Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
कोशिका जीव विज्ञान में एक मौलिक सवाल यह है कि सेल और organelle आकार विनियमित रहे है। यह लंबे समय से मान्यता दी गई है कि नाभिक के आकार आम तौर पर विशेष रूप से embryogenesis दौरान, सेल के आकार के साथ तराजू जब दोनों सेल में नाटकीय कमी और परमाणु आकार घटित हो गया है। परमाणु आकार विनियमन के तंत्र काफी हद तक अनजान रहे हैं और कैंसर के लिए प्रासंगिक हो सकता है, जहां बदल परमाणु आकार एक प्रमुख नैदानिक और शकुन पैरामीटर है। विवो में परमाणु आकार नियामकों की पहचान करने के लिए दृष्टिकोण परमाणु समारोह के आवश्यक और जटिल प्रकृति से जटिल कर रहे हैं। इन विट्रो दृष्टिकोण यहाँ वर्णित परमाणु आकार नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए परमाणु के आकार में सामान्य कटौती है कि Xenopus laevis विकास के दौरान होने का फायदा उठाते हैं। सबसे पहले, नाभिक एक्स में इकट्ठा कर रहे हैं अंडा निकालने laevis। फिर, इन नाभिक अलग-थलग और देर चरण भ्रूण से कोशिका द्रव्य में resuspended हैं। 90 मिनट ऊष्मायन अवधि, परमाणु सतह क्षेत्र – एक 30 के बाद60% देर चरण भ्रूण कि विकासात्मक परमाणु आकार स्केलिंग के लिए योगदान में मौजूद cytoplasmic घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी परख प्रदान – 20 से कम हो जाती है। इस दृष्टिकोण का एक प्रमुख लाभ रिश्तेदार की सुविधा के साथ जो अंडे और भ्रूण के अर्क biochemically चालाकी से किया जा सकता है, उपन्यास प्रोटीन और गतिविधियों है कि परमाणु के आकार को विनियमित की पहचान के लिए अनुमति है। इन विट्रो दृष्टिकोण में किसी के साथ के रूप में, एक विवो प्रणाली में परिणाम के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण है, और एक्स के microinjection laevis भ्रूण इन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है।
सेलुलर अंगों का आकार आमतौर पर सेल के आकार के साथ पैमाने पर, और यह शायद सबसे अच्छा सेल आकार 1-10 के साथ परमाणु आकार की स्केलिंग के लिए दर्ज किया गया है। इस embryogenesis और सेल भेदभाव, जब दोनों सेल और परमाणु के आकार में नाटकीय कमी अक्सर 11,12 मनाया जाता है के दौरान विशेष रूप से सच है। इसके अलावा, बदल परमाणु आकार कैंसर निदान और रोग का निदान 13-17 में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है। तंत्र है कि परमाणु आकार नियमन में योगदान जटिलता और परमाणु संरचना और समारोह के आवश्यक प्रकृति के कारण काफी हद तक अनजान, हिस्से में हैं। विधि यहाँ वर्णित परमाणु आकार स्केलिंग के लिए इन विट्रो परख है कि जैव रासायनिक हेरफेर और परमाणु आकार विनियमन के तंत्र की व्याख्या करने के लिए उत्तरदायी है के रूप में विकसित किया गया था।
Xenopus laevis अंडे निकालने के एक अच्छी तरह से स्थापित पुनरावृत्ति और इन विट्रो में जटिल सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए प्रणाली है </em> संदर्भ। इन निष्कर्षों विधानसभा और mitotic धुरा, जालिका के समारोह, और नाभिक 18-22 सहित कई सेलुलर प्रक्रियाओं के बारे में नई मौलिक जानकारी से पता चला है। निकालने व्यवस्था करने के लिए एक प्रमुख लाभ यह है कि एक्स है laevis अंडे अर्क एक लगभग undiluted कोशिका द्रव्य रचना जिसका आसानी से पुनः संयोजक प्रोटीन या immunodepletion के अलावा के माध्यम से उदाहरण के लिए, बदला जा सकता है प्रतिनिधित्व करते हैं। इसके अलावा, एक उपचार है कि अन्यथा एक विवो संदर्भ में घातक हो सकता है रोजगार से आवश्यक प्रक्रियाओं में हेरफेर करने में सक्षम है। अंडा निकालने प्रक्रिया का संशोधन एक्स से अर्क के अलगाव के लिए अनुमति देते हैं laevis भ्रूण के बजाय अंडे, और इन भ्रूण अर्क समान रूप से जैव रासायनिक हेरफेर 23 के लिए उत्तरदायी हैं। एक्स के दौरान विकास laevis, एकल कोशिका निषेचित भ्रूण (~ 1 मिमी व्यास) बारह तेजी से कोशिका विभाजन की एक श्रृंखला आए (चरणों 1 – 8) उत्पन्न करने के लिए कई हजार 50 μमीटर व्यास और छोटे कोशिकाओं, एक विकास मंच तक पहुँचने midblastula संक्रमण (एमबीटी) या 8 स्टेज 24-26 करार दिया। एमबीटी युग्मज ट्रांसक्रिप्शन, सेल प्रवास, अतुल्यकालिक कोशिका विभाजन, अंतर चरणों के अधिग्रहण, और पूर्व एमबीटी भ्रूण के रूप में नित्य परमाणु विस्तार परमाणु स्थिर राज्य आकारों के बजाय की स्थापना की शुरुआत की विशेषता है। Gastrulation करने के लिए मंच 4 से (10.5 चरणों – 12), व्यक्तिगत नाभिक की मात्रा अधिक से अधिक 10 गुना 11 से कम हो जाती है।
इधर, लक्ष्य विकास प्रगति के दौरान परमाणु आकार में इन कटौती के लिए जिम्मेदार तंत्र की पहचान है। दृष्टिकोण पहले एक्स में नाभिक को इकट्ठा करने के लिए है अंडा निकालने laevis और अंडे कोशिका द्रव्य / निकालने से उन लोगों के नाभिक को अलग-थलग करने के लिए। इन नाभिक फिर देर गेसट्रुला चरण भ्रूण से कोशिका द्रव्य में resuspended हैं। एक ऊष्मायन अवधि के बाद, अंडा निकालने से नाभिक देर चरण भ्रूण निकालने में छोटे हो जाते हैं। हम तर्क यह है कि woulदेर चरण भ्रूण कि विकासात्मक परमाणु आकार स्केलिंग के लिए योगदान में मौजूद cytoplasmic घटकों की पहचान करने के लिए एक उपयोगी परख होगी। इस परख, विवो सत्यापन के साथ मिलकर प्रयोग, हम दिखा दिया है कि प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) एक्स में परमाणु के आकार में कटौती विकास के लिए योगदान 23 laevis।
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
The authors have nothing to disclose.
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
Glycerol | Macron | 5094-16 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
mAb414 | Abcam | ab24609 | |
MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
NP40 | BDH | 56009 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
KOH | Baker | 5 3140 | |
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
NaOH | EMD | SX0590 | |
Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
sucrose | Calbiochem | 8550 | |
thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |