Бесклеточной Анализ с помощью<em> Xenopus Laevis</em> Эмбрион Экстракты для изучения механизмов регулирования ядерной Размер
Summary
Mechanisms of cellular and intra-cellular scaling remain elusive. The use of Xenopus embryo extracts has become increasingly common to elucidate mechanisms of organelle size regulation. This method describes embryo extract preparation and a novel nuclear scaling assay through which mechanisms of nuclear size regulation can be identified.
Abstract
Фундаментальный вопрос в клеточной биологии, как клеточные и органелл размеры регулируются. Давно признано, что размер ядра в целом шкалы с размером ячейки, в частности, в процессе эмбриогенеза, когда происходят резкое сокращение в обеих клеточных и ядерных размеров. Механизмы регулирования размеров ядра в значительной степени неизвестны и могут иметь отношение к раку , где измененная размер ядра является ключевым диагностическим и прогностическим параметром. В естественных условиях подходы к идентификации регуляторов размера ядра осложняется существенным и сложным характером ядерной функции. В пробирке подход , описанный здесь , чтобы изучить контроль размеров ядра использует в своих нормальных сокращений ядерного размера , которые происходят во время развития Xenopus Laevis. Во- первых, ядра собраны в X. Laevis экстракт яйца. Затем эти ядра выделяют и ресуспендировали в цитоплазме от поздних эмбрионов стадии. После 30 – 90 мин инкубационного периода, площадь поверхности ядернаяуменьшается на 20 – 60%, обеспечивая полезный анализ для выявления цитоплазматических компонентов, присутствующих в поздних эмбрионов стадии, которые способствуют развития масштабированием размеров ядра. Основным преимуществом такого подхода является относительная легкость, с которой яйцо и эмбрион экстракты могут быть биохимически манипулировать, что позволяет для идентификации новых белков и деятельности, которые регулируют размер ядра. Как и при любом экстракорпоральное подходе, проверка достоверности результатов в системе в естественных условиях имеет важное значение, и микроинъекции X. Laevis эмбрионов особенно подходит для этих исследований.
Introduction
Размеры клеточных органелл обычно масштабироваться с размером ячейки, и это было возможно , лучше всего документирован для масштабирования размера ядра с размером ячейки 1-10. Это особенно верно в процессе эмбриогенеза и дифференцировки клеток, когда резкое сокращение как клетки и размера ядра часто наблюдаются 11,12. Кроме того, изменен размер ядра является ключевым параметром в диагностике рака и прогнозирования 13-17. Механизмы, которые способствуют регулированию размеров ядра в значительной степени неизвестны, отчасти из-за сложности и существенного характера ядерной структуры и функции. Описанный здесь метод был разработан как тест в пробирке для масштабирования размера ядра , который поддается биохимическому манипуляции и выяснению механизмов регулирования размеров ядра.
Xenopus Laevis яйцо экстракт является хорошо налаженная система резюмировать и изучать сложные клеточные процессы в в пробирке </em> Контекст. Эти экстракты выявили новую фундаментальную информацию о нескольких клеточных процессов , включая сборку и функцию митотического веретена, эндоплазматической сети и ядра 18-22. Одним из ключевых преимуществ для системы является то , что экстракт X. Laevis яичные экстракты представляют собой почти неразбавленный цитоплазму, состав которого может быть легко изменен, например , путем добавления рекомбинантных белков или immunodepletion. Кроме того, он способен манипулировать основные процессы, используя методы лечения , которые в противном случае могут привести к летальному исходу в естественных условиях в контексте. Модификации процедуры экстракта яйца позволяют для выделения экстрактов из X. Laevis эмбрионов , а не яйца, и эти эмбриональные экстракты одинаково поддаются биохимическому манипуляции 23. Во время X. Laevis развития, одноклеточный оплодотворенной эмбрион (диаметром ~ 1 мм) проходит серию из двенадцати быстрых клеточных делений (этапы 1 – 8) для создания нескольких тысяч 50 μдиаметр м и более мелкие клетки, достигая стадии развития называют переход midblastula (MBT) или стадии 8 24-26. MBT характеризуется наступлением зиготического транскрипции, миграции клеток, асинхронных клеточных делений, приобретение фаз пробелов и создания ядерных стационарных размеров, а не постоянного расширения ядерной отрасли, как в эмбрионе предварительно MBT. От 4 -й стадии до гаструляции (стадии 10.5 – 12), объем отдельных ядер уменьшается более чем в 10 раз 11.
Здесь цель состоит в том, чтобы идентифицировать механизмы, ответственные за эти сокращения размеров ядра в процессе эволюционного развития. Подход должен сначала собрать ядра в X. Laevis экстракт яйца и изолировать эти ядра от цитоплазмы яйца / экстракта. Эти ядра затем ресуспендировали в цитоплазме с поздней гаструлы эмбрионов стадии. После инкубационного периода, ядра из экстракта яйца становятся меньше в конце экстракта стадии эмбриона. Мы рассуждали, что это would быть полезным тест для выявления цитоплазматических компонентов, присутствующих в поздних эмбрионов стадии, которые способствуют развития масштабированием размеров ядра. С помощью этого анализа, в сочетании с проверкой в естественных условиях, мы показали , что протеинкиназа С (ПКС) способствует сокращению развития в области ядерного размера в X. Laevis 23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Here is presented a novel method to study mechanisms of nuclear size regulation during X. laevis development. Developmental progression is associated with dramatic changes in cell physiology, metabolism, division rates, and migration, as well as alterations in the sizes of cells and intracellular structures. These varied processes are complex and essential, so it is difficult to study just one of these aspects of development in an in vivo setting. The X. laevis embryo extract and nuclear shrink…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Members of the Levy and Gatlin labs as well as colleagues in the Department of Molecular Biology offered helpful advice and discussions. Rebecca Heald provided support in the early stages of developing this protocol. This work was supported by the NIH/NIGMS (R15GM106318) and the American Cancer Society (RSG-15-035-01-DDC).
Materials
| Alexa Fluor 568 Donkey anti-mouse IgG | Molecular Probes | A10037 | |
| ATP disodium salt | Sigma Aldrich | A2383 | |
| Benzocaine | Sigma Aldrich | E1501 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C3306 | |
| Centrifuge | Beckman | J2-21M | |
| Centrifuge rotor | Beckman | JS 13.1 | |
| chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| creatine phosphate disodium | Calbiochem | 2380 | |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | C6255 | |
| cytochalasin D | Sigma Aldrich | C8273 | |
| disposable wipes (kimwipes) | Sigma Aldrich | Z188956 | |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | W326306 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Glass crystallizing dish (150×75 mm) | VWR | 89090-662 | |
| Glycerol | Macron | 5094-16 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Hoechst – bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma Aldrich | B2261 | |
| HCG – Human Chorionic Gonadotropin | Prospec | hor-250-c | |
| L15 Media | Sigma Aldrich | L4386 | |
| leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Lysolecithin | Sigma Aldrich | L1381 | |
| mAb414 | Abcam | ab24609 | |
| MgCl2 | EMD | MX0045-2 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M9397 | |
| Maltose | Sigma Aldrich | M5885 | |
| NP40 | BDH | 56009 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicillin + Streptomycin | Sigma Aldrich | Pp0781 | |
| pepstatin | Sigma Aldrich | P5318 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P6757 | |
| Plastic paraffin film (parafilm) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Mallinckrodt | 70100 | |
| KOH | Baker | 5 3140 | |
| PMSG – Pregnant Mare Serum Gonadotropin | Prospec | hor-272-a | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328 | |
| NaHPO4 | EMD | SX0720-1 | |
| NaOH | EMD | SX0590 | |
| Pestle | Thomas Scientific | 3411D56 | |
| Round bottom glass tubes, 15 ml | Corex | 8441 | |
| Secondary antibody (Alexa Fluor 568 donkey anti-mouse IgG) | ThermoFisher | A10037 | |
| sucrose | Calbiochem | 8550 | |
| thermal cycler | Bio-Rad | T100 | |
| Ultracentrifuge | Beckman | L8-80M | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman | SW 50.1 | |
| Vectashield (anti-fade mounting medium) | Vector | H-1000 |
References
- Conklin, E. Cell size and nuclear size. J. Exp. Embryol. 12, 1-98 (1912).
- Wilson, E. B. . The Cell in Development and Heredity. , 727-733 (1925).
- Levy, D. L., Heald, R. Nuclear size is regulated by importin alpha and Ntf2 in Xenopus. Cell. 143 (2), 288-298 (2010).
- Chan, Y. H., Marshall, W. F. Scaling properties of cell and organelle size. Organogenesis. 6 (2), 88-96 (2010).
- Walters, A. D., Bommakanti, A., Cohen-Fix, O. Shaping the nucleus: Factors and forces. J Cell Biochem. 113 (9), 2813-2821 (2012).
- Webster, M., Witkin, K. L., Cohen-Fix, O. Sizing up the nucleus: nuclear shape, size and nuclear-envelope assembly. J Cell Sci. 122 (Pt 10), 1477-1486 (2009).
- Edens, L. J., White, K. H., Jevtic, P., Li, X., Levy, D. L. Nuclear size regulation: from single cells to development and disease. Trends Cell Biol. 23 (4), 151-159 (2013).
- Jevtic, P., Edens, L. J., Vukovic, L. D., Levy, D. L. Sizing and shaping the nucleus: mechanisms and significance. Curr Opin Cell Biol. 28, 16-27 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Mechanisms of intracellular scaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 113-135 (2012).
- Vukovic, L. D., Jevtic, P., Edens, L. J., Levy, D. L. New insights into the mechanisms and functions of nuclear size regulation. Int Rev Cell Mol Biol. 322, 1-59 (2016).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Nuclear size scaling during Xenopus early development contributes to midblastula transition timing. Curr Biol. 25 (1), 45-52 (2015).
- Hara, Y., Iwabuchi, M., Ohsumi, K., Kimura, A. Intranuclear DNA density affects chromosome condensation in metazoans. Mol Biol Cell. 24 (15), 2442-2453 (2013).
- Zink, D., Fischer, A. H., Nickerson, J. A. Nuclear structure in cancer cells. Nat Rev Cancer. 4 (9), 677-687 (2004).
- Jevtic, P., Levy, D. L. Mechanisms of nuclear size regulation in model systems and cancer. Adv Exp Med Biol. 773, 537-569 (2014).
- Chow, K. H., Factor, R. E., Ullman, K. S. The nuclear envelope environment and its cancer connections. Nat Rev Cancer. 12 (3), 196-209 (2012).
- Blom, J. H., Ten Kate, F. J., Schroeder, F. H., van der Heul, R. O. Morphometrically estimated variation in nuclear size. A useful tool in grading prostatic cancer. Urol Res. 18 (2), 93-99 (1990).
- Dey, P. Cancer nucleus: morphology and beyond. Diagn Cytopathol. 38 (5), 382-390 (2010).
- Cross, M. K., Powers, M. A. Learning about cancer from frogs: analysis of mitotic spindles in Xenopus egg extracts. Dis Model Mech. 2 (11-12), 541-547 (2009).
- Voeltz, G. K., Prinz, W. A., Shibata, Y., Rist, J. M., Rapoport, T. A. A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum. Cell. 124 (3), 573-586 (2006).
- Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
- Edens, L. J., Levy, D. L., Kloc, M., Kubiak, J. Z. . Xenopus Development. , 325-345 (2014).
- Levy, D. L., Heald, R. Biological Scaling Problems and Solutions in Amphibians. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (1), a019166 (2016).
- Edens, L. J., Levy, D. L. cPKC regulates interphase nuclear size during Xenopus development. J Cell Biol. 206 (4), 473-483 (2014).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. . Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1967).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: II. Control of the onset of transcription. Cell. 30 (3), 687-696 (1982).
- Newport, J., Kirschner, M. A major developmental transition in early Xenopus embryos: I. characterization and timing of cellular changes at the midblastula stage. Cell. 30 (3), 675-686 (1982).
- Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
- Hannak, E., Heald, R. Investigating mitotic spindle assembly and function in vitro using Xenopus laevis egg extracts. Nat Protoc. 1 (5), 2305-2314 (2006).
- Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods Cell Biol. 36, 581-605 (1991).
- Khan, M. A., et al. Quantitative alterations in nuclear structure predict prostate carcinoma distant metastasis and death in men with biochemical recurrence after radical prostatectomy. Cancer. 98 (12), 2583-2591 (2003).
- Tan, P. H., Goh, B. B., Chiang, G., Bay, B. H. Correlation of nuclear morphometry with pathologic parameters in ductal carcinoma in situ of the breast. Mod Pathol. 14 (10), 937-941 (2001).
- Zeimet, A. G., et al. DNA ploidy, nuclear size, proliferation index and DNA-hypomethylation in ovarian cancer. Gynecol Oncol. 121 (1), 24-31 (2011).
- Theerthagiri, G., Eisenhardt, N., Schwarz, H., Antonin, W. The nucleoporin Nup188 controls passage of membrane proteins across the nuclear pore complex. J Cell Biol. 189 (7), 1129-1142 (2010).
- Wuhr, M., et al. Evidence for an upper limit to mitotic spindle length. Curr Biol. 18 (16), 1256-1261 (2008).
- Loughlin, R., Wilbur, J. D., McNally, F. J., Nedelec, F. J., Heald, R. Katanin contributes to interspecies spindle length scaling in Xenopus. Cell. 147 (6), 1397-1407 (2011).
- Wilbur, J. D., Heald, R. Mitotic spindle scaling during Xenopus development by kif2a and importin. eLife. 2, e00290 (2013).
- Kieserman, E. K., Heald, R. Mitotic chromosome size scaling in Xenopus. Cell Cycle. 10 (22), 3863-3870 (2011).
- Maresca, T. J., Freedman, B. S., Heald, R. Histone H1 is essential for mitotic chromosome architecture and segregation in Xenopus laevis egg extracts. J Cell Biol. 169 (6), 859-869 (2005).
- MacCallum, D. E., Losada, A., Kobayashi, R., Hirano, T. ISWI remodeling complexes in Xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by INCENP-aurora B. Mol Biol Cell. 13 (1), 25-39 (2002).
- Goehring, N. W., Hyman, A. A. Organelle growth control through limiting pools of cytoplasmic components. Curr Biol. 22 (9), R330-R339 (2012).
- Du Toit, A. Development: Honey, I shrunk the nucleus. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 633 (2014).
- Buchner, K. The role of protein kinase C in the regulation of cell growth and in signalling to the cell nucleus. J Cancer Res Clin Oncol. 126 (1), 1-11 (2000).
- Mochly-Rosen, D., Das, K., Grimes, K. V. Protein kinase C, an elusive therapeutic target. Nat Rev Drug Discov. 11 (12), 937-957 (2012).
