. Centrifugeuse dans un seau rotor oscillant pendant 15 min à 1000 xg et 16 ° C.
- Utilisez un aspirateur pour enlever la totalité de la mémoire tampon et tirez l'insert en plastique vers le haut du tube. Retirer la lamelle avec une paire de pinces fines, en prenant soin de noter le côté du couvercleglissent sur lequel les noyaux ont été filées. Post-fix dans le méthanol froid (stocké à -20 ° C) pendant 5 min à température ambiante.
- Transfert du côté lamelle de noyau vers le haut sur une feuille de film de paraffine en plastique alignant une grande boîte de Pétri en plastique. Placer des lingettes jetables humides le long du côté de la cuvette pour éviter la déshydratation.
- Réhydrater noyaux sur la lamelle avec 500 pi de PBS-NP40 (1x PBS additionné de 0,1% NP40) et aspirez après 5-10 sec.
- couche avec précaution 75 pi de PBS-3% de sérum albumine bovine (BSA) sur la lamelle. Laisser bloquer 1 h à température ambiante ou une nuit à 4 ° C.
- Retirer la solution de blocage et incuber avec l' anticorps primaire (par exemple, mAb414 contre le complexe du pore nucléaire, 1: 1000) dilué dans du PBS-BSA à 3% pendant 1 heure à la température ambiante ou une nuit à 4 ° C. Laver avec cinq changements immédiats de PBS-NP40.
- Incuber avec l'anticorps secondaire dilué dans du PBS-BSA à 3% pendant 1 heure à température ambiante. Laver avec cinq changements immédiats de PBS-NP40.
- Incuberavec 10 pg / ml de Hoechst dilué dans du PBS-BSA à 3% pendant 5 min à température ambiante. Laver à cinq reprises avec du PBS-NP40. Retirez tout excès de tampon.
- Monter la lamelle sur une lame avec 5 pl antifade milieu de montage. Sceller avec du vernis à ongles transparent. Image immédiatement en utilisant un microscope à épifluorescence avec 20 - 100x objectifs ou conserver à 4 ° C pour l'imagerie plus tard.
Remarque: Effectuez la quantification comme décrit précédemment 23.
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Representative Results
Assemblée des Nuclei dans Extrait de Egg
Les premières étapes de ce protocole sont de préparer X. extrait de laevis d'oeuf (Protocole 1) et les noyaux de sperme demembranated (protocole n ° 2). Ces réactifs sont ensuite utilisés pour assembler des noyaux de novo (protocole n ° 3). La figure 1 montre des données représentatives. L'addition de calcium entraîne l'extrait d'oeufs méiose arrêté en interphase et le cycloheximide maintient l'extrait arrêté en interphase. Par 30 - 45 min après le début de la réaction, les initialement minces spermatozoïdes noyaux en forme de S devraient commencer à épaissir en masses de chromatine en forme de lingot. la formation réussie d'une enveloppe nucléaire intacte peut être évaluée par l'importation et à la rétention d'une cargaison d'importation marquée par fluorescence, tels que GST-GFP-NLS (données non représentées) ou par la jante de coloration du complexe du pore nucléaire à l'aide mAb414 qui reconnaît FG-repeat contai(Figure 1A de) ning. Après assemblage nucléaire se produit, la forme nucléaire devrait devenir plus arrondie et le volume nucléaire devrait augmenter à mesure que l'enveloppe nucléaire se développe et les protéines nucléaires sont importés (figure 1B-C). Le non-respect formation d'une enveloppe nucléaire intacte ou la croissance nucléaire indique un mauvais extrait d'oeufs de qualité. Dans ce cas, il est préférable de commencer avec un nouveau lot d'oeufs.
Enlèvement de Endogène Noyaux d'extrait de Embryo
L'étape suivante consiste à préparer un extrait d'embryon de stade tardif (protocole n ° 4). Après la préparation initiale de l'extrait et avant l'enlèvement des noyaux, il est préférable de préparer une courge Hoechst teinté d'une petite aliquote de l'extrait. Visualisation de nombreux petits noyaux embryonnaires est une bonne indication de la réussite dans la préparation de l'extrait (figure 2A). Comme les noyaux embryonnaires endogènes peuvent interférer avec le analysi avals, il est également important de vérifier une aliquote de l'extrait après le retrait des noyaux par dilution et centrifugation. Par rapport au premier squash, très peu de noyaux doivent être laissés dans l'extrait (figure 2B). S'il y a encore de nombreux noyaux présents, un second tour de centrifugation est nécessaire.
Assay Shrinking nucléaire
La figure 3 montre des résultats représentatifs pour l'essai nucléaire rétrécissement (Protocole 5). Noyaux d'extraction d'oeufs remises en suspension dans l' extrait en fin d'embryon au stade deviennent plus petits au fil du temps (figure 3B). Un bon contrôle négatif pour le dosage est d'incuber des noyaux avec extrait d'embryon qui a été inactivé par la chaleur (figure 3A). Comme les noyaux ne parviennent pas à se rétrécir dans l'extrait inactivé par la chaleur, cela donne une certaine confiance que l'on observe nucléaire diminue avec l'extrait d'embryon non traité est pas une conséquence des effets osmotiques. La mesure de la taille nucléaireréductions observées varient en fonction du lot particulier de noyaux d'oeuf extrait ainsi que la qualité de l'extrait d'embryon. Dans notre expérience, la diminution nucléaire est toujours observée (par exemple dans plus de 40 extraits d'embryons différents), mais il est important de répéter ces expériences plusieurs fois avec des noyaux et des extraits pour traiter la variabilité inhérente de l'essai. La figure 4 montre une vue schématique de l'ensemble du protocole.
Figure 1. Temps Course Assemblée nucléaire en X. laevis Egg Extract. Les noyaux ont été assemblés de novo dans X. laevis extrait d'œuf comme décrit dans le protocole n ° 3. Des aliquotes de la même réaction ont été fixées et visualisés par immunofluorescence en utilisant un anticorps dirigé contre le complexe du pore nucléaire (NPC) (mAb414) chez:
Figure 2. Retrait de Noyaux de X. laevis Extrait de Embryo. X. laevis extrait d'embryon a été préparé à partir de l' étape 11.5 - 12 embryons comme décrit dans le protocole n ° 4. Une petite aliquote de l' extrait a été fixées et colorées avec Hoechst: A) avant l'enlèvement des noyaux, et B) après élimination des noyaux par centrifugation. La barre d'échelle est de 25 um.om / files / ftp_upload / 54173 / 54173fig2large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Données représentant de l'Assay Shrinking nucléaire. Les noyaux ont été assemblés de novo dans X. extrait laevis d'oeuf additionné de GFP-LB3 recombinant (pour visualiser la lamina nucléaire). Comme décrit dans le protocole n ° 5, œufs noyaux d'extraits ont été isolés et remises en suspension dans l'étape de 11,5 à 12 extrait d'embryon à partir de laquelle les noyaux embryonnaires endogènes avaient été enlevés. Direct imagerie time-lapse a été effectuée à intervalles de 30 s pendant 90 min. Panneaux Figure montrent des images acquises à des intervalles de 6 min pour les noyaux incubés dans: A) extrait d'embryon de stade tardif (LEE), et B) inactivé par la chaleur (HI) extrait d'embryon. Images des cours à temps procéderde gauche à droite. La barre d'échelle est de 25 um. C) nucléaires rétrécissement des données provenant de 46 extraits d'œufs et d' embryons différents. Les barres indiquent les moyens de> 240 noyaux. Les barres d'erreur sont l' écart type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Schéma du nucléaire Shrinking Assay. Chaque boîte de couleur représente un protocole. Le rouge indique la préparation de X. extrait laevis oeuf (Protocole 1). Bleu indique la préparation de X. demembranated laevis sperme (protocole n ° 2). Rose indique de novo assemblage nucléaire dans l' extrait d'oeuf (protocole n ° 3). Le vert indique la préparation de X. laevis extrait d'embryon (protocole n ° 4). Violet indique les s nucléaireshrinking protocole d'essai et immunofluorescence (protocole n ° 5). Des portions de ce chiffre ont été réutilisés de 23. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| nom Buffer | composition tampon |
| Modifié Ringers de Marc (MMR), 1 / 3x | 33 mM de NaCl, 0,7 mM de KCl, 0,3 mM MgSO4, 0,7 mM CaCl2, 1,7 mM de HEPES, pH 7,4 |
| tampon d'extraction (XB), 10x | 1 M de KCl, 1 mM de CaCl2, 10 mM de MgCl2, 500 mM de saccharose, 100 mM de HEPES, pH 7,8 (pH ajusté avec du KOH 10 N, stocké à 4 ° C) |
| Buffer B | 4% cystéine dissous dans 0,8x XB (préparé avec ddH froid 2 O, pH undjusted à 7,8 avec NaOH 10 N), |
| tampon C | Mélanger 100 m de 10x XB avec 900 ml de ddH froid 2 O |
| tampon D | Tampon C plus 5 mM d' EGTA et 800 uM de MgCl2 |
| LPC stock 1,000x | 10 mg / ml chacun de leupeptine, pepstatine, et chymostatine dissous dans du DMSO (stocké en aliquotes à -20 ° C) |
| du tampon E | 100 ml de tampon D plus 100 pi LPC stocks |
| Mix énergétique, 50x | 190 mM de créatine phosphate disodique, de l'ATP 25 mM de sel disodique, chlorure de magnésium 25 mM |
| Buffer T | 15 mM de PIPES, 15 mM de NaCl, 5 mM d' EDTA, 7 mM de MgCl2, 80 mM de KCl, 0,2 M de saccharose, pH 7,4 (Stériliser par filtration et stocké à 4 ° C) |
| Buffer S | 20 mM de maltose et 0,05% lysolécithine préparée dans le tampon T |
| Buffer R | Buffer T plus 3% bovinel'albumine sérique |
| Calcium solution mère, 20x | 10 mM de CaCl2, 0,1 M de KCl, 1 mM de MgCl2 (stocké à -20 ° C) |
| fix Nucleus | 125 ul de 2 M de saccharose, 12,5 pi de 1 M de HEPES pH 7,9, 250 ul de formaldehyde à 37%, 112 ul ddH 2 O, 0,5 ul de 10 mg / ml de Hoechst (stocké à la température ambiante pendant jusqu'à deux semaines) |
| Modifié Saline de Barth (de MBS), 10x | 880 mM de NaCl, 10 mM de KCl, 50 mM de HEPES, 25 mM NaHCO3, pH 7,8 |
| Haute MBS Sel | 1x MBS ainsi que 0,7 mM de CaCl2 et 20 mM de NaCl |
| tampon de lyse Egg, ELB | 250 mM de saccharose, 50 mM de KCl, 2,5 mM de MgCl2, 10 mM de HEPES, à pH 7,8 |
| un tampon coussin nucléaire | 1x XB, 0,2 M de saccharose, 25% de glycerol (stérilisé par filtration et stocké à 4 ° C) |
Tableau 1. Tampons. Les compositions de tous les tampons mentionnés dans ce protocole sont décrits dans ce tableau.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150 x 75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst - bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG - Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| Na2HPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
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