A Cell-Free Assay hjelp<em> Xenopus laevis</em> Embryo Ekstrakter å studere mekanismer for Nuclear Size forordning
Summary
Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Abstract
Et grunnleggende spørsmål i cellebiologi er hvordan celler og organelle størrelser er regulert. Det har lenge vært kjent at størrelsen av kjernen som regel øker med størrelsen av cellen, særlig i løpet av embryogenesen når dramatiske reduksjoner i både cellen og atomstørrelser forekommer. Mekanismer av kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent og kan være relevant for kreft der endrede kjernefysisk størrelse er en viktig diagnostisk og prognostisk parameter. In vivo tilnærminger til å identifisere kjernefysiske størrelse regulatorer kompliseres av den essensielle og komplekse natur av kjernefysisk funksjon. Den in vitro-metode som er beskrevet her for å studere kjernefysisk størrelse kontroll dro fordel av de normale reduksjon av kjernestørrelse som forekommer i løpet av Xenopus laevis utvikling. For det første er kjerner montert i X. laevis egg ekstrakt. Deretter blir disse kjerner isoleres og resuspendert i cytoplasma fra sent stadium embryoer. Etter en 30-90 minutters inkubasjonsperiode, kjerneoverflatearealreduseres med 20 – 60%, noe som gir en nyttig analyse for å identifisere cytoplasmiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. En stor fordel med denne løsning er den relative innretningen med hvilken egg og embryoekstrakter kan biokjemisk manipuleres, slik at for identifisering av nye proteiner og aktiviteter som regulerer kjernefysisk størrelse. Som med en hvilken som helst in vitro-metode, er validering av resultatet i et in vivo system viktig, og mikroinjeksjon av X. laevis embryoer er spesielt egnet for disse studiene.
Introduction
Størrelsene på cellulære organ typisk skaleres med størrelsen av cellen, og dette har blitt kanskje best dokumentert for skalering av kjernefysisk størrelse med cellestørrelse 1-10. Dette er spesielt sant i løpet av embryogenesen og celledifferensiering, når dramatiske reduksjoner i både celle- og kjernefysisk størrelse er ofte observert 11,12. Videre er endret atom størrelse en viktig parameter i kreft diagnose og prognose 13-17. Mekanismer som bidrar til kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent, delvis på grunn av kompleksiteten og essensielle natur av kjernefysisk struktur og funksjon. Metoden som beskrives her ble utviklet som en in vitro-analyse for kjernefysisk størrelse skalering som er mottagelig for biokjemisk manipulering og belysning av mekanismer for kjernefysisk størrelse regulering.
Xenopus laevis egg ekstrakt er et veletablert system for å rekapitulere og studere komplekse cellulære prosesser i en in vitro </em> Sammenheng. Disse ekstraktene har avslørt ny fundamental informasjon om flere cellulære prosesser, inkludert montering og funksjon av den mitotisk spindel, endoplasmatiske retikulum, og kjernen 18-22. En viktig fordel for å ekstraktet systemet er at X. laevis egg ekstrakter representerer en nesten ufortynnet cytoplasma hvis sammensetning kan enkelt endres, for eksempel ved tilsetning av rekombinante proteiner eller immunodepletion. Videre er man i stand til å manipulere avgjørende prosesser ved anvendelse av behandlinger som ellers ville være dødelig i en in vivo sammenheng. Modifikasjoner av egg ekstrakt prosedyren tillater isolering av utdrag fra X. laevis embryoer i stedet for egg og disse embryo ekstrakter er like mottagelig for biokjemisk manipulering 23. Under X. laevis utvikling, encellede befruktet embryo (~ 1 mm diameter) gjennomgår en serie på tolv raske celledelinger (trinn 1-8) for å generere flere tusen 50 μm diameter og mindre celler, og nådde et utviklingsstadium kalt midblastula overgang (MBT) eller scene 24 til 26 august. MBT er preget av utbruddet av zygotiske transkripsjon, cellemigrasjon, asynkrone celledelinger, oppkjøp av gap faser, og etablering av kjernefysiske steady-state størrelser i stedet for kontinuerlig kjernefysiske ekspansjon som i pre-MBT embryo. Fra trinn 4 for å gastrulation (stadier 10,5 til 12), volumet av de enkelte kjerner reduseres med mer enn 10 ganger 11.
Her er målet å identifisere mekanismene som er ansvarlig for disse reduksjonene i kjernefysisk størrelse i løpet av utviklings progresjon. Tilnærmingen er å først montere kjerner i X. laevis egg ekstrakt og å isolere disse kjerner fra egg cytoplasma / avtrekk. Disse kjerner blir deretter resuspendert i cytoplasma fra sent gastrulastadiet embryoer. Etter en inkubasjonsperiode, kjernene fra egg ekstrakt blir mindre i sent stadium embryo ekstrakt. Vi tenkte at dette noen kilo for tungd være en nyttig analyse for identifisering av cytoplasmatiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. Ved hjelp av denne analysen, sammen med in vivo validering, demonstrerte vi at protein kinase C (PKC) bidrar til utviklingsmessige reduksjon av kjernestørrelse i X. laevis 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Materials
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
