Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Et grunnleggende spørsmål i cellebiologi er hvordan celler og organelle størrelser er regulert. Det har lenge vært kjent at størrelsen av kjernen som regel øker med størrelsen av cellen, særlig i løpet av embryogenesen når dramatiske reduksjoner i både cellen og atomstørrelser forekommer. Mekanismer av kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent og kan være relevant for kreft der endrede kjernefysisk størrelse er en viktig diagnostisk og prognostisk parameter. In vivo tilnærminger til å identifisere kjernefysiske størrelse regulatorer kompliseres av den essensielle og komplekse natur av kjernefysisk funksjon. Den in vitro-metode som er beskrevet her for å studere kjernefysisk størrelse kontroll dro fordel av de normale reduksjon av kjernestørrelse som forekommer i løpet av Xenopus laevis utvikling. For det første er kjerner montert i X. laevis egg ekstrakt. Deretter blir disse kjerner isoleres og resuspendert i cytoplasma fra sent stadium embryoer. Etter en 30-90 minutters inkubasjonsperiode, kjerneoverflatearealreduseres med 20 – 60%, noe som gir en nyttig analyse for å identifisere cytoplasmiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. En stor fordel med denne løsning er den relative innretningen med hvilken egg og embryoekstrakter kan biokjemisk manipuleres, slik at for identifisering av nye proteiner og aktiviteter som regulerer kjernefysisk størrelse. Som med en hvilken som helst in vitro-metode, er validering av resultatet i et in vivo system viktig, og mikroinjeksjon av X. laevis embryoer er spesielt egnet for disse studiene.
Størrelsene på cellulære organ typisk skaleres med størrelsen av cellen, og dette har blitt kanskje best dokumentert for skalering av kjernefysisk størrelse med cellestørrelse 1-10. Dette er spesielt sant i løpet av embryogenesen og celledifferensiering, når dramatiske reduksjoner i både celle- og kjernefysisk størrelse er ofte observert 11,12. Videre er endret atom størrelse en viktig parameter i kreft diagnose og prognose 13-17. Mekanismer som bidrar til kjernefysisk størrelse regulering er i stor grad ukjent, delvis på grunn av kompleksiteten og essensielle natur av kjernefysisk struktur og funksjon. Metoden som beskrives her ble utviklet som en in vitro-analyse for kjernefysisk størrelse skalering som er mottagelig for biokjemisk manipulering og belysning av mekanismer for kjernefysisk størrelse regulering.
Xenopus laevis egg ekstrakt er et veletablert system for å rekapitulere og studere komplekse cellulære prosesser i en in vitro </em> Sammenheng. Disse ekstraktene har avslørt ny fundamental informasjon om flere cellulære prosesser, inkludert montering og funksjon av den mitotisk spindel, endoplasmatiske retikulum, og kjernen 18-22. En viktig fordel for å ekstraktet systemet er at X. laevis egg ekstrakter representerer en nesten ufortynnet cytoplasma hvis sammensetning kan enkelt endres, for eksempel ved tilsetning av rekombinante proteiner eller immunodepletion. Videre er man i stand til å manipulere avgjørende prosesser ved anvendelse av behandlinger som ellers ville være dødelig i en in vivo sammenheng. Modifikasjoner av egg ekstrakt prosedyren tillater isolering av utdrag fra X. laevis embryoer i stedet for egg og disse embryo ekstrakter er like mottagelig for biokjemisk manipulering 23. Under X. laevis utvikling, encellede befruktet embryo (~ 1 mm diameter) gjennomgår en serie på tolv raske celledelinger (trinn 1-8) for å generere flere tusen 50 μm diameter og mindre celler, og nådde et utviklingsstadium kalt midblastula overgang (MBT) eller scene 24 til 26 august. MBT er preget av utbruddet av zygotiske transkripsjon, cellemigrasjon, asynkrone celledelinger, oppkjøp av gap faser, og etablering av kjernefysiske steady-state størrelser i stedet for kontinuerlig kjernefysiske ekspansjon som i pre-MBT embryo. Fra trinn 4 for å gastrulation (stadier 10,5 til 12), volumet av de enkelte kjerner reduseres med mer enn 10 ganger 11.
Her er målet å identifisere mekanismene som er ansvarlig for disse reduksjonene i kjernefysisk størrelse i løpet av utviklings progresjon. Tilnærmingen er å først montere kjerner i X. laevis egg ekstrakt og å isolere disse kjerner fra egg cytoplasma / avtrekk. Disse kjerner blir deretter resuspendert i cytoplasma fra sent gastrulastadiet embryoer. Etter en inkubasjonsperiode, kjernene fra egg ekstrakt blir mindre i sent stadium embryo ekstrakt. Vi tenkte at dette noen kilo for tungd være en nyttig analyse for identifisering av cytoplasmatiske komponenter som er tilstede i sent stadium embryoer som bidrar til utviklingskjernefysisk størrelse skalering. Ved hjelp av denne analysen, sammen med in vivo validering, demonstrerte vi at protein kinase C (PKC) bidrar til utviklingsmessige reduksjon av kjernestørrelse i X. laevis 23.
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
The authors have nothing to disclose.
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
Glycerol | Macron | 5094-16 | |
HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
mAb414 | Abcam | ab24609 | |
MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
NP40 | BDH | 56009 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
KOH | Baker | 5 3140 | |
PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
NaOH | EMD | SX0590 | |
Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
sucrose | Calbiochem | 8550 | |
thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |